ES

MYCOPLASMA PNEUMONIAE
ELISA IgG/IgM
G/M1015: Prueba inmunoenzimtica indirecta para determinar anticuerpos
IgG y/o IgM frente a Mycoplasma pneumoniae en suero humano. 96 tests.
INTRODUCCIN:
M. pneumoniae produce neumona atpica primaria con mayor frecuencia
en nios y adolescentes. El aislamiento en cultivo de M. pneumoniae es
complejo, por lo que el diagnstico se suele realizar por mtodos
serolgicos. Puede detectarse IgM a M. pneumoniae una semana despus
de la aparicin de los sntomas e IgG a partir de la segunda semana. Sin
embargo no en todos los pacientes (especialmente en caso de
reinfecciones) aparece IgM. Un 56% de los enfermos mayores de 40 aos
presentan slo respuesta de IgG en el curso de la enfermedad, mientras que
los nios dan generalmente respuesta de IgM. Los anticuerpos IgM son un
buen marcador de enfermedad aguda porque persisten slo durante 3-4
meses, sin embargo los anticuerpos IgG se mantienen durante aos tras la
infeccin. El mtodo serolgico ms clsico ha sido la reaccin de fijacin
de complemento (RFC), aunque actualmente se utilizan sobre todo ELISA
e IFI.
FUNDAMENTO DEL MTODO:
Mtodo de ELISA basado en la reaccin de los anticuerpos de la muestra
con el antgeno unido a la superficie de poliestireno. Las inmunoglobulinas
no unidas por reaccin con el antgeno son eliminadas en el proceso de
lavado. En un paso posterior la globulina anti-humana reacciona con el
complejo antgeno-anticuerpo, y la que no se une es eliminada por los
lavados; la unida reacciona con el sustrato (TMB), para dar una reaccin
coloreada azul, que cambia a amarillo tras la adicin de la solucin de
parada.
Producto coloreado

Peroxidasa

Globulina anti- IgG/IgM humana

Sustrato incoloro

3G VIRCELL IgG POSITIVE CONTROL: 500 l de suero control

positivo para IgG con Proclin.
3M VIRCELL IgM POSITIVE CONTROL: 500 l de suero control
positivo para IgM con Proclin.
4G VIRCELL IgG CUT OFF CONTROL: 500 l de suero cut off para
IgG con Proclin.
4M VIRCELL IgM CUT OFF CONTROL: 500 l de suero cut off para
IgM con Proclin.
5G VIRCELL IgG NEGATIVE CONTROL: 500 l de suero control
negativo para IgG con Proclin.
5M VIRCELL IgM NEGATIVE CONTROL: 500 l de suero control
negativo para IgM con Proclin.
6G VIRCELL IgG CONJUGATE: 15 ml de una dilucin de globulina
anti-IgG humana conjugada con peroxidasa, con Proclin y coloreada de
naranja. Lista para su uso.
6M VIRCELL IgM CONJUGATE: 15 ml de una dilucin de globulina
anti-IgM humana conjugada con peroxidasa, con Proclin y coloreada de
naranja. Lista para su uso.
7 VIRCELL TMB SUBSTRATE SOLUTION: 15 ml de solucin de
sustrato: tetrametilbenzidina (TMB). Listo para su uso.
8 VIRCELL STOP REAGENT: 15 ml de solucin de parada: cido
sulfrico 0,5 M.
9 VIRCELL WASH BUFFER: 50 ml de solucin de lavado (concentrado
20x): tampn fosfatos con TweenR-20 y con Proclin.
Conservar entre 2 y 8C y comprobar la fecha de caducidad.
Material necesario no contenido en el kit:
Pipeta de precisin para dispensar 5 y 100 l.
Pipeta multicanal de precisin para dispensar 100 l.
Lavador de placas de ELISA.
Incubador/bao termostatizado.
Espectrofotmetro de placas de ELISA con filtro de 450 nm y filtro de
referencia de 620 nm.
Agua destilada.
Alternativamente procesador automtico de ELISA.
Para las pruebas de IgM, sorbente de IgG humana (ref. Vircell S001).
CONSERVACIN:

IgG/IgM humana anti-M. pneumoniae

Conservar entre 2 y 8C. No utilizar los componentes del kit despus de la

fecha de caducidad. La caducidad indicada ser vlida siempre que los
componentes se mantengan cerrados y conservados entre 2 y 8C.

Antgeno de M. pneumoniae

CONSERVACIN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES

UNA VEZ ABIERTOS:

CARACTERSTICAS:
Todos los reactivos a excepcin de la solucin de lavado vienen listos para
su uso.
Las soluciones de dilucin de muestras y de conjugado estn coloreadas
como ayuda a la realizacin de la tcnica.
No se precisa dilucin previa de la muestra.
Los pocillos son individuales, por lo que slo se consumen tantos pocillos
como pruebas se van a realizar.

COMPONENTE
Solucin de lavado diluida
(1x)
Resto de componentes

ESTABILIDAD
4 meses a 2-8C
Fecha indicada en envase a 2-8C

ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS:

Usar todos los reactivos en condiciones aspticas para evitar

contaminaciones microbianas.
No permitir el secado de la placa entre los lavados y la adicin de los
reactivos.
1 VIRCELL MYCOPLASMA PNEUMONIAE PLATE: 1 placa con 96
La solucin de sustrato es fotosensible. Evitar la exposicin directa a la luz
pocillos recubiertos con antgenos solubles en detergentes (conteniendo
y desechar si presenta coloracin azul. La solucin de sustrato no debe
entrar en contacto con oxidantes como soluciones de hipoclorito ni con
protena P1) de M. pneumoniae, cepa FH (ATCC 15531).
algunos metales. Evitar el contacto con partes metlicas o componentes
2 VIRCELL SERUM DILUENT: 25 ml de diluyente para sueros: tampn
metlicos de equipos o instrumentos sin antes haber comprobado su
fosfatos con estabilizante de protenas, con Proclin y coloreado de azul.
compatibilidad.
Utilizar slo la cantidad de solucin de lavado, sustrato, diluyente de
Listo para su uso.
sueros y conjugado necesarias para la realizacin de la prueba. No
devolver a los viales el exceso sobrante.
PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO
CONTENIDO DEL KIT:

Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

http://www.vircell.com

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VIRCELL, S.L. no se responsabiliza de la inadecuada utilizacin de los

reactivos contenidos en el kit.
RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES:
1.

Este producto es slo para diagnstico in vitro y est destinado al uso

por personal sanitario cualificado.
2. Usar slo componentes del kit. No mezclar los componentes de
diferentes kits o fabricantes. Slo las soluciones de lavado, sustrato,
parada y diluyente de sueros son compatibles con los equivalentes en
otras referencias y lotes de ELISA VIRCELL.
3. Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del
ensayo. Utilizar slo material limpio y preferentemente desechable.
4. No utilizar en caso de deterioro del envase.
5. No pipetear con la boca.
6. El diluyente para sueros, placa, conjugados y controles de este equipo
contienen material de origen animal. Los controles contienen adems
material de origen humano. Aunque los sueros control del equipo son
sometidos a controles de ausencia de HBsAg y anticuerpos frente a
VIH y Hepatitis C, es necesario manejar los controles y muestras del
paciente como potencialmente patgenos. Los pocillos contienen
antgeno de M. pneumoniae inactivado, no obstante, deben manejarse
con precaucin. Ningn mtodo actual puede asegurar por completo
la ausencia de stos u otros agentes infecciosos. Todo el material
debe ser manipulado y desechado como potencialmente infeccioso.
Observe la regulacin local en materia de residuos clnicos.
7. La solucin de sustrato puede ser irritante para piel y mucosas. En
caso de contacto con esta solucin lavar la superficie afectada con
agua y solicitar asistencia mdica. Para ms informacin, solicite la
hoja de seguridad del producto.
8. Para la utilizacin del producto en sistemas automticos de anlisis se
recomienda una evaluacin previa. VIRCELL dispone de juegos de
muestras para su ensayo en paralelo con el mtodo manual. Estos
juegos pueden ser solicitados con tal finalidad. Asimismo, es posible
la consulta de un listado de sistemas automatizados aprobados para
su utilizacin con la gama de productos ELISA VIRCELL.
9. Durante los perodos de incubacin, un adecuado sellado de las
placas con la lmina adhesiva que se suministra evita la desecacin
de la muestra y garantiza la repetitividad de los resultados.
10. Para determinacin de anticuerpos IgM, este producto ha sido
diseado para su uso conjunto y exclusivo con SORBENTE de IgG
humana VIRCELL (ref. Vircell S001).
TOMA DE MUESTRA:
La sangre debe extraerse en condiciones aspticas mediante tcnicas de
venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de tcnicas
aspticas o estriles para evitar la contaminacin de la muestra. Los sueros
deben mantenerse refrigerados entre 2 y 8C si se van a procesar dentro de
los 7 das siguientes a la toma, pero si el procesamiento se va a prolongar
deben congelarse a -20C, evitando las congelaciones y descongelaciones
innecesarias. No utilizar sueros hiperlipmicos, hemolizados o
contaminados. Los sueros que presenten partculas pueden ser clarificados
por centrifugacin. Pueden utilizarse muestras de suero o plasma
indistintamente.

uno para el control negativo y dos para el suero cut off. Colocar el resto de
los pocillos en el sobre y volver a cerrarlo.
5.-Para determinacin de anticuerpos IgG aadir 100 l de diluyente de
muestras 2 a todos los pocillos que se vayan a emplear. Aadir 5 l de las
muestras, 5 l del control positivo 3G, 5 l del suero cut off 4G (en
duplicado) y 5 l del control negativo 5G en los pocillos correspondientes.
En el caso de la realizacin manual del mtodo, se agitar la placa en un
agitador (2 minutos) para garantizar una mezcla homognea de los
reactivos. Si no es posible asegurar esta agitacin, debe hacerse una
predilucin de la muestra en tubo o placa aadiendo el doble del volumen
de diluyente de muestras 2 y de muestra. Homogenizar con la pipeta y
trasvasar seguidamente 105 l de cada muestra ya diluida a los pocillos 1.
6.-Para determinacin de anticuerpos IgM aadir 25 l de sorbente IgG
(ref. Vircell S001) a todos los pocillos que se vayan a emplear, excepto a
los pocillos donde se dispensen los controles. Aadir 5 l de las muestras y
seguidamente 75 l de diluyente de muestras 2 a todos los pocillos
empleados. Para la preparacin de los pocillos de los controles, aadir 100
l de diluyente de muestra 2, y seguidamente 5 l del control positivo 3M,
5 l del suero cut off 4M (en duplicado), y 5 l del control negativo 5M
en los pocillos correspondientes. En el caso de la realizacin manual del
mtodo, se agitar la placa en un agitador (2 minutos) para garantizar una
mezcla homognea de los reactivos. Si no es posible asegurar esta
agitacin, debe hacerse una predilucin de la muestra en tubo o placa
aadiendo el doble del volumen de los reactivos y de muestra.
Homogenizar con la pipeta y trasvasar seguidamente 105 l de cada
muestra ya diluida a los pocillos 1.
7.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 45
minutos a 371C.
8.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y
lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9,
asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado.
9.-Aadir inmediatamente 100 l de conjugado IgG 6G o IgM 6M a todos
los pocillos.
10.-Tapar mediante lmina adhesiva e incubar en estufa/bao durante 30
min. a 371C.
11.-Retirar la lmina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y
lavar cada uno de ellos 5 veces con 0,3 ml de solucin de lavado 9,
asegurndose que no quedan restos de solucin de lavado.
12.-Aadir inmediatamente 100 l de solucin de sustrato 7 a todos los
pocillos.
13.-Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, en la oscuridad.
14.-Aadir inmediatamente 50 l de solucin de parada 8 a todos los
pocillos.
15.-Valorar espectrofotomtricamente a 450/620 nm, antes de 1 hora de
acabado el ensayo.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
Cada lote se somete a control de calidad interno antes de su liberacin
asegurando el cumplimiento del protocolo de validacin por el usuario
mediante especificaciones ms estrictas. Los resultados de control final de
cada lote estn disponibles.
La correlacin del material de control se asegura mediante ensayos
paralelos frente a paneles de sueros de referencia internamente validados.
PROTOCOLO DE VALIDACIN POR EL USUARIO:

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS:

El nico reactivo que es necesario preparar con antelacin a la realizacin
de la prueba es la solucin de lavado. Para ello completar hasta 1 litro con
agua destilada un vial de 50 ml de solucin de lavado concentrada (20x).
Si aparecen cristales durante la conservacin de la solucin concentrada,
calentar a 37C antes de diluirlo. Una vez preparada conservar entre 2 y
8C.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
1.-Ajustar una estufa/bao de agua a 371C.
2.-Sacar todos los reactivos 1 hora antes de la realizacin del test para que
alcancen la temperatura ambiente, evitando sacar la placa del envase.
3.-Agitar todos los componentes.
4.-Sacar el nmero de pocillos 1 necesarios para el nmero de sueros que
se van a procesar, ms otros cuatro pocillos, uno para el control positivo,

Cada ensayo debe utilizar control positivo, negativo y cut off. Su

utilizacin permite la validacin de la prueba y el equipo.
Las densidades pticas (D.O.) de los controles deben estar en los rangos
siguientes. En caso contrario se desechar la prueba.
CONTROL
CONTROL POSITIVO
CONTROL NEGATIVO
CONTROL CUT OFF

D.O.
>0,9
<0,5
>0,55
<1,5

PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO

Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

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INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Calcular la media de las D.O. del suero cut off.
ndice de anticuerpos=(D.O. de la muestra/media de D.O. del suero cut off) x 10

INDICE
<9
9-11
>11

INTERPRETACIN
Negativo
Dudoso
Positivo

N MUESTRAS
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
85
98%
97%
IgG
70
97%
97%
IgM (1)
73
88%
100%
IgM (2)
80
97%
92%
IgM (3)
Los valores indeterminados fueron suprimidos de los clculos finales

PRECISIN INTRAENSAYO:

Las muestras con resultados dudosos deben ser vueltas a analizar y/o
solicitar una nueva muestra para confirmacin de los resultados.
Las muestras con ndices inferiores a 9 se considera que no tienen
anticuerpos especficos frente a M. pneumoniae IgG o IgM, segn el
procedimiento empleado.
Las muestras con ndices superiores a 11 se considerar que tienen
anticuerpos especficos frente a M. pneumoniae IgG o IgM, segn el
procedimiento empleado.
LIMITACIONES DEL MTODO:
1.-Este mtodo est diseado para ser utilizado con suero humano.
2.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensin del folleto
de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para
obtener resultados fiables, en particular el correcto pipeteo de muestras y
reactivos, lavados y tiempos de incubacin.
3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la
sintomatologa clnica y otros procedimientos diagnsticos. El diagnstico
definitivo debe realizarse mediante tcnicas de aislamiento.
4.-El test no indica el lugar de la infeccin. No pretende sustituir al
aislamiento.
5.-La ausencia de un aumento significativo en el nivel de anticuerpos no
excluye la posibilidad de infeccin.
6.-Las muestras recogidas muy pronto en el transcurso de una infeccin
pueden no tener niveles detectables de IgG. En esos casos se recomienda
realizar un ensayo para determinacin de IgM u obtener una segunda
muestra transcurridos entre 14 y 21 das para ser ensayado en paralelo con
la muestra original con el fin de determinar una seroconversin.
7.-Los resultados obtenidos en la deteccin de IgG en neonatos deben ser
interpretados con precaucin, ya que las IgG maternas son transferidas
pasivamente de la madre al feto antes del nacimiento. La determinacin de
IgM es mejor indicador de infeccin en nios menores de 6 meses.
8.-Los resultados de determinacin de anticuerpos de una muestra nica no
deben ser usados para el diagnstico de una infeccin reciente. Se deben
recoger muestras pareadas (aguda y convaleciente) para ser ensayadas
paralelamente y determinar seroconversin o un incremento significativo
en el nivel de anticuerpos.
9.-Para la determinacin de IgM se debe realizar la tcnica utilizando
sorbente de anticuerpos IgG humanos ya que de otro modo se pueden
obtener resultados falsos positivos por la presencia de factor reumatoide o
resultados falsos negativos por exceso de anticuerpos IgG.

DETECCIN IgG
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un
nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo
idnticas, obteniendo los resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
2,13
CN
10
10,64
CO
10
5,87
C.V. Coeficiente de variacin

DETECCIN IgM
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente 10 veces cada uno en un
nico ensayo realizado por el mismo operador en condiciones de trabajo
idnticas, obteniendo los resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
5,87
CN
10
9,95
CO
10
5,60
C.V. Coeficiente de variacin

PRECISIN INTERENSAYO:
DETECCIN IgG
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das
consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes
resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
2,20
CN
10
8,32
CO
10
4,71
C.V. Coeficiente de variacin

DETECCIN IgM
Se ensayaron 3 sueros pipeteados individualmente durante 5 das
consecutivos y por 2 operadores diferentes, obteniendo los siguientes
resultados:
SUERO
N
% C.V.
CP
10
4,39
CN
10
10,28
CO
10
6,31
C.V. Coeficiente de variacin

REACCIN CRUZADA E INTERFERENCIAS:

PRESTACIONES
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD:
Determinacin IgG:
Se ensayaron 85 muestras de suero con MYCOPLASMA PNEUMONIAE
ELISA IgG/IgM frente a un equipo ELISA (EIA MYCOPLASMA IgG) de
otra casa comercial (BIOWHITTAKER) para determinacin IgG.
Los resultados discrepantes se resolvieron mediante un test de
inmunofluorescencia.
Determinacin IgM:
Test 1: Se ensayaron 70 muestras frente a un kit de aglutinacin de
partculas (SERODIA-MYCO II) de otra casa comercial (FUJIREBIO
INC.) para determinacin IgM.
Test 2: Se ensayaron 73 muestras frente a un kit ELISA (PLATELIA M.
PNEUMONIAE IgG) de otra casa comercial (BIO-RAD) para
determinacin IgM.
Test 3: Se ensayaron 80 muestras de suero con MYCOPLASMA
PNEUMONIAE ELISA IgM frente a un kit ELISA (MYCOPLASMA
PNEUMONIAE IgM EIA) de otra casa comercial (ANILabsystem) para
determinacin IgM.
Se obtuvieron los siguientes resultados:

Se ensayaron 6 muestras caracterizadas positivas frente a bacterias del

grupo sindrmico (Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae y
Coxiella burnetii) para determinacin IgG e IgM. Se realiz un ensayo
IgM a 2 muestras positivas frente a factor reumatoide.
Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la
reaccin especfica del ensayo sin reaccin cruzada o interferencias
ocasionadas por los agentes descritos.
OTROS ESTUDIOS DE INTERFERENCIAS:
Se realiz un ensayo ELISA para determinacin de anticuerpos IgG e IgM
a 15 sueros con anticuerpos antinucleares y 25 sueros con factor
reumatoide previamente caracterizados frente a 4 kits ELISA diferentes (3
antgenos virales y un antgeno bacteriano). Para determinacin IgM los
sueros fueron tratados con sorbente anti-IgG. Se demostr la eficacia del
tratamiento con sorbente para evitar interferencias en IgM ocasionadas por
factor reumatoide en un 100% y en un 96% para anticuerpos antinucleares.
Se ha comprobado la eficacia del sorbente recomendado para evitar la
aparicin de falsos negativos por exceso de IgG.

PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO

Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Domnguez Ortiz 1. Polgono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712

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BIBLIOGRAFA:

SMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO:

Producto para el diagnstico in vitro
Fecha de caducidad
8C
Conservar entre 2-8C

2C

Contiene suficiente para <X> pruebas

Lote

Referencia (catlogo)

Consultar instrucciones de uso

<X> pocillos

RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO DE TRABAJO

DILUCIN PARA IgG
100 l de diluyente de muestras
2
5 l de las muestras y controles
3G 4G 5G

DILUCIN PARA IgM

MUESTRAS
25 l de sorbente
5 l de las muestras
75 l de diluyente de muestras
2
CONTROLES
100 l de diluyente de muestras
2
5 l de los controles
3M 4M 5M

1. Aubert, G., B. Pozzetto, O. G. Gaudin, J. Hafid, A. D. Mbida, and A.

Ros. 1992. Evaluation of five commercial tests: complement fixation,
microparticle agglutination, indirect immunofluorescence, enzyme-linked
immunosorbent assay and latex agglutination, in comparison to
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(Paris) 50:593-7.
2. Busolo, F., E. Tonin, and G. A. Meloni. 1983. Enzyme-linked
immunosorbent assay for serodiagnosis of Mycoplasma pneumoniae
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human anti-Mycoplasma pneumoniae antibodies in enzyme-linked
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7. Lieberman, D., P. Shvartzman, D. Lieberman, M. Ben-Yaakov, Z.
Lazarovich, S. Hoffman, R. Mosckovitz, B. Ohana, M. Leinonen, D.
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detecting Mycoplasma pneumoniae IgM: comparison with indirect
immunofluorescence and indirect ELISA. J Hyg (Lond) 94:217-27.

45 min. a 37C

5 lavados con solucin de lavado 9

Para cualquier aclaracin o consulta, contactar con:

customerservice@vircell.com

REVISADO: Diciembre-10

6G 100 l de conjugado 6M

30 min. a 37C

5 lavados con solucin de lavado 9

100 l de sustrato 7

20 min. a temperatura ambiente en

oscuridad

50 l de solucin de parada 8

Lectura a 450/620 nm

PRODUCTO PARA DIAGNSTICO IN VITRO

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