MATERIALES Y METODOS

El cndor andino es el ave ms pesada del mundo alza y una de las especies
de aves ms sexualmente dimrficos: varones adultos (15 kg,) pesan
aproximadamente un 30% ms que las mujeres (11 kg),. Esta especie es la
nica excepcin a la dimorfismo sexual invertido que se encuentra en las
aves rapaces. El cndor andino es un carroero amenazado a nivel mundial
que vive en zonas montaosas a lo largo de los Andes sudamericanos regin.
Cndores son aves sociales de agregacin en las canales y los sitios, donde
se segregan por edad y sexo, con los machos adultos estar en la cima de la
jerarqua y las hembras juveniles en el rango inferior [23,31] dormideros.
Aparicin de la especie difiere entre las edades y sexos de acuerdo a las
caractersticas del plumaje, morfologa, color y tamao de las piezas
desnudas, especialmente en la cabeza y el cuello [28,32]. Los machos tienen
un gran peine, iris marrn, barbas del cuello y la piel desnuda que vara de
gris a amarillo en la cabeza y el cuello; las hembras tienen un iris de color
rojo, la piel de menos de color amarillo y ningn peine, y juveniles muestran
oscuro piel desnuda de color gris. La intensidad del color en las partes
desnudas de subadultos adultsand puede cambiar de color rosa plido,
amarillo o gris a amarillo intenso, naranja y rojo dentro de un par de
segundos durante los concursos en las canales, especialmente en los machos
(Fig. 1), lo que sugiere un papel como indicadores de dominancia que faciliten
el establecimiento de jerarquas de alimentacin.
El buitre negro americano (1,5 kg) es profundo negro y de color gris, con
excepcin del parche ala blanca y marrn del iris, y no muestra diferencias
externas de patentes entre las edades o sexos. Esta especie habita una gama
grande en toda Amrica y muestra una tendencia al aumento de la poblacin,
debido principalmente a la explotacin oportunista de los recursos
alimentarios asociados con las actividades humanas
Recogida de muestras
Buitres fueron capturados con redes de can en octubre-noviembre de 2010 cerca de
Bariloche, Ro Negro, Patagonia Argentina. Una muestra de sangre (3.2 ml) se extrajo
de la vena braquial de cndores andinos (n = 22) y buitres negros americanos (n = 17),
transferidos a viales que contienen heparina seca y transportados en un refrigerador. En
el da de la recoleccin, las muestras de sangre se centrifugaron a
13 000 g durante 10 min para obtener plasma, que se congel a 220uC hasta el
anlisis. Adems, las muestras de sangre de los cndores andinos cautivos (n = 27) se
obtuvieron del Zoo de Buenos Aires, Argentina, donde fueron alimentados cndores en
carne sin contenido vegetal de las vsceras: el tejido muscular, fresco, con huesos y la
piel de animales de laboratorio y mamferos ganado herbvoro , en su mayora
ganado bovino y caprino. Individuos muestreados incluidos los menores en su primer,
segundo y tercer ao de calendario, subadultos (3-5 aos de edad) y adultos con
plumaje definitivo ($ 6 aos) de ambos sexos.
Permisos para capturar y toma de muestras de sangre de los cndores andinos y
buitres negros americanos fueron proporcionados por Direccin de Fauna Silvestre de
Ro Negro, la Administracin de Parques Nacionales de Argentina, el Zoolgico de
Buenos Aires, Argentina, y los propietarios y gerentes de las granjas locales, quienes
tambin aprobaron el protocolos de captura y muestreo. Determinacin de la edad y el
sexo de los cndores andinos se llevaron a cabo de acuerdo a las caractersticas del
plumaje, morfologa y tamao [28,32]

Determinacin y cuantificacin de carotenoides de plasma

Un procedimiento optimizado se utiliz para el anlisis de carotenoides.
Brevemente, un volumen conocido de plasma (100 ml) se liofiliz, y los pigmentos
carotenoides se extrajeron a partir del residuo seco con 200 ml de N, Ndimetilformamida durante 60 min, incluyendo sonicacin (Una corriente elctrica
transmite su energa a un sistema mecnico que la convertir en vibraciones
de alta intensidad que generan ondas de ultrasonido. Los ultrasonidos
generan, a su vez, vibraciones en el material objetivo. Si contiene lquidos, se
generarn millones de burbujas microscpicas, las cuales sufren rapidsimos
procesos de expansin y colapso que pueden transmitir su energa a otros
materiales. Este fenmeno se llama cavitacin y puede ser incrementado
aadiendo al medio pequesimas esferas de vidrio) durante 5 min cada 30 min.
El extracto resultante fue posteriormente se centrifug a 12.000 g durante 5 min y la
capa superior se almacena a 230uC hasta que el anlisis por cromatografa lquida de
alto rendimiento (HPLC). El anlisis cromatogrfico se llev a cabo en el mismo da
como la preparacin de los extractos.
Los anlisis se llevaron a cabo por duplicado. Todas las operaciones se llevaron a cabo
bajo la luz tenue para evitar la isomerizacin y la fotodegradacin de los carotenoides.
Identificacin de los carotenoides presentes en las muestras de plasma se llev a cabo
siguiendo procedimientos estndar [33], y consisti en la separacin y el aislamiento de
los pigmentos por cromatografa en capa fina (TLC) y co-cromatografa con las normas,
la adquisicin de los espectros UV-visible en diferentes disolventes , as como pruebas
de microescala derivatizacin qumica para el examen de grupos 5,6- epoxi, hidroxilo y
carbonilo [34]. Las propiedades cromatogrficas, espectroscpicas y qumicas de los
pigmentos se compararon con muestras autnticas de carotenoides, as como con los
datos en la literatura [35,36,37,38,39]. Se aislaron muestras de pigmentos autnticos de
carotenoides, y se purificaron mediante TLC, a partir de fuentes naturales: b-caroteno
(a, b-caroteno), b-criptoxantina (a, b-caroten-3-ol), y zeaxantina (b, b-caroteno-3,39-diol
se obtuvieron) de pimentn (Capsicum annuum L.), y la lutena (b, e-caroteno-3,39-diol)
de las hojas de menta (Mentha arvensis) [40].
Norma equinenona fue generosamente dada por el Dr. George Britton (Escuela de
Ciencias Biolgicas de la Universidad de Liverpool, Reino Unido). La identificacin de
los ismeros cis de lutena y zeaxantina se bas en la presencia y la intensidad relativa
(% AB / AII) del pico de cis a aproximadamente 330-340 nm en el espectro UV-visible,
una reduccin en la estructura fina y un pequeo cambio hipsocrmico en lmax con
respecto a la lutena todo-trans, y el comportamiento cromatogrfico en la columna C18
HPLC de fase inversa (los ismeros cis son ligeramente ms retenidos que el ismero
todo trans) [38].
El anlisis cuantitativo de los carotenoides por HPLC se llev a cabo de acuerdo con el
mtodo de M'nguez-Mosquera y Hornero-Mendez [40] con algunas modificaciones. La
HPLC systemconsisted de un cromatgrafo Waters Alliance 2695 equipado con un
detector de matriz de fotodiodos Waters 2998, y controlado con
Empower2 software (Waters Cromatograf'a, SA, Barcelona,
Espaa). Una columna de fase inversa C18 analtica (Mediterranea SEA18, 20.064,6
Identificacin mm, 3 mm; Teknokroma, Barcelona, Espaa) se utiliz. La separacin se
consigue mediante una elucin en gradiente binario usando una composicin inicial de
75% de acetona y 25% de agua desionizada, que se aument linealmente hasta 95%
de acetona en 10 min, luego elevada a 100% en 2 min, y se mantuvo constante durante
10 min . Se alcanzaron las condiciones iniciales en 5 min. Se utiliz un volumen de
inyeccin de 20 ml y una velocidad de flujo de 1 ml / min. La deteccin se realiz a 450
nm, y los espectros fueron adquiridos en lnea en el rango de longitud de onda de 350700 nm. La cuantificacin se realiz utilizando curvas de calibracin estndar externos
preparados con normas zeaxantina, lutena, b-criptoxantina, equinenona y b-caroteno.

Las curvas de calibracin se prepararon en el intervalo de 0,5 a 45,0 mg / mL,

y construidos por el trazado de la zona pico a 450 nm frente a la
concentracin de pigmento. Las curvas de calibracin de todo-trans-lutena y
todo-trans-zeaxantina tambin se utilizaron para determinar la concentracin
de sus respectivos ismeros cis. a-criptoxantina se cuantific mediante el uso
de la curva b-criptoxantina.
Los anlisis estadsticos univariados diferencias en la concentracin de
carotenoides en plasma entre las especies silvestres (cndores andinos y
negro americano buitres) y dentro de las especies (cndores andinos en
cautiverio y silvestres) fueron evaluados de acuerdo con el tamao del efecto
de las diferencias (d de Cohen y sus intervalos de confianza del 95%) y las
pruebas t en transformado datos para alcanzar la normalidad. Para
determinar la magnitud del tamao del efecto que constituye una diferencia
biolgicamente relevantes, se evalu si los intervalos de confianza superior e
inferior al 95% se superponen con el valor de referencia d de Cohen cero
indica que no hay diferencia entre los grupos [41,42].
Las relaciones entre las concentraciones de cada tipo de carotenoides en
plasma dentro de los individuos se calcularon mediante correlaciones de
Pearson. Para intentar reducir objetivamente la base de datos original a las
variables de compuestos ms pequeo, mutuamente no correlacionados o
factores, se llevaron a cabo anlisis factorial utilizando la matriz de
correlacin.
Las puntuaciones de los factores subyacentes que causan la covariacin de
potencial entre las concentraciones observadas de cada carotenoide fueron
extrados y utilizados como (ortogonales) variables de respuesta
independientes.
Las diferencias en la concentracin de carotenoides plasmtica total (mg /
ml) con la edad, el sexo y el estado (salvaje o en cautividad) de cndores
andinos fueron evaluados por medio de tres vas ANOVA. La variacin en la
concentracin de cada tipo de carotenoide de acuerdo a la edad y sexo de los
cndores andinos silvestres fue evaluada por dos vas ANOVA. La modelos
fueron reducidos a su forma ms simple mediante la eliminacin, de una
manera escalonada hacia atrs, las variables o interacciones independientes
que no pudieron explicar la variacin significativa en la dependiente variable.
Se procedi al probar la importancia de todas las variables y interacciones
bidireccionales, eliminando slo las que dio lugar a una menor asociacin con
la variable dependiente, a partir de la interaccin de dos vas. El significado
de las variables restantes se ensay de nuevo, hasta que no variable o
interacciones adicionales podran ser retirados de la modelo. El resultado es
el modelo ms adecuado para explicar la variabilidad en la variable de
respuesta, donde se retienen slo las variables explicativas significativas.
Tambin se inform de modelos completos incluyendo trminos de efectos
fijos no significativas, pero con exclusin de las interacciones no
significativas. Parcial Eta al cuadrado (gp 2) se utiliz como una medida del
tamao del efecto en ANOVA [41].