Aislamiento, Purificacin, y los Rasgos

Estructurales de un Polisacrido de
Phellinus linteus y Su Efecto
Hipoglucmico en Ratones Diabticos
Inducidos por Aloxano
Chao Zhao, Zunsheng Liao, Xiaoqi Wu, Yanling Liu, Xiaoyan Liu, Zhanxi Lin, Yifan Huang, y Bin Liu
Resumen: Phellinus linteus es una seta medicinal que ha sido usada en pases Orientales durante siglos para su anti-tumor,
antioxidante, immunomodulador, y la actividad biolgica sobre hiperglucemia. Un polisacrido soluble en agua ordinario fue
extrado usando el agua caliente de micelio de P. linteus cultivado bajo la cultura sumergida. Un experimento ortogonal fue usado
optimizar las condiciones de extraccin de micelio P. linteus polisacridos (PLP). El polisacrido ordinario fue purificado usando
DEAE Sephadex A-50 y la Sephadex G-200 cromatografa. Fourier transforman infrarrojo (FT-IR) la espectroscopia y la
resonancia magntica nuclear (1H NMR) la espectroscopia fue usada para investigar la estructura del polisacrido P. linteus
purificado (PLP-I), revelando que esto era principalmente un bifurcado tipo glicano con ambos enlaces y y una conformacin
piranoidal de anillo de azcar. PLP oralmente administrado en 100 mg/kg de peso corporal/d considerablemente podra reducir el
nivel de glucosa de sangre por 35.60 % en ratones diabticos inducidos por aloxano. Los resultados de una prueba oral de
tolerancia de glucosa (OGTT) revelaron que PLP tena un efecto sobre la disposicin de glucosa despus de 28 d de tratamiento. El
resultado revel que PLP de una cultura sumergida de micelio de P. linteus posey propiedades potentes hipoglucmicas. El
polisacrido puede ser til como un aditivo alimenticio funcional y un agente hipoglucmico.
Palabras clave: propiedades qumicas, hipoglucmico, fermentacin de micelio, Phellinus linteus, polisacrido

Introduccin

H: Health,
Nutrition &

Durante siglos, los hongos han sido valoradas como recursos

de alimentos y medicinales y usadas en la medicina tradicional
Oriental para prevenir y curar varias enfermedades (Chang
1996; Ulziijargal y otros 2013). Los hongos han probado ser el
alimento ideal para la prevencin diabtica de hiperglucemia
debido a su alta fibra y el contenido de protena y su contenido
bajo en grasas (Yuan y otros 1998; Sonawane y otros 2013).
Los polisacridos son polmeros comunes en hongos y han
recibido la atencin considerable en los ltimos aos debido a
sus actividades hipoglucmicas.
Phellinus linteus (Berk. y Curt. M.A.) Teng (PL), que
pertenece a la familia de Hymenochaetaceae, es usado como
medicina herbaria as como un aditivo alimenticio tradicional
en Amrica tropical, frica, y Asia de Este (en particular,
China, Japn, y Corea) (Zhu y otros 2008; Sliva 2010).
Estudios recientes sobre esta seta han revelado muchas
actividades biolgicas interesantes (Hsieh y otros 2013). Los
frutos de los cuerpos de PL recientemente como se ha
reportado, contenan varios compuestos de bioactivos y
exponen numerosas actividades biolgicas, incluyendo el
antitumor (Bae y otros 2011), antioxidante (Song y otros 2003),
antiinflamatorio (Kim y otros 2007), antiangiognica (Lee y
otros 2010), antibacteriano (Hur y otros 2004), antimutagnesis
(Kimura y otros 1995), antidiabtico (Kim y otros 2010), y
efectos de antihepatotoxina (Kim y otros 2004).
SRA. 20131491 Enviado 10/19/2013, Aceptado 2/8/2014. Autores
Zhao, Liao, Wu, X. Liu, Huang, y B. Liu son con el Colegio de Ciencia
De alimentos, Fujian la Agricultura y la Silvicultura Univ., Fuzhou,
Fujian 350002, China. Autores Zhao, Y. Liu, Lin, Huang, y B. Liu son
con Natl. Tramando Centro de investigacin de Juncao, Fuzhou,
Fujian 350002, China. El autor Huang es tambin con el Colegio de
Ciencia De animal, Fujian la Agricultura y la Silvicultura Univ.,
Fuzhou, Fujian 350002, China. Autores Y. Liu y Lin son tambin con el
Colegio de Ciencia de Vida, Fujian la Agricultura y la Silvicultura
Univ., Fuzhou, Fujian 350002, China. Preguntas directas a autores B.
Liu (Correo electrnico: Binliu618@163.com) y Y. Huang (Correo
electrnico: zjhyfang@163.com).

Varios compuestos aromticos tambin han sido aislados de

micelio de PL cultivado, incluyendo sesquiterpeno (Huang y
otros 2013), phellinstatin (Cho y otros 2011), polifenol (Jung y
otros 2008), hispoln (Chen y otros 2006), hispidina (Jang y
otros 2010), e inotilone (Huang y otros 2012). En una tentativa
de integrar PL en terapias Occidentales aceptadas, muchos
investigadores han investigado los efectos de los extractos de
los cuerpos frutales o micelio de PL en actividades in vitro e in
vivo. PL ha atrado una atencin sustancial debido a su efecto
de antitumor y otros valores medicinales (Zhu y otros 2008;
Sliva 2010). En la dcada pasada, PL ha sido investigado
extensivamente para su capacidad extraordinaria para suprimir
el cncer o realzar la inmunidad del cuerpo, que hizo del PL un
candidato por desarrollar compuestos de anticncer nuevos de
recursos naturales. El inters creciente en PL era tambin
debido a su capacidad de potenciar la eficacia de anticncer
existente medicinas quimioteraputicas. Sin embargo, la mayor
parte de la investigacin est enfocado en proteoglicanos (PGs)
aislados de PL (Kim y otros 2003). Aunque algunas setas
comestibles, como se haya relatado, mostraban un efecto
hipoglucmico sobre ratas diabticas o ratones (Cho y otros
2002), la actividad hipoglucmica de micelio de PL raras veces
era investigado.
Como el PL es muy raro en la naturaleza, la cantidad de setas
salvajes disponible no es suficiente para la explotacin
comercial (Hong-Kong y otros 2002). Para establecer un
procedimiento simple y econmico para producir este
polisacrido de seta con la produccin ms alta, los
experimentos de un solo factor (la proporcin de micelio para
agua, extrayendo la temperatura, extrayendo el tiempo, y la
concentracin final de etanol) y experimentos ortogonales
fueron conducidos para optimizar las condiciones de
produccin de polisacridos de micelio de PL (PLP). Por lo
tanto, en este papel, las condiciones extradas fueron
optimizadas para la produccin de polisacridos de PL, y una
investigacin detallada fue realizada para examinar las
actividades antidiabticas de los polisacridos de micelio
producidos de la cultura sumergida de PL en ratones diabticos
inducidos por aloxano.

2014 Institute of Food Technologists

doi: 10.1111/1750-3841.12464

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Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

H1002 Journal of Food Science Vol. 79, Nr. 5, 2014

Tensin y produccin de micelio

El cultivo de P. linteus fue obtenida del Centro de
Investigacin Fungal de Fujian Agricultura y la Univ. Forestal
(Fuzhou, China). El cultivo de siembra fue cultivada en un
frasco de 250 mL que contiene 100 mL de caldo de dextrosa de
patatas (pH 6.0) e incubada sobre una agitador rotatoria (150
rpm) a 25 C por aproximadamente 4 d. Una muestra del medio
con sedimentos miceliales (100 mL) fue homogeneizada
aspticamente en un omni-mezclador Sorvall durante 3 min en
un bao de hielo e inoculada en los medios lquidos a una
concentracin del 2 % (v/v) para la cultivacin sumergida. El P.
linteus completa el medio (PCM) fue usado para realizar un
cultivo sumergido para la produccin de micelio. La
composicin del PCM es as (g/L): harina de soja (20), harina de
grano (30), salvado de trigo (5), extracto de levadura (5),
KH2PO4 (0.2), ZnSO47H2O (0.2), y VB1 (0.01). El pH fue
ajustado a 6.0 antes de la esterilizacin. Los cultivos de micelios
sumergidos fueron realizados en un frasco 250 mL que contiene
100 mL del medio sobre un agitador rotatorio (130 rpm, pH 6.0)
a 28 C por 8 d. El caldo de cultivo fue cosechado por
centrifugacin (10000 g durante 20 min), y el precipitado fue
lavado 3 veces con agua destilada y secado a 70 C.

Animales

Extraccin y fraccionamiento de PLP

El micelio de PL fue secado a 70 C y tierra para pasar por
un tamiz de malla 60. Los polvos fueron extrados con agua
caliente 90 C durante 90 min y filtrados. La suspensin
resultada pas por una centrifuga a 3500 rpm por 10 min. El
sobrenadante fue mezclado con 3 volmenes de etanol
absoluto, revuelto enrgicamente, y se dejo durante la noche
a 4 C. El PLP precipitado se centrifug a 10000 g por 20
min, y el sobrenadante se desech. Los precipitados de PLP
crudo fueron liofilizados, y el peso fue estimado.
El PLP crudo fue disuelto con agua destilada y decolorado
con resina AB-8 macroporosa adsorbente. Despus, las protenas
fueron removidas por el mtodo Sevag (Xie y otros 2011). Los
componentes del PLP crudo fueron liofilizados para producir
PLP despus de 48 h de dilisis con agua destilada. Las muestras
entonces fueron aplicadas a una columna (1.6 cm 50 cm) de
DEAE Sephadex A-50 (Beijing Solarbio Ciencia y Tecnologa
Co., Ltd., China) pre-equilibrada con agua destilada. Las
fracciones se recogieron por elucin gradual con NaCl de
aumentar la fuerza inica (0, 0.1, 0.3, y 0.5 mol/L) a un caudal
de 0.5 mL/min y determinadas por el mtodo fenol cido
sulfrico usando la glucosa como patrn (Dubois y otros 1956).
La fraccin principal obtenida fue concentrada, se dializ frente
a agua destilada con un tubo de dilisis (corte de peso
molecular: 14 kDa), y luego liofilizado. La fraccin principal
obtenida fue disuelta en 0.5 mL de agua destilada para la
cromatografa con una columna Sephadex G-200 (2.5 cm 60
cm) con agua destilada como el eluente en un caudal de 0.5
mL/min. Las muestras en parte fueron recogidas, con cada tubo
que contiene 5 mL. Despus, la deteccin de rastro fue
conducida con el mtodo fenol cido sulfrico para medir los
valores de absorbancia en una longitud de onda de 490 nm. Una
curva de elucin fue creada por el trazo de absorbancia en
comparacin con el nmero de tubo. La solucin resultante fue
concentrada y luego liofilizada para dar el polisacrido puro de
PL, cifrado como PLP-I.

Los ratones macho Kunming (20.0 a 24.0 g) fueron obtenidos

del Centro Slaccas Laboratorio Animal (Shanghai, China).
Todos los procedimientos experimentales fueron conducidos
conforme a directrices institucionales para el cuidado y el
empleo de animales de laboratorio y conformados al Natl. Inst.
De Gua de Salud para Cuidado y Empleo de Animales De
Laboratorio. Antes del experimento, todos los ratones fueron
guardados en jaulas inoxidables en condiciones controladas
(temperatura 24.0 0.5 C, humedad 55.0 5.0 %, el 12 h ciclo
claro/oscuro) y fueron alimentados con una dieta comercial
granulada a lo largo del perodo experimental. Ellos fueron
mantenidos segn la Gua para el Cuidado y el Empleo de
Animales de Laboratorio y fueron aclimatados durante una
Dispersin de luz lser multingulo (MALLS)
semana con accesos libres para alimento y agua.
El peso molecular del PLP-I fue estimado por la
cromatografa de permeacin de gel (GPC) acoplado con el
Diseo experimental ortogonal
sistema de MALLS (Wyatt Tecnologa, Santa Babara, Calif.,
Un diseo ortogonal experimental es un mtodo de EE.UU.). El sistema cromatogrfico consisti en un
optimizacin para investigar mltiples factores y niveles. Esto desgasificador, una bomba de alto rendimiento, una vlvula de
utiliza una mesa ortogonal para arreglar el experimento inyeccin equipada con un bucle de 1 mL, y la columna GPC
(Shodex OHpak SB-806 HQ, Showa Denko, Tokio, Japn) fue
cientficamente y evaluar mltiples factores (Hedayat y otros
conectada en serie. La muestra de polisacrido (500 g/mL) fue
1999). Segn la ortogonalidad, las pruebas representativas disuelta en el portador filtrado (0.1 mol/L NaCl y agua del
escogidas de entre las pruebas totales pueden ser usadas para sistema de reactivo de agua de Milli-Q) y filtrada (0.22-m tipo
encontrar el esquema ptimo y proporcionar informacin de membrana, Millipore). Los anlisis fueron realizados con la
importante. Un experimento de un solo factor fue conducido solucin buffer como la fase mvil, con un caudal de 0.5
para optimizar las condiciones extradas por polisacridos de mL/min, con el volumen de inyeccin de la muestra de 1 mL. El
cultivo de micelio de PL. Cuatro factores individuales fueron promedio total de dn/dc era 0.135 mL/g. Los datos fueron
optimizados: extrayendo temperatura (60, 70, 80, 90, o 100 C), registrados y analizados con el software de Astra V (Wyatt
la proporcin de micelio para agua (1:20, 1:30, 1:40, 1:50, o Tecnologa Corp.).
1:60), extrayendo tiempo (1.0, 1.5, 2.0, 2.5, o 3.0 h), y la
concentracin final de etanol (65 %, 70 %, 75 %, 80 %, o 85 %). Fourier transforman infrarrojo (FT-IR) anlisis de
Basado en los resultados de los experimentos de un solo factor, PLP-I
Los espectros IR de PLP-I fueron registrados con un
el experimento ortogonal fue aplicado a la optimizacin
siguiente. La mesa ortogonal L9(34) fue usada para arreglar los espectrofotmetro de FT-IR (Nicolet Instrumentos Corp.,
experimentos. Cuatro factores fueron evaluados cada vez, y cada Madison,-1Wis., EE.UU.) con un alcance de deteccin de 4000 a
factor tom 3 niveles. Los procedimientos para la produccin 400 cm . La concentracin de PLP-I en KBR era
del polisacrido eran los mismos como en la Seccin aproximadamente 2.4 %. Los picos principales (la intensidad y
nmero de onda) fueron identificados usando el software
"Extraccin y fraccionamiento de PLP. "
EZOM-NIC, versin 6.0 (Nicolet, EE.UU.).

H: Health,
Nutrition &

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Materiales y Mtodos

Vol. 79, Nr. 5, 2014 Journal of Food Science H1003

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Tabla 1-Diseo experimental y resultados de experimento ortogonal L9 (34).

Nivel de factor / Nmero de lnea

Secuencia

Extraccin de

Proporcin de micelio

Extraccin de

Concentracin

Produccin

y anlisis

temperatura / C (A)

para beber (B)

tiempo/h (C)

de etanol/% (D)

de PLP (%)

1 (80)

1 (1:40)

1 (1.0)

1 (70)

11.232

2 (1:50)

2 (1.5)

2 (75)

7.446

3 (1:60)

3 (2.0)

3 (80)

9.318

2 (90)

12.056

11.414

8.546

3 (100)

10.972

10.006

8.438

K1

9.332

K2

11.420

10.672

9.928

10.361

9.662

9.313

K3

9.805

8.767

10.568

1.340

2.653

1.255

1.472

Nivel ptimo

A2

C2

D3

B1

8.988
10.460

H: Health,
Nutrition &

El espectro del polisacrido tambin fue calculado usando metformina (control positivo), 3 grupos PLP, y un grupo de
EZOMNIC.
control diabtico. Adems, 10 ratones normales servidos como
un grupo de control no diabtico. La dosificacin de
1
H resonancia nuclear magntica (NMR) y 13 C NMR administracin de clorhidrato de metformina era 200 mg/kg; las
dosificaciones dadas de PLP eran 100, 200, y 400 mg/kg para
anlisis de espectroscopia de PLP-I
Los protones cambiables fueron substituidos con deuterio por los 3 grupos. Un volumen igual de 0.9 % solucin salina normal
suspensin de una muestra en CD3OD y liofilizando 3 veces. fue dada para el grupo de control diabtico y el grupo de control
Despus, 1H NMR espectro fue registrado sobre 600 MHz no diabtico. La administracin intragstrica fue conducida en
Bruker INNOVA 600 NB NMR espectrmetro (Bruker, 8:00 cada maana para 28 d. Durante el experimento, los
Rheinstetten, Alemania). El retraso de relajacin por el animales recibieron accesos libres al alimento y el agua. El peso
experimento NMR era 1.0 s. El potencial de ionizacin era 70 de cuerpo fue medido cada 4 d. La ltima administracin
eV, y la temperatura de la fuente de ion era 220 C. Los intragstrica fue realizada despus de 5 h de ayuno. La sangre
experimentos 1H NMR fueron conducidos a 30 C en CD 3OD fue recogida de la rbita de los ratones para detectar la
concentracin de glucosa en sangre con un medidor de glucosa
(Liu y otros 2007). Dieron a cambios qumicos en ppm.
El espectro 13C NMR de PLP-I fue registrado sobre 500 MHz en sangre.
Bruker NMR espectrmetro (Bruker) en 25 C, 2048
acumulaciones, pulso 9 s, tiempo de adquisicin 1.1 s, y El efecto de PLP sobre los niveles de glucosa en
retraso por relajacin 2 s. La anchura espectral era 200 ppm. El sangre en ratones diabticos (prueba oral de
PLP-I fue disuelto en D2O para obtener una concentracin de tolerancia de glucosa [OGTT])
100 mg/mL. Los cambios qumicos carbn 13C fueron
Cuarenta ratones fueron divididos en 4 grupos de 10 animales
calculados por MestReNova 8.0 software (Mestrelab cada uno. Todos los animales recibieron una dosis oral diaria por
Investigacin, Escondido, California, U.S.A.).
28 d. El grupo 1 recibi una solucin salina normal destilada
(2.0 mL/kg peso corporal) como un control; los grupos 2, 3, y 4
Determinacin de actividad hipoglucmica de PLP
recibieron 100, 200, y 400 mg/kg peso corporal de PLP,
Los ratones masculinos (20.0 a 24.0 g) fueron guardados respectivamente. Las muestras de sangre fueron extradas de la
para la adaptacin ambiental por l sem. Despus de la pesada cola de los animales antes de la 1ra administracin y 0.5 y 2.0 h
y ayuno por 24 h (excepto por agua), los ratones eran despus de la ltima administracin de PLP. Los niveles de
intraperitonealmente inyectados con 5 % de Aloxano (200 glucosa fueron determinados por el mtodo descrito encima.

mg/kg) (Sonawane y otros 2013). La sangre orbital fue

tomada por la determinacin de glucosa en la sangre en
ayunas con un medidor de glucosa en la sangre (Beijing
Yicheng Bioelectrnicos Tecnologa Co. Ltd., China). Los
ratones con valores de glucosa de sangre en el rango de 10 a
28 mmol/L fueron considerados como modelos diabticos.
Los ratones modelos manifestaron una disminucin en la
actividad, rarefaccin y sin brillo de pelo, y el aumento de la
ingesta de agua y alimentos, indicando que el modelo fue
exitoso.
Sesenta ratones diabticos aloxanos fueron divididos al azar
en 6 grupos de 10 ratones cada uno: un grupo de clorhidrato de
H1004 Journal of Food Science Vol. 79, Nr. 5, 2014

Anlisis estadstico
Los resultados obtenidos para cada grupo de ratones probados
fueron expresados como la media SD (n = 10), y las
diferencias entre grupos fueron evaluadas por un anlisis de
variacin (ANOVA) usando tanto pruebas-t de hiptesis
direccionales como no direccionales. Las diferencias, como se
consideraba, eran estadsticamente significativas si P <0.05.
Todos los anlisis estadsticos usaron DPS para Windows,
versin 7.05.

Resultados y Discusin

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Varios mtodos fueron aplicados para aumentar la eficacia de
la extraccin de polisacridos de setas, incluyendo la seleccin
del proceso de calentamiento ptimo, solventes, y tiempo de
extraccin. Las condiciones de extraccin ptimas de PLP
fueron determinadas. La produccin de polisacrido ms alta fue
obtenida usando una temperatura de extraccin de 90 C, sin
cambio obvio para temperaturas ms altas. Por aumentando la
proporcin de micelio para beber, la produccin de polisacridos
aument despacio. La produccin de polisacridos era la ms
alta por un 1:50 la proporcin de micelio para agua. Un tiempo
de precipitacin de 2.0 h mejor la eficacia de produccin. La
produccin de polisacrido no vari perceptiblemente con el
aumento del tiempo de extraccin. Como la concentracin final
de etanol aument, la produccin de polisacridos crudos
tambin aument. La produccin de polisacridos obtenidos en
la concentracin de etanol del 75 % era considerablemente ms
alta que aquellas concentraciones de etanol de utilizacin
obtenidas del 50 % al 65 %, pero no era notablemente diferente
de aquella utilizacin obtenida una concentracin de etanol del
80 %. Por lo tanto, una concentracin de etanol del 75 % era
ptima para obtener altas producciones de polisacrido.
Basado en los resultados de los experimentos de un solo
factor, un experimento ortogonal fue aplicado a la optimizacin.

Como mostrado en la Tabla 1, 9 experimentos de extraccin

fueron realizados usando las combinaciones de los 4 factores:
extrayendo temperatura (A), proporcin de micelio para agua
(B), extrayendo tiempo (C), y la concentracin final de etanol
(D), con los valores respectivos siendo definidos por el nivel de
factor n (n = 1, 2, y 3). Para cada factor, el total y el promedio de
produccin de PLP (%) en cada nivel de factor n entonces
fueron calculados, como mostrado por los valores de Kn. El
valor R entonces fue definido como la diferencia entre los
valores mximos y mnimos de Kn; as, ms grande el valor de
R, ms fuerte la influencia del factor en adsorcin (Jiang y otros
2010). Considerando el nivel de factor n que da el mximo valor
Kn para cada factor, las condiciones ptimas fueron
determinadas para ser A2B1C2D3. Los resultados del experimento
ortogonal tambin mostraron que los efectos de un solo factor
sobre la produccin de PLP eran significativos (P <0.05). Guo y
otros (2010) tambin divulg que la proporcin de micelio para
agua favoreci la eficiencia de extraccin para polisacridos de
P. igniarius. Pruebas paralelas fueron conducidas sobre
A2B1C2D3 en 3 repeticiones, y el valor medio era mejor que l de
otras condiciones. As, A2B1C2D3 fue escogido para el empleo en
las pruebas siguientes. La produccin de PLP aument
aproximadamente 38 % en relacin con los parmetros de
proceso antes de la optimizacin. En las condiciones ptimas, la
tarifa de extraccin mxima alcanzada era el 12.06 %.

Figura de 1-Purificacin de polisacridos

crudos de Phellinus linteus (PLP). (A) El
PLP crudo fue separado adems por
DEAE Sephadex A-50 la cromatografa de
columna en 3 fracciones: PLP-I, PLP-II, y
PLP-III. (B) PLP-I fue separado adems
por la G Sephadex 200 cromatografa de
columna en 1 fraccin. (C) Anlisis de
espectro de la absorcin de PLP-I
utilizacin de ultravioleta visible (UV-VIS)
espectroscopia.

H: Health,
Nutrition &

Experimento ortogonal

Vol. 79, Nr. 5, 2014 Journal of Food Science H1005

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Purificacin del PLP
Un polisacrido crudo soluble en agua fue extrado del PL
cultivado en las condiciones de ptimas extraccin usando
agua caliente. La solucin concentrada se precipit, y despus
se retir de la protena, el PLP crudo fue obtenido y separado
adems por cromatografa de columna DEAE Sephadex A-50
por la elucin gradual con soluciones de cloruro de sodio (0, 0.1,
0.3, y 0.5 mol/L) en 3 fracciones, PLP-I, PLP-II, y PLP-III
(Figura 1A). El pico principal (PLP-I) fue fraccionado adems
sobre una columna G Sephadex 200, y el componente principal
fue recolectado (Figura 1B). El PLP-I se hizo polvo blanco
despus de la liofilizacin. Despus, el espectro de absorcin de
UV de la muestra fue estudiado en 280 y 260 nm (Figura 1C); la
ausencia de picos de absorcin en estas longitudes de onda
indic que ninguna protena o el cido nucleico permanecieron
en el polvo (Paso y otros 1995). El PLP-I fue ms analizado.

Caracterizacin del PLP-I

Las actividades biolgicas de los polisacridos fueron
influenciados por su diferente solubilidad en agua, pesos
moleculares, y grados de ramificacin (Zaidman y otros 2005).
La estructura y peso molecular de los polisacridos son
asociados con la actividad hipoglucmica. La figura 2 mostr
los argumentos logartmicos de peso molecular del polisacrido
puro. Los valores de peso molecular medio (Mw = 3172.9 kDa)
y nmero de masas molares (Mn = 79.3 kDa) fueron
determinados, que era similar con el polisacrido de P. baumii
(2000 kDa) (Ge y otros 2009), pero ms alto que otro

Figura 2-Los argumentos

logartmicos de peso
molecular del polisacrido
purificado de Phellinus
linteus (PLP-I) en sistema
GPC/MALLS.

polisacrido aislado de P. linteus, es decir, PSCPL (22 a 1700

kDa) y PLP (153 kDa), respectivamente (Kim y otros 2010; Wu
y otros 2013). Los diferentes mtodos de aislamiento y
condiciones han mostrado que varios polisacridos con

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

composiciones diferentes y pesos moleculares podran ser
purificados de la misma especie. La viscosidad del polisacrido
de la seta afecta la actividad hipoglucmica. Kiho y otros (2001)
demostr que el polisacrido de Tremella aurantia con muy alto
peso molecular (> 1500 kDa) tiene la mejor actividad
antidiabtica que sus productos degradados con pesos
moleculares inferiores.
El espectro de FT-IR era caracterstico de un polisacrido. El
espectro de FT-IR (Figura 3A) obtenido de PLP-I mostraron
picos en aproximadamente 4000 y 400 cm -1, caracterstico del
carbohidrato. El anlisis de PLP-I mostr una vibracin de
estiramiento O-H en 3441.03 cm-1, que principalmente fue

atribuido a la vibracin de estiramiento del polisacrido

glucsido hidroxilo (Liu y 2007 Wang). En el espectro, una de
vibracin de estiramiento C-H fue observada en 2930.54 cm -1, y
una vibracin de estiramiento C-O fue observada en 1416.81
cm-1 (Ye y otros 2011). La banda en 1635.48 cm -1 era debido al
agua ligada (Liu y 2007 Wang). Los 3 picos de vibracin de
estiramiento entre 1154.23 y 1023.31 cm -1 en el espectro IR
sugirieron las presencias de C-O-C y C-O-H (Zhao y otros 2007;
Luo y otros 2010).
El pico en 929.11 cm -1 correspondi al anillos no simtrico
que estira la vibracin de D-glucopiranosil (Liu y Gu 2007;
Chen y otros 2008).

Figura 3 Anlisis de estructura del polisacrido purificado Phellinus linteus (PLP-I). (A) El espectro de FT-IR PLP-I expuso picos en
aproximadamente 4000 y 400 cm-1 en la regin de carbohidrato. (B) El espectro 1H NMR de PLP-I fue registrado en CD3OD.

Adems, el pico de la absorcin en 759.32 cm -1 era caracterstico

de D-piranosa (Luo y otros 2008). El espectro-1FT-IR de PLP-I
mostr un pico caracterstico en 841.32 cm , indicando los
residuos del enlace -glicosil, es decir una vibracin de-1
deformacin -C1-H. La banda de absorcin en 1079.49 cm
indic que los enlaces glucosdicos de los residuos de glucosilo
estaban vinculados a (Kozarski y otros 2011). En adicin, este
resultado es consistente con investigaciones previas sobre la
caracterizacin qumica de un tipo salvaje de cuerpo fructfero
de polisacrido de PL (Kozarski y otros 2011), -1con la excepcin
de la absorcin entre 1635.48 y 1023.31 cm , indicando una
diferencia entre el cuerpo fructfero del polisacrido y el micelio
de polisacrido.
La ventaja de usar espectroscopia NMR para la elucidacin de
la estructura de los polisacridos consiste en que esto no implica

incertidumbres que son resultado de la degradacin qumica y

produce datos por el polmero intacto. La espectroscopia 1H
NMR fue usada examinar la estructura del PLP-I. El espectro 1H
NMR de 600 MHz de PLP-I, mostrado en la Figura 3B,
confirm que los residuos de azcar estaban vinculados glucosdico. Nuestros resultados estn de acuerdo con los de
Kawagishi y otros (1990), quien divulg que un doblete en 4.1 y
4.5 ppm corresponde a la configuracin . Dos resonancias en
4.91 y 4.64 ppm fueron observadas en esta regin en PLP-I. Los
cambios qumicos de 4.0 a 2.5 ppm fueron designados como los
protones de carbones C-2 a C-6 sobre el anillos glucosdico (Wu
y otros 2006). Laurienzo y otros (2005) encontr que el pico 2
de protones en

H: Health,
Nutrition &
Figura 4 Espectro

13

C NMR del polisacrido purificado de Phellinus linteus (PLP-I).

H: Health,
Nutrition &

H1006 Journal of Food Science Vol. 79, Nr. 5, 2014

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Figura 5 Niveles de glucosa en sangre en ratones diabticos inducidos por aloxano despus 9, 18, y 28 d de
tratamiento con PLP y metformina. ^^ P <0.01 (comparado con el grupo normal); *P <0.05, ** P <0.01 (comparado con
grupo de control) (M- 200: metformina, 200 mg/kg peso corporal; P-100, 200, y 400: PLP, 100, 200, y 400 mg/kg peso
corporal, respectivamente).

3.36 (terminal O-CH3) y 2.66 ppm (CH2 en posiciones 2 y 3) son

cambiados fuera del campo a 3.34 y 2.79 ppm en PLP-I,
respectivamente. La seal 3.2-ppm proviene de 3 protones
equivalentes (grupo CH3). Este grupo debe ser unido al O, as
dando -O-CH3 segn los datos de la literatura (Vlahov 1999).
Adems, los protones del metileno aparecen en 1.3 ppm
(Moussa y Ali 2008). 13C NMR tiene mayor dispersin de
desplazamiento qumico y a menudo puede proporcionar ms
informacin. El espectro 13C de PLP-I dio en la Figura 4. El
alcohol primario (C-6 por piransido) resuena en 57 a 64 ppm.
Las resonancias para C-2 a C-5 pueden ser encontradas en 65 a
79 ppm. El carbones anomrico C-1 (ax-O, reduciendo) tena los
cambios en 90 a 95 ppm. As, el PLP-I tena un tpico espectro
13
C NMR de un polisacrido (Cheng y Neiss 2012).

Actividad hipoglucmica de PLP

Los efectos de PLP sobre el nivel de glucosa en la sangre en
ratones diabticos inducidos por aloxano durante un perodo de
28d fueron representados en la Figura 5. En los 4 grupos
diabticos (aloxano y PLP), las concentraciones de la lnea de
base de glucosa en sangre eran casi los mismos, con ambos
grupos dentro de la gama de error. La administracin diaria de
PLP (100, 200, y 400 mg/kg) para 18 y 28 d en ratones
diabticos inducidos por aloxano- caus una reduccin
significativa del nivel de glucosa en la sangre comparado con el
grupo de control diabtico. La disminucin media de porcentaje
de los niveles de glucosa en la sangre causados por PLP en las
dosis de 100, 200, y 400 mg/kg era el 22.35 %, el 16.35 %, y el
15.19 %, respectivamente, en 18 d y el 35.6 %, el 23.65 %, y el
23.90 %, respectivamente, en 28 d. Diferencias significativas
fueron observadas entre la administracin para 18 y 28 d. En el
grupo de control diabtico (Control), el nivel de glucosa en
plasma aument continuamente durante el perodo experimental,
alcanzando un nivel final de 20.28 mol/L. Al contrario la
administracin de PLP considerablemente baj el nivel de
glucosa en la sangre al 35.60 % durante el da 28 cuando
comparado al grupo de control diabtico (P <0.01). Adems, el
efecto de hipoglucmico de PLP era mejor que el poder de
micelio de PL reportado por Kim y otros (2001a), pero menor
que el polisacrido extracelular del cultivo
sumergido de P. linteus (Kim y otros 2001c). Sin embargo, los
resultados mostraron que la dosis menor (P-100) era ligeramente
ms eficaz en reducir el nivel de glucosa en la sangre en ratones
diabticos inducidos por aloxano que las dosis ms altas (P-200
y P-400). Ningn efecto de hipoglucmico obvio dependiente de
dosis fue observado.
La administracin oral de PLP no caus ningn cambio del
comportamiento alimenticio y no haba ningunos efectos
dainos en ratones. Adems, el efecto de administracin de PLP
sobre el peso corporal en ratones diabticos inducidos por
aloxano fue evaluado (Figura 6). El peso corporal de ratones
diabticos inducidos por aloxano era considerablemente inferior
que los de ratones normales en 20 y 24 d. Los efectos del
tratamiento con PLP inferior a largo plazo aumentaron el peso
corporal. As, el PLP puede proporcionar una alternativa
preferible para el control de glucosa en la sangre en diabetes.
Sin embargo, los resultados no eran considerablemente
diferentes para las dosificaciones ms altas de PLP.

Vol. 79, Nr. 5, 2014 Journal of Food Science H1007

Efecto hipoglucmico de Phellinus linteus...

Figura 7Tolerancia a la glucosa oral en ratones diabticos

inducidos por aloxano despus del tratamiento con PLP. P

< 0.05,
P < 0.01 (comparado con el grupo normal) (P-100,
200, y 400: PLP, 100, 200, y 400 mg/kg peso corporal,
respectivamente).

H: Health,
Nutrition &

que los rasgos estructurales de polisacridos de seta tambin

fueron unidos para la actividad hipoglucmica. (El 1-4) - unido
y/o (1-6) - los residuos unidos en - (1-6) - se bifurcaron (1-3) - la d-glucan fue necesaria para el efecto hipoglucmico en
ratones diabticos (Kiho y otros 1994). Este encuentro era de
Los pesos corporales fueron reducidos en ratones diabticos y acuerdo con el anlisis de estructura de PLP. EL PLP puede
recuperados cuando se someten al tratamiento hipoglucmico producir efectos antidiabticos en ratones diabticos por el
estmulo de liberacin de insulina de las clulas y otros
debido a la presencia de PLP.
Mostraron los resultados del efecto de PLP sobre la tolerancia mecanismos.
de glucosa oral en ratones diabticos en la Figura 7. Media hora
despus de la administracin de azcar, la glucosa en sangre Conclusiones
En el resumen, las condiciones ptimas para la produccin de
haba alcanzado su punto mximo en todos los grupos, despus
de lo cual comenz a caerse. Dos horas despus de la PLP eran as: proporcin de micelio para agua, 1:40;
administracin de azcar, las concentraciones de glucosa en temperatura de extraccin, 90 C; tiempo de extraccin, 1.5 h;
sangre haban vuelto a normal o estaban ms bajas que antes de concentracin de etanol final, el 80 %. En las condiciones
la administracin. Los valores de glucosa en sangre en el grupo ptimas, la tarifa de extraccin mxima era el 12.06 %. Las
de administracin de PLP eran menores que aquellos del grupo condiciones experimentales permiten a una extraccin rpida,
normal despus de la administracin de azcar. Adems, los econmica de polisacrido de micelio. La caracterizacin
valores de glucosa en sangre en el grupo P-100 eran preliminar de PLP por IR y el anlisis NMR revel un glicano
considerablemente inferiores que aquellos en el grupo normal 0 tipo ramificado con tanto enlaces -y . Los espectros
a 2 h despus de la administracin de azcar. Los tratamientos mostraron que PLP-I tena caractersticas de polisacrido tpicas
con PLP estimularon un aumento en la utilizacin de glucosa, con una conformacin piranoidal de anillo de azcar. PLP tena
sugiriendo una mejora en la tolerancia de glucosa despus de 28 un efecto significativo hipoglucmico (P <0.01) y la influencia
d de tratamiento con PLP, por lo visto debido a un aumento de la sobre el peso de cuerpo y el nivel de glucosa de sangre (P <0.05)
en ratones diabticos inducidos por aloxano. Todos estos
sensibilidad de insulina.
Los efectos hipoglucmicos fueron estimados como la resultados indican que los micelios de polisacridos de PL
reaccin de reduccin del nivel de glucosa en sangre en grupos pueden ser desarrollados en medicinas hipoglucmicas o
experimentales al del grupo de control diabtico. En el pasado, alimentos naturales. El remoto estudio es necesario para
muchas variedades de seta, como se ha relatado, posean identificar las estructuras exactas qumicas de los polisacridos y
actividades hipoglucmicas en animales as como en pacientes clarificar el mecanismo del efecto hipoglucmico. Adems, las
diabticos (Konno y otros 2001). En el estudio presente, los combinaciones de otros compuestos naturales pueden ser
previstas
Figura 6 El peso corporal en ratones diabticos inducidos por aloxano despus de 4, 8 , 12 , 16 , 20 , y 24 d de tratamiento con PLP y
un
metformina. #P < 0,01 (comparado con el grupo normal); * P < 0,05 , ** P < 0,01 ( comparado con el grupo control ) ( M- 200: para
efecto ms
metformina, 200 mg / kg de peso corporal ; P- 100 , 200 , y 400 : PLP , 100 , 200 , y 400 mg / kg peso corporal , respectivamente).
eficiente
H1008 Journal of Food Science Vol. 79, Nr. 5, 2014
cuerpos fructfero y la biomasa micelial de Phellinus tambin
tienen actividades significativas hipoglucmicas (Hwang y otros
2005). PL actos como un agente antidiabtico por inhibiendo el
perxido de hidrgeno (H2O2) - indujo apoptosis y la secrecin
de insulina creciente en clulas H2O2-tratadas (Jiang y otros
2010). El tratamiento de la fraccin de polisacrido de PL
inhibi el desarrollo de diabetes autoinmune va la expresin
atenuante de citocinas inflamatorio por el ayudante de T tipo
1(Th1) clulas o macrfagos mientras upregulating IL-4 la
expresin por clulas Th2 en ratones no obesos diabticos (Kim
y otros 2010). Kim y otros (2001b) tambin notaron que la
administracin oral de exopolisacridos producidos por PL
causado el aumento del peso del cuerpo en ratas diabticas. En
este estudio, PLP condujo a menos entrada de alimentos que el
grupo diabtico, que contribuira a la supresin del aumento de
nivel de glucosa con PLP (Kiho y otros 2001). Se ha relatado

antidiabtico.

Reconocimientos
Este estudio econmicamente fue apoyado por la Fundacin
de Ciencias naturales de China (Nr 31370146 y 41306181), el
Centro de Investigacin de China Nacional de Ingeniera
JUNCAO Tecnologa (JCJJ13012) y financiado por los
Proyectos de Ciencia y Tecnologa del departamento de
Educacin Fujian, China (Nr. JB12055 y JB13051).

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