Manual de Practicas Bioquimica Clinica Especializada

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOANLISIS
CAMPUS XALAPA
BIOQUMICA CLNICA ESPECIALIZADA
MANUAL DE PRCTICAS
Q.C. CLAUDIA ARRONTE
NDICE
PRESENTACIN DEL CURSO ................................................................................................ 3
INTRODUCCIN ...................................................................................................................... 5
UNIDAD NO. 1 ELECTROLITOS SRICOS ............................................................................ 7
PRACTICA No. 1 DETERMINACIN CUANTITATIVA DE SODIO SERICO ........................ 9
PRACTICA No. 2 DETERMINACIN DE SODIO Y POTASIO ........................................... 11
PRACTICA No. 3A DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CALCIO SRICO ................ 13
PRACTICA No. 3B DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CALCIO SRICO ................. 15
PRACTICA No.4A DETERMINACIN DE MAGNESIO ...................................................... 17
PRACTICA No.4B DETERMINACIN DE MAGNESIO SRICO ...................................... 19
PRACTICA No.5 DETERMINACIN DE CLORURO SRICO ........................................... 21
PRACTICA No. 6 DETERMINACIN DE FSFORO INORGNICO ................................. 23
UNIDAD NO. 2 EQUILIBRIO CIDO BSICO ....................................................................... 25
OBTENCIN DE MUESTRAS SANGUINEAS PARA EXMENES DEL EQUILIBRIO CIDO
BSICO Y GASES SANGUNEOS ......................................................................................... 25
DETERMINACIN DE GASES SANGUNEOS ...................................................................... 27
PRCTICA No. 7 DETERMINACIN DE BICARBONATO SRICO .................................. 28
UNIDAD NO. 3 ANLISIS DE
LQUIDOS
EXTRAVASCULARES (EXUDADOS Y
TRASUDADOS). ..................................................................................................................... 30
PRCTICA No. 8 ANLISIS DE EXUDADOS. ................................................................... 32
EXAMEN FSICO ............................................................................................................. 32
EXAMEN QUMICO ......................................................................................................... 33
EXAMEN MICROSCPICO ............................................................................................. 35
PRACTICA No. 9 ANLISIS DE TRASUDADOS ................................................................ 39
EXAMEN FSICO ............................................................................................................. 39
EXAMEN QUMICO ......................................................................................................... 40
CORRELACIN
DE
ALGUNAS
CARACTERISTICAS
FISICOQUMICAS
MICROSCPICAS DE LQUIDOS EXTRACELULARES. ..................................................... 44

UNIDAD NO. 4 ANLISIS DE LQUIDO CEREBROESPINAL ............................................... 48
1
PRCTICA NO. 10 ANLISIS DE LQUIDO CEFALORRAQUIDEO .................................. 51

EXAMEN FSICO ............................................................................................................. 51
EXAMEN QUMICO ......................................................................................................... 53
EXAMEN MICRSCOPICO ............................................................................................. 59
EXAMEN MICROBIOLGICO ......................................................................................... 63
EXAMEN INMUNOLGICO ............................................................................................. 64
UNIDAD NO. 5 ANLISIS DE CLCULOS ............................................................................ 67
PRCTICA No 11 ANLISIS DE CLCULOS BILIARES ................................................... 69
PRCTICA No 12 ANLISIS DE CLCULOS URINARIOS ............................................... 73
UNIDAD NO. 6 ANLISIS DE LQUIDO SEMINAL ................................................................ 77
OBTENCIN DE LA MUESTRA PARA ESPERMATOBIOSCOPA DIRECTA ...................... 78
PRCTICA No. 13 ANLISIS DE LQUIDO SEMINAL ....................................................... 79
EXAMEN FSICO ............................................................................................................. 79
EXAMEN QUMICO ......................................................................................................... 81
PRCTICA No. 14 COMPROBACIN DE PRESENCIA DE SEMEN EN MATERIAL
PROCEDENTE DE VAGINA, PIEL, PELO Y ROPA. .......................................................... 92
ESPERMATOBIOSCOPA FUNCIONAL INDIRECTA ........................................................ 94
PRESENTACIN DEL CURSO
La Bioqumica Clnica es una disciplina que tiene como finalidad proporcionar informacin til
al mdico para describir cambios normales o patolgicos que ocurren en los individuos estudiados.
Esta informacin se apoya en anlisis de laboratorio mediante la utilizacin de mtodos analticos
discriminativos colorimtricos, cromatogrficos, electroforticos, citolgicos, entre otros, que nos
ayudan a establecer las condiciones ptimas para determinar cuali o cuantitativamente un compuesto
orgnico y al mismo tiempo comprender el mecanismo de la reaccin qumica en progreso.
El curso de Bioqumica Clnica Especializada contempla tres elementos principales:
I.
Anatoma y fisiologa normal del sistema tisular
II. Mecanismos fisiopatolgicos para comprender e interpretar los datos de

laboratorio
III. Mtodos y tcnicas de anlisis de muestras biolgicas, as como factores que
afecten los resultados
Los primeros dos elementos se revisan en la clase terica, empleando diversas tcnicas de
enseanza aprendizaje tales como investigacin referencial, lectura, sntesis e interpretacin de
informacin, bsqueda y discusin de casos clnicos, interpretacin de resultados, entre otras. La
parte analtica se presenta en este Manual de prcticas de laboratorio, el cual est organizado en
ocho captulos de acuerdo al programa acadmico vigente de Bioqumica Clnica Especializada, de la
Facultad de Bioanlisis, se incluyen:
I.
Anlisis de agua y electrolitos
II. Pruebas de Equilibrio cido base

III.
Anlisis de lquidos biolgicos (Exudados y Trasudados)
IV. Anlisis de Lquido Cerebroespinal

V.
Anlisis de Clculos Urinarios y Biliares
VI. Perfil de Fertilidad

VII. Anlisis de Lquido Amnitico
VIII. Perfiles hormonales
El propsito de este Manual es poner al alcance de los estudiantes de la carrera de Qumica
Clnica una gua que exponga en forma ordenada las pruebas de laboratorio, los fundamentos, las
tcnicas, el material, los reactivos y el equipo e instrumentacin empleados en el curso de Bioqumica

Clnica Especializada as mismo se permite disponer de informacin para explicar su importancia en
el diagnstico clnico. Adems permite organizar la cantidad de material y de los reactivos necesarios
para que las prcticas de laboratorio estn provistas de ellos anticipadamente, as como para mejorar
el funcionamiento de los laboratorios y poder considerarlos adecuadamente en el presupuesto de
insumos anuales.
En sus pginas el alumno encontrar un material til para su preparacin profesional, las
tcnicas en este Manual se seleccionaron en base a su simplicidad operativa, eficacia y grado de
reproducibilidad aceptables.
Considerando que la Bioqumica Clnica est en continuo avance cientfico, sumado a la
importancia que tiene en el campo mdico, este manual no debe ser considerado un curso terminal,
el qumico clnico para mantenerse al corriente deber examinar constantemente literatura
actualizada por el resto de su vida profesional.
INTRODUCCIN
La Qumica Clnica ha progresado sustancialmente gracias a la introduccin de nuevos
mtodos y tcnicas de trabajo. El desarrollo de la automatizacin se refleja en la multiplicacin de los
aparatos utilizados. Son grandes los esfuerzos que se hacen porque los mtodos logren niveles
ptimos de eficiencia y calidad, hecho que permite comparar fcilmente los resultados del laboratorio
clnico.
Los hallazgos de laboratorio como resultado de un anlisis qumico clnico deben utilizarse en
el diagnstico, como informacin fidedigna y significativa. Para lograr una aproximacin algo mayor
respecto a la interpretacin clnica de los parmetros empleados, se sugiere abordar brevemente la
fisiologa, la fisiopatologa, as como la semiologa de las determinaciones revisadas en este Manual;
Esto permitir al estudiante orientarse rpidamente respecto a la importancia diagnstica de la
prueba, al mismo tiempo contribuir a intensificar slidamente los comentarios del tema en el grupo,
hecho que facilitar el futuro profesional de los egresados como participantes de equipos de salud en
la presentacin de casos clnicos o trabajos de investigacin.
Este Manual no pretende ser integral, en la eleccin de la mayor parte de las tcnicas fue
determinante el punto de vista prctico en concordancia con la frecuencia de los anlisis y la
posibilidad de ejecucin prctica de los mtodos en el propio laboratorio de Bioqumica Clnica
Especializada.
La conservacin o el restablecimiento de los problemas de salud son el resultado de la
participacin ordenada y dirigida de un equipo multidisciplinario de profesionales de la salud
capacitados cientficamente. De tal forma, que las actividades de enseanza aprendizajes elegidos en
este curso se espera que contribuyan a la preparacin de Qumicos Clnicos altamente capacitados.
El continuo avance de la ciencia y la tecnologa ha de permitir que este trabajo pueda ser
mejorado y corregido, de tal manera que los elementos que persistan sean como parte de una
tradicin cientfica-acadmica que promueva el proceso evolutivo del estudiante.
FUNDAMENTACIN DE LA EXPERIENCIA EDUCATIVA

El incremento de las enfermedades relacionadas con alteraciones de electrolitos, hormonas,
fluidos extravasculares y otros materiales biolgicos propician riesgos a la salud de gran
trascendencia, aun no ponderados adecuadamente, ya que ocasionan un deterioro lento y progresivo
del individuo enfermo. La naturaleza y el origen de las diferentes entidades patolgicas pueden
identificarse
realizando exmenes de laboratorio de forma regular lo que permitir detectar
oportunamente cambios que permitan identificar causa y adoptar medidas teraputicas adecuadas
para disminuir el riesgo de lesiones ms severas e irreversibles, de esta forma se mejorar la
supervivencia y calidad de vida de la poblacin afectada.
La aplicacin y el manejo apropiado de metodologas analticas para el procesamiento de
muestras biolgicas de origen humano, permitir al Qumico Clnico su participacin activa como
integrante del equipo de salud de la comunidad contribuyendo en la preservacin, conservacin y
restablecimiento de la salud. Para ello el estudiante deber integrar los conocimientos tericos y
prcticos de tal forma que maneje convenientemente las metodologas analticas de inters mdico,
as como la interpretacin clnica de las pruebas, con alto contenido de responsabilidad y tica
profesional.
RELACION DE LA EXPERIENCIA EDUCATIVA CON OTRAS DEL

PLAN DE ESTUDIOS
La Bioqumica Clnica Especializada est relacionada con todas las experiencias educativas
dentro del rea de la Qumica Clnica, en particular en cuanto a nomenclatura y fisicoqumica de
lquidos orgnicos, con la Qumica Bsica, los mtodos de anlisis, con Microbiologa, Inmunologa y
Gentica, la primera como soporte para la comprensin y aplicacin de mtodos para identificacin
de agentes infecciosos (en exudados y trasudados), la segunda en lo relativo a isoinmunizacin
materna, la tercera por lo factores hereditarios asociados a eventos patolgicos, en la estimacin del
estado fetal, o en otros procesos de disfuncin orgnica del mismo origen, son solo algunos ejemplos.
OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA

1. Introducir al alumno en la aplicacin de mtodos qumicos para la determinacin srica de
electrolitos y analitos del equilibrio cido- bsico, relacionando los diferentes trastornos
producidos por los cambios de sus concentraciones.
2. Aplicar de manera eficiente el total de pruebas fsicas, qumicas, citolgicas y bacteriolgicas,

que conformen el protocolo formal para el anlisis y diferenciacin de lquidos extravasculares.
3. Analizar por mtodos fisicoqumicos diversos clculos urinarios y biliares, estableciendo la
trascendencia diagnstica de los resultados.
4. Conocer pruebas femeninas y masculinas del perfil de fertilidad discutiendo los aspectos
metodolgicos.
5. Describir padecimientos frecuentes que conduzcan a cambios fisicoqumicos y citolgicos del
lquido amnitico as como la utilidad de las pruebas de laboratorio empleados en la estimacin de
edad gestacional, sufrimiento fetal y defectos o ruptura de membrana fetales.
6. Aplicar los parmetros bioqumicos hormonales tiroideos y paratiroideos precoces y tardos en el
diagnstico y pronstico de lesiones endocrinas.
UNIDAD NO. 1 ELECTROLITOS SRICOS

El diagnstico y tratamiento correctos de los trastornos de los lquidos y electrolitos dependen
de la comprensin de los procesos que controlan el volumen, la distribucin y la composicin de ellos.
Se debe considerar adems la accin farmacolgica y fisiolgica de algunos componentes de los
lquidos orgnicos.
Los iones sodio y potasio (junto con los cloruros y el bicarbonato) constituyentes de los
lquidos corporales juegan un papel muy significativo en el mantenimiento normal de la distribucin
del agua entre las clulas, el plasma y el lquido intersticial, porque de ellos depende la presin
osmtica. Adems de su influencia en la distribucin del agua corporal, el sodio y el potasio tambin
desempean otro papel muy importante pues permiten un ambiente favorable para la contraccin
muscular normal.
En la clnica la medicin de la concentracin de electrolitos en los lquidos biolgicos se
expresa en miliequivalentes por litro y otras unidades convencionales. Los depsitos de los lquidos
en el organismo incluyen: el lquido extracelular (constituido por el plasma espacio intravascular- y
el lquido intersticial espacio intercelular-) y el lquido intracelular, adems no hay que perder de
vista que tambin se distribuyen en tejidos conjuntivos densos como hueso y espacios transcelulares,
pero estos normalmente no participan en situaciones de las alteraciones de los lquidos orgnicos.
Las determinaciones electrolticas de importancia clnica que en esta unidad se revisan son
cationes monovalentes y divalentes como el Sodio (Na+1), el Potasio (K+1), el Calcio (Ca+2) y al
Magnesio (Mg+2); y los aniones como los Cloruros (Cl-1), los Fosfatos (PO4-3), los Sulfatos (SO4-2) y
los cidos orgnicos (lctico y pirvico) .
CONDICIONES DE EMBALAJE.
1. Considerar requisitos habituales para obtencin de muestras biolgicas
a) Paciente en condiciones ptimas (ayuno mnimo de 4 a 8 hs)
b) No ejercicio fsico intenso
c) No dietas complejas
d) No tratamientos medicamentosos complejos
e) No alcohol
f) No tabaquismo
g) No vigilia
2. Se prefiere suero y no plasma
3. El material de obtencin, conservacin y procesamiento debern estar excesivamente limpios, de
preferencia nuevos (libres de residuos para evitar interferencias qumicas) y/o de plstico
4. Separe rpidamente suero del paquete celular, antes de los primeros 30 minutos y consrvelo
libre de clulas a temperatura ambiente es estable hasta por 2 semanas.
5. Evite hemlisis, lipemia e ictericia.
6. Considerar que los mtodos titrimtricos son poco exactos, por lo que habr que hacer las
determinaciones por triplicado.
7. Interferencias qumicas: (diurticos, tiacidas, furosemidas), glucocorticoides, aldosterona,
antibiticos (que se eliminan como aniones (carbenicilina y ticarcilina) producen disminucin en la
concentracin de Na y K.
8.
Interferencias biolgicas: Trauma reciente, ciruga o shock, consumo de grandes o pequeas

cantidades de sal o lquidos, lquidos intravenosos con contenido de sodio, Uso de diurticos u
otros medicamentos
PRCTICA No. 1
DETERMINACION CUANTITATIVA DE SODIO SERICO
MTODO COLORIMTRICO- PRECIPITACIN DE ALBANASE Y LEIN.
FUNDAMENTO
El sodio se precipita en forma de acetato sdico de Uranilo y Zinc desarrollando un color amarillo que es
proporcional a la concentracin de sodio en la muestra biolgica
REACTIVOS:
1.
2.
3.
4.
ACETATO DE URANILO Y ZINC

ETANOL AL 95%
CIDO TRICLOROACTICO AL 10%
SOLUCIN PATRN DE SODIO (139 mmol/l = 0.64 mg Na / ml)
MATERIAL, EQUIPO E INSTRUMENTACIN
MATERIAL PARA TOMA DE MUESTRA
tubos de ensaye de 13 x100 mm
pipeta Pasteur con bulbo
ligadura plana
torundas de algodn con alcohol
Centrfuga
MATERIAL PARA LA PRUEBA:

5
tubos de ensaye de 13x 100 mm
pipetas lineales de 10 ml
pipetas de 1.0 ml
gradilla
Papel filtro
INSTRUMENTACIN
Centrfuga
Espectrofotmetro
TECNICA
1. En un tubo de ensaye coloque 0.5 ml de suero libre de clulas y agregue 2 ml de cido
tricloroactico al 10%, mezcle y deje reposar por 5 minutos, centrifugue y separe sobrenadante.
2. Marque tres tubos como D, T y B, coloque lo siguiente
P
3. Mezcle y
deje
Desproteinizado (ml)
0.5
Solucin patrn (ml)
0.5
en
refrig
eraci
Agua destilada
(ml)
0.5
Acetato de uranilo y Zinc (ml)
1.0
1.0
1.0
n por espacio de 01 hora

4. Centrifugue (3000 rpm x 10 minutos) y decante cuidadosamente los tubos eliminando por completo el
sobrenadante y dejando todos los tubos invertidos varios minutos sobre el papel filtro
5. Lave las paredes de los tubos con 2.0 ml de etanol al 95%, agite y resuspenda el precipitado, centrifugue y
descarte el sobrenadante, como el paso anterior.
6. El precipitado se disuelve con 5.0 ml de agua destilada (si la solucin resultante es turbia repita el
centrifugado), lea la Densidad ptica (D.O.) a 430 nm contra B
CALCULOS
D. O. P
D.O. E
- D. O. B
- D.O. B
X 0.32 X 100
0.1
___ mg % de Na
0.32 = REPRESENTA LA CONCENTRACION EN mg% de Na DE 0.5 ml DEL ESTANDAR

D. O. P - D. O. B
D. O. E - D .O. B
x 139
_ __ meq Na /l
VALORES DE REFERENCIA
Sodio srico de 135 a 155 meq/l 310 a 356 mg %
10
PRCTICA No. 2
DETERMINACIN DE SODIO Y POTASIO
POR ESPECTROFOTOMETRA DE LLAMA.
En la actualidad las determinaciones de sodio y potasio deben hacerse empleando mtodos
automatizados, pues son lo que ofrecen especificidad y sensibilidad, mientras que los mtodos manuales
sacrifican estas cualidades por facilidad tcnica.
El funcionamiento del fotmetro de flama, consiste en atomizar una muestra liquida hacindola pasar a
presin mediante corriente de aire hacia una flama no luminosa, la flama desarrolla dos funciones primero
calcina la muestra exhibiendo as los tomos de todos los constituyentes del suero y segundo, la energa
calorfica es absorbida por cada tomo de los elementos qumicos presentes que favorece un cambio de estado
atmico basal a uno excitado, en el cual sus electrones cambian de nivel energtico a otro de mayor energa,
inmediatamente esta energa es liberada como energa luminosa (fotn) de tal forma que el electrn regresa a
su nivel energtico basal. Cada elemento qumico emite su propio espectro (fotn en determinada longitud de
onda), esta luz emitida (espectrofotometra de emisin atmica) por el elemento qumico, es captada o recibida
por una fotoclula y convertida en seal elctrica cuya intensidad es medida en un galvanmetro comn. La
variacin de la seal elctrica expresar la concentracin del elemento qumico en cuestin.
10
MTODO DE FLAMOMETRA.
FUNDAMENTO
En el anlisis de sodio y potasio por fotometra de flama, la muestra es aspirada por medio de un
nebulizador que descarga la muestra en forma de aerosol (atomizada) a una flama. Los tomos de sodio son
excitados por dicha flama a un nivel de energa mayor. Al regresar a su estado fundamental basal emiten la
energa en forma de luz de una longitud de onda de 589 nm que es especfica para el anlisis de este elemento.
La luz pasa a travs de un filtro o un monocromador, que selecciona la longitud de onda de la luz emitida por
los tomos del sodio. La luz pasa a un detector de tipo foto tubo integrado al sistema de lectura que puede ser
digital o analgico. La intensidad de la luz emitida y la respuesta elctrica del detector, son directamente
proporcionales a la concentracin del sodio.
11
Figura no. 1. Principio de Medicin de Fotmetro de Flama.
10
Las partculas que contiene la muestra pueden tapar el mechero, por lo que se recomienda filtrar esta
antes de su anlisis. El calcio y el potasio pueden causar interferencias si se encuentran en mayor cantidad que
el sodio, 5:1 en el caso del potasio y 10:1 en el caso del calcio.
Para minimizar el problema de las
interferencias, se recomiendan las siguientes acciones:

1. Diluir las muestras, para analizarlas en un rango bajo de sodio
2. Utilizar la tcnica de las adiciones estndar o de estndar interno
3. Adicin de cantidades iguales de los cationes que interfieren a los estndares de calibracin
4. Utilizar agua destilada y desionizada, del tipo II espec. ASTM D 1193-91
REACTIVOS
LOS SEALADOS EN LA TECNICA DE ACUERDO AL INSTRUMENTO MANEJADO
MATERIAL
NECESARIOS PARA EL EQUIPO
TECNICA
OBSERVACIONAL
INVESTIGACION REFERENCIAL
Adultos:
135 a 145 mmol / l o meq / l
12
PRCTICA No. 3A
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CALCIO SRICO
MTODO COLORIMTRICO Y DE PRECIPITACIN (cido Cloranlico).
FUNDAMENTO:
El cido Cloranlico (2,5-dicloro-3,6-dihidroxi-2,5-ciclohexadieno-1,4-diona) precipita al Calcio presente
en la muestra biolgica, formando cloranilato de calcio, el cual se disuelve con solucin de EDTA y forma
cloranilato de sodio soluble de color rosa. La intensidad del color es directamente proporcional a la
concentracin de Calcio en la muestra. El alcohol isoproplico elimina el
precipitado.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
CIDO CLORANLICO
SOLUCION DE EDTA AL 6%
ALCOHOL ISOPROPLICO AL 50%
SOLUCION ESTANDAR DE Calcio de 10 mg%

4
ligadura plana
Centrfuga
MATERIAL PARA LA PRUEBA

5
pipetas de 1.0 ml

gradilla
papel filtro
MATERIAL PARA LA CURVA DE CALIBRACIN

12
pipeta lineal de 10 ml
Pipeta lineal de 5 ml
13
exceso de cido cloranlico del
INSTRUMENTACIN
Centrfuga
Espectrofotmetro
Bao Mara a 37C
TCNICA
1. En un tubo de ensaye coloque 2 ml de suero. Aada 1 ml de Acido Cloranlico. Mezcle SIN INVERTIR. Deje
reaccionar durante 30 minutos, 15 minutos a 37C
2. Centrifugue a 2800 rpm por 10 min (optimice tiempo y velocidad)
3. Decante el lquido sobrenadante y deje reposar durante 3 minutos sobre papel filtro. Seque la boca del tubo
con el papel filtro.
4. Lave el precipitado con 5 o 7 ml de alcohol isoproplico
5. Centrifugue y elimine el sobrenadante de la misma forma anterior
6. Aada al precipitado 2 gotas de EDTA y resuspenda PERFECTAMENTE el precipitado
7. Aada 6 ml de solucin de EDTA tape tubo y agite por inversin hasta solubilizar precipitado totalmente. Es
recomendable mezclar por unos minutos. No debe presentar turbidez (de hacerlo
significa lavado
inadecuado con isoproplico). Deje reaccionar por 10 minutos a TA.

8. Lea a 520 nm ajustando a 0 de Absorbancia con B de agua destilada.El color es estable por hasta 60
minutos.
9. Interpole en la curva de calibracin para encontrar concentracin.
VALORES DE REFERENCIA:
Calcio srico de 8.5 a 10.5 mg%
4.2 a 5.2 meq/l
CURVA DE CALIBRACION
A) COLOQUE EN TUBOS MARCADOS
TUBO
#
1
2
3
4
5
AGUA
DESTILADA (ml)
6.0
4.5
4.0
3.5
3.0
SOLUCION
ESTANDAR Ca (ml)
0.0
1.5
2.0
2.5
3.0
CONCENTRACION
FINAL (mg%)
0
7.5
10.0
12.5
15.0
ABSORBANCIA
B) CONTINE CON EL PROCEDIMIENTO A PARTIR DEL PASO NO.1 MANEJE LAS

ESTANDAR COMO SI FUERAN SUEROS PROBLEMAS.
14
SOLUCIONES
PRCTICA No. 3B
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CALCIO SRICO
MICROMTODO DE DIEHLS ELLINGBOE.
FUNDAMENTO
Se titula una muestra de suero diluido con una solucin de etilen-diamino tetra acetato disdico,
en presencia de calcena como indicador a un pH alcalino para evitar interferencia del Magnesio-. La
fluorescencia inicial verde-amarillenta originada por el complejo calcena-calcio cambia a color rosa salmn no
fluorescente (de calcena libre) cuando todo el calcio ha formado quelato con el EDTA.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
SOLUCION PATRN DE CALCIO (10 mg%)

SOLUCION DE KOH 1.25 N
SOLUCION INDICADORA DE CALCENA
SOLUCION DE EDTA 0.02N

4
ligadura plana
Centrfuga
matraces Erlen Meyer de 25 ml
pipetas lineales de 0.2 ml (1/10)
pipetas de 2.0 ml (1/100) microbureta

gradilla
INSTRUMENTACIN
Centrfuga
15
TCNICA
1. Se llena una microbureta con solucin de EDTA
2. Se preparan 3 celdillas de plstico ( cpsulas de porcelana) rotuladas como B, P y D, para blanco, patrn y
desconocido respectivamente para la titulacin con el siguiente contenido:
B
Agua desionizada (ml)
0.200
Patrn de calcio (ml)
0.200
Suero libre de clulas (ml)
0.200
Solucin de KOH 1.25N (ml)

Solucin indicadora de calcena (ml)
1.0
1.0
1.0
0.100
0.100
0.100
3. Se valoran B, P y D con EDTA. La desaparicin de la fluorescencia verde amarillenta y la aparicin de color

rosa salmn (rojo anaranjado) indican el punto final de la titulacin.
CLCULOS
ml gastados de EDTA en D - ml gastados de EDTA en B
x 10 = mg % Ca srico
ml gastados de EDTA en P - ml gastados de EDTA en B
mg Ca %
= meq/l Ca srico
VALOR DE REFERENCIA
Calcio srico de 8.8 a 10.5 mg%
16
PRCTICA No.4A
DETERMINACIN DE MAGNESIO
MTODO COLORIMTRICO DE NELL Y NELLY.
FUNDAMENTO
El Magnesio se valora con amarillo de titn utilizndose un polmero de alto peso molecular (goma
gutta, hidroxilamina, gelatina, alcohol polivinilo, goma arbiga) como coloide protector, lo que permite una
estabilizacin de la coloracin durante dos horas. Para eliminar la interferencia de Calcio se usa como blanco
una solucin de cloruro de calcio.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
SOLUCIN COLOIDE (GOMA GUTTA) AL 0.1 %

SOLUCIN AMARILLO TITN DE 50% mg %
SOLUCIN ESTNDAR 1 mg/ ml de Mg
SOLUCIN DE CLORURO DE CALCIO:
SOLUCIN DE TUNGSTATO DE SODIO AL 10 %.
CIDO SULFRICO 0.66 N. ( 2/3 N)
HIDRXIDO DE SODIO 4 N.
AGUA DESTILADA

4
ligadura plana
Centrfuga

4
gradilla
MATERIAL PARA LA CURVA DE CALIBRACIN

6
INSTRUMENTACIN
Centrfuga
Espectrofotmetro
17
TCNICA
1. En un tubo de ensaye se coloca 1 ml de suero, aadir 5 ml de agua destilada, 2 ml de tungstato, 2 ml de
H2SO4 2/3 N mezcle, repose por 10 min y centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos.
B
Suero desproteinizado (ml)
Agua destilada (ml)
CaCl2 (ml)
Solucin estndar (ml)
Solucin coloide (ml)
Sol. amarillo titn (ml)
NaOH 4N (ml)
2. Mezcle y lea contra B con filtro verde a 530 nm

CALCULOS
D. O. del P
X 0.005 X 100 = ______
D. O, del E
mg % de Mg
Donde 0.005 = Concentracin del Estndar

100 ml = volumen de expresin de resultados (en mg%)
5 ml = volumen real de uso de Suero, Estndar
Adultos
1.9 a 2.77 mg% de Magnesio srico

1.3 - 2.1 meq/l o 0.65 - 1.05 mmol/l
18
PRCTICA No.4B
DETERMINACIN DE MAGNESIO SRICO
MTODO COLORIMTRICO DE SPARE.
FUNDAMENTO
En solucin muy alcalina, el magnesio del suero forma partculas coloidales de Mg(OH)2. El colorante
amarillo titn (amarillo de tiazol) se absorbe sobre estas partculas formando un complejo coloreado rojizo, el
cual se estabiliza con alcohol polivinilo, que acta tambin como intensificador del color en las soluciones
patrones sin protenas, en las soluciones problemas las
globulinas actan como intensificadores del color. Por ocupar una pequea cantidad del suero, no es necesario
precipitar a las protenas, lo que significara prdida de magnesio sobre el precipitado.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
5.
SOLUCIN PATRN DE Mg 2.5 mg%

REACTIVO DE ALCOHOL POLIVINILO AL 0.1 %(P/V)
REACTIVO DE AMARILLO TITN
SOLUCIN DE NaOH 7.5%
AGUA DESTILADA

4
ligadura plana
Centrfuga

5
pipetas lineales 0.2 ml (1/10)

gradilla
INSTRUMENTACIN
Espectrofotmetro
19
TCNICA
1. Coloque en tubos marcados como
B
Suero (ml)
0.2
Agua destilada (ml)
3.0
2.8
Solucin estndar de Mg (ml)
2.0
1.0
Solucin alcohol polivinlico (ml)
0.5
0.5
0.5
Sol. amarillo titn (ml)
0.5
0.5
0.5
NaOH 7.5% (ml)
1.0
1.0
1.0
3. Entre cada adicin de reactivos se mezclar adecuada y suavemente. Dejar reposar 5 minutos a
temperatura ambiente.
4. Leer las absorbancias de los tubos contra el B a 540 nm.
CALCULOS
D. O. del P
X 0.005 X 100 = ______
D. O, del E
mg % de Mg
D. O. del P
X 2.5
= ______
mg % de Mg
D. O, del E
Adultos
1.8 a 2.9 mg%
1.5 a 2.4 meq/l
20
PRCTICA No.5
DETERMINACIN DE CLORURO SRICO
MTODO TITRIMTRICO DE SCHALES Y SCHALES.
FUNDAMENTO
Las muestras son tituladas con una solucin de nitrato de mercurio en presencia del indicador
difenilcarbazona. Los iones mercricos se combinan con los iones cloruro de la muestra formando cloruro
mercrico no disociado y soluble. El exceso de los iones mercricos se combina con el indicador, formando un
complejo de color azul- violeta.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
DIFENILCARBAZONA
NITRATO MERCRICO
SOLUCIN TIPO CLORO 0.01N
AGUA DESTILADA
MATERIAL EQUIPO E INSTRUMENTACIN

4
ligadura plana
Centrfuga

5
pipeta lineal de 0.2 ml (1/10)

Gradilla, perilla
21
TCNICA
1. Coloque en matraces marcados:
B
Suero (ml)
0.2
Agua destilada (ml)
2.0
2.0
Solucin estndar de Cloro (ml)
2.0
0.2
Difenilcarbazona indicador (gotas)
2-5
2-5
2-5
2. Titular los matraces con la solucin de Nitrato mercrico hasta el punto final de viraje hasta color azul
violceo permanente por 15 segundos.
3. El volumen gastado de la solucin de Nitrato mercrico con el estndar deber ser de 1 ml exactamente.
4. Al adicionar las primeras gotas puede ocurrir un falso vire que desaparecer des pues de agregar algunas
mas; no as en el vire final, donde el color violeta reaparecer y permanecer con nuevas adiciones de
nitrato de mercurio
CLCULOS:
Cloruros (meq / l) = ml de Nitrato mercrico gastados en P x 100
ml de Nitrato mercrico en E
VALOR DE REFERENCIA
Cloruros sricos de 92 a 109 mmol/l
22
PRCTICA No. 6
DETERMINACIN DE FSFORO INORGNICO
MTODO COLORIMTRICO CON VERDE DE MALAQUITA.
FUNDAMENTO
Los colorantes bsicos (verde de malaquita) reaccionan con el fosfomolibdato constituyendo un
complejo coloreado cuyo espectro es diferente al pigmento original y es directamente proporcional a la cantidad
de fsforo inorgnico en el suero.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
SOLUCIN DE UREA 6 mol/l

REACTIVO VERDE DE MALAQUITA
SOLUCIN ESTNDAR DE FSFORO 5 mg DE FSFORO /100 ml (1.61 mmol/l).
AGUA DESTILADA

4
ligadura plana
centrfuga

5

Gradilla, perilla
INSTRUMENTACIN
Espectrofotmetro
23
TECNICA
1. Coloque en tubos marcados:
B
Suero (ml)
0.02
Agua destilada (ml)
0.02
Solucin estndar de fsforo (ml)
0.02
Solucin urea (ml)
Verde de malaquita (ml)
2. Considerar que entre cada adicin de reactivos hay que mezclar. Despus de la ltima adicin deje reposar
20 minutos a temperatura ambiente.
3. Leer la Extincin de P, B, y E contra blanco de agua a 578 nm. Color estable 01 hora.
CALCULOS
Concentracin =
EP - EB
5 = ______mg%
1.61 = _____ mmol/l
EE - EB
Concentracin =
EP - EB
EE - EB
Adultos de
1.74 4.00 mg% 0.65 1.29 mmol/l
24
UNIDAD NO. 2 EQUILIBRIO CIDO BSICO

El mantenimiento de la concentracin de hidrogeniones en niveles lo ms constantes posibles
es una condicin de mayor importancia para la buena conservacin de la vitalidad celular. Al avanzar
la evolucin biolgica fue limitndose ms y ms la zona ptima de la concentracin de hidrogeniones
necesaria para el desarrollo de los procesos bioqumicos. En el ser humano esa concentracin es de
unos 80 mmol/l a nivel intracelular. Teniendo en cuenta que en las formas superiores de vida mucho
es mayor el peligro de intoxicacin por H+ que el existente por OH- parece significativo que los valores
de referencia plasmticos y del compartimiento extracelular en general sean menores que los del
espacio intracelular. A nivel sanguneo, la concentracin normal de hidrogeniones oscila entre 35 y 42
mmol/l, equivalente a un valor de pH sanguneo de 7.38 a 7.45. La concentracin de hidrogeniones
en sangre proporciona una informacin til acerca de la situacin a nivel intracelular, por lo que la
determinacin del pH es absolutamente indispensable en aquellos enfermos en los cuales se desea
un examen exacto de su equilibrio cido-base.
La determinacin que se revisar en el laboratorio es la cuantificacin de bicarbonato srico.
OBTENCION DE MUESTRAS SANGUINEAS PARA EXAMENES DEL

EQUILIBRIO CIDO-BSICO Y GASES SANGUINEOS
1. OBTENCIN DE MUESTRA SANGUINEA.
A) Sangre arterial.
Indudablemente los resultados ms exactos se obtienen mediante la extraccin de sangre arterial a
partir de las arterias braquial, radial o femoral, los resultados algo diferentes se obtienen por puncin de la
arteria yugular. La extraccin sangunea se ejecutar en condiciones anaerobias.
B) Sangre Capilar Arterializada.

Este tipo de muestra puede extraerse del pulpejo del dedo, del lbulo de la oreja o del taln. La
arterializacin es una expresin mal escogida, que significa aumento de la perfusin sangunea inducida por
calentamiento (5 minutos a 45 C) o por accin medicamentosa (trafuril o priscol), de modo tal que la sangre
as obtenida sea de composicin qumica lo ms similar posible a la arterial.
El pinchazo debe ser lo suficientemente profundo para que la sangre fluya libre y rpidamente, las
primeras gotas de sangre deben desecharse, si se oprime o se ordea la zona de extraccin se obtienen
resultados falsos.
25
2. JERINGAS O RECIPIENTES DE EXTRACCION.
A. Jeringas de plstico desechables.

Estarn perfectamente selladas, el calibre de la aguja puede variar de 20, 21 x 32 38 mm, sin
embargo pueden emplearse calibres desde 19 hasta 25, sin producir modificacin en la calidad de la muestra.
Para eliminar espacios vacos se utilizar una solucin de 1000 unidades de heparina sdica que ocupar el
espacio entre la aguja y la jeringa.
B. Sistemas anaerobios.
Consisten en tubos al vaco heparinizados, sin embargo debe tenerse presente que deben llenarse
totalmente dado que de lo contrario se produce una cada de pCO2 y un ascenso de pH.
B. Capilares heparinizados.
El tamao de los capilares se ajusta a los requerimientos del equipo automatizado empleado.
3. CONSERVACION DE MUESTRAS
La muestra empleada para determinaciones de gases sanguneos ha de ser procesada
inmediatamente, de lo contrario deber conservarse en refrigeracin hasta por 20 minutos, tomando en cuenta
que los valores pueden variar hasta en un 10%.
Las muestras con elevado nmero de leucocitos modifican los resultados.
26
DETERMINACIN DE GASES SANGUNEOS

Fundamento del Gasmetro.
El electrodo de vidrio sensible al pH es el ms eficaz de los medios disponibles para efectuar
mediciones concernientes a la actividad de iones hidrgeno expresado como pH. El principio que rige la funcin
del electrodo se basa en el desarrollo de un potencial elctrico sobre una membrana de vidrio sensible. Este
potencial
es igual a la diferencia de pH existente entre dos soluciones separadas por una membrana
semipermeable.
Todos los electrodos de vidrio para mediciones de pH son muy semejantes desde el punto de vista de
construccin. Una solucin de la que se conoce su valor constante de pH, est en contacto con la superficie de
la membrana de vidrio sensible al pH, mientras que la solucin cuyo valor de pH se desconoce est en contacto
con la otra membrana externa.
Entre las dos superficies de la membrana de vidrio se desarrolla una diferencia de potencial elctrico
que es proporcional a la diferencia de pH existente entre las dos soluciones. Puesto que una de las soluciones
tiene un valor de pH constante, el potencial que desarrolla representa el valor de la otra.
Para medir este potencial se introduce un conductor -electrodo- en la solucin con pH constante y otro
electrodo en la solucin con pH desconocido. Las dos terminales o electrodos se conectan al indicador de pH
que es en realidad un medidor de minivoltios calibrado en unidades de pH. El electrodo introducido en La
solucin de pH constante es un alambre de plata.
El electrodo externo o de referencia suele ser de tipo de Calomel (mercurio/ cloruro de mercurio), su
funcin es generar un potencial de referencia constante contra el cual se pueda comparar variaciones en
potencial en la membrana de vidrio del pH.
El electrodo de referencia se debe mantener protegido de contaminacin por las muestras, para lo cual
es colocado en un depsito por separado que se sumerge en la solucin con pH desconocido. Dicha solucin
entre en contacto con el electrodo nicamente a travs de una separador de cermica porosa en la punta del
depsito que permite el paso de una corriente pero evitando al mismo tiempo, que se mezclen las soluciones.
27
PRCTICA No. 7
DETERMINACIN DE BICARBONATO SERICO
MTODO TITRIMTRICO DE SCRIBNER
FUNDAMENTO
A una cantidad conocida de plasma se le agrega un volumen igual de cido ntrico conocido. El
bicarbonato presente en la muestra biolgica al reaccionar con el cido ntrico se descompone y produce
anhdrido carbnico, la acidez restante se titula con una solucin valorada de hidrxido de sodio hasta
neutralizar la reaccin.
REACTIVOS
1.
2.
3.
4.
5.
CIDO NTRICO 0.1 N

HIDRXIDO DE SODIO 0.1 N
ROJO DE FENOL
AGUA DESTILADA
SOLUCION PATRON DE BICARBONATO 25 meq/l RECIENTE.

4
ligadura plana
centrfuga

4
2
3
2
1
2
3

pipetas lineales de 2 ml (1/100)
pipetas lineales de 1 ml (1/100)
Vasos de precipitados de 25 o 50 ml
Tubos de ensaye de 13 x 100 mm
gradilla
TECNICA
1. Estandarizacin del cido ntrico 0.1 N
Coloque 1 ml de cido ntrico 0.1 N y dos gotas de rojo de fenol en un matraz, titlelo con la solucin de
hidrxido de sodio 0.1 N hasta que el indicador vire a rosa. Ajuste para obtener la normalidad deseada. La
titulacin se efecta con microbureta de 2 ml graduada en centsimas.
28
Puede hacer esta estandarizacin colocando en el matraz un ml de hidrxido de sodio 0.1N agregando
indicador 2 gotas rojo de fenol y titulando con cido ntrico 0.1 N, el volumen dela titulacin ser el volumen
que adicionara de cido ntrico a las muestras de suero.
2. Coloque en un matraz 1 ml de plasma, 1 ml de cido ntrico 0.1 N (si la solucin de HNO 3 no corresponde
exactamente con la de hidrxido de sodio agregar la cantidad equivalente que iguale a 1 ml de hidrxido de
sodio 0.1 N)
3. Agregue 2 gotas de rojo de fenol, mezcle con suavidad, evite formacin de espuma y titule con hidrxido de
sodio el exceso de cido hasta lograr viraje del indicador.
CALCULOS
1 - ml de NaOH gastados x 100 = ____ meq/l de HCO3
De 25 a 27 meq/l de bicarbonato
29
UNIDAD NO. 3 ANLISIS DE

(EXUDADOS Y TRASUDADOS).
LQUIDOS
EXTRAVASCULARES
Los exudados y trasudados son lquidos biolgicos extravasculares de origen natural, adquieren
importancia clnica cuando sus caractersticas fisicoqumicas y microscpicas se modifican como respuesta a
alteraciones traumticas, inflamatorias, infecciosas, degenerativas, hemorrgicas o neoplsicas.
El anlisis de estos lquidos consiste bsicamente 5 exmenes que son:
1. Examen fsico
2. Examen qumico
3. Examen microscpico
4. Examen bacteriolgico
5. Examen inmunolgico
En el rea de bioqumica clnica solo revisaremos los tres primeros exmenes debido a que los dos ltimos
se revisan ampliamente en otras experiencias educativas correlacionadas.
MTODOS GENERALES DE OBTENCIN DE MUESTRAS.

Se obtienen por puncin quirrgica, en condicin de asepsia, con tcnicas que varan segn la
ubicacin del lquido. Conviene recoger una porcin en 3 tubos o recipientes estriles que contengan uno de
ellos citrato de sodio para evitar una probable coagulacin (til para el examen fsico e inmunolgico), el
segundo tubo con medio enriquecido de cultivo para transporte (bacteriolgico) y el tercero con solucin salina
(qumico y microscpico). Las tcnicas de obtencin de la muestra varan de acuerdo a la zona o cavidad en
que se requiera el estudio.
30
CARACTERSTICAS FISICOQUMICAS DIFERENCIALES ENTRE UN TRASUDADO Y UN

EXUDADO.
CARACTERSTICAS
EXUDADO
TRASUDADO
ASPECTO
TRANSPARENTE
TRANSPARENTE
CONSISTENCIA
SERO-FIBRINOSA
LIQUIDA
COLOR
VARIABLE
INCOLORO
OLOR
INODORO
INODORO
COAGULACION
POSITIVA
NEGATIVA
pH
6.5
7.5
DENSIDAD
1.020 - 1.030
1.006 - 1.015
GLUCOSA
NEGATIVO
20% < QUE

SANGUINEA
PROTEINAS
>3g%
<3g%
PBA RIVALTA
POSITIVA
NEGATIVA
LIPDOS
1 4.5 g %
NEGATIVO
CALCIO
> QUE CALCIO SERICO
< QUE CALCIO SERICO
LDH
> 200 UI/ l
< 200 UI/ l
31
GLUCOSA
PRCTICA No. 8
ANLISIS DE EXUDADOS.
EXAMEN FSICO
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Aspecto y color
Olor
Consistencia
Coagulacin
pH
Densidad

1
tubo de ensaye de 13 x 100 mm estril con anticoagulante
tubo de ensaye de 13 x 100 mm estril sin anticoagulante
tubo de ensaye de 13 x 100 mm estril con solucin salina isotnica

hisopos estriles

1
tubo de ensaye de 13 x 100 mm
portaobjetos

gradilla
aplicadores de madera
papel pH
INSTRUMENTACIN
Refractmetro o densitmetro
A) ASPECTO Y COLOR
El aspecto de los exudados depende de su origen y del agente etiolgico, pueden ser serosos
cuando contienen pocas clulas; serofibrinosos suelen coagular parcialmente por la presencia de fibringeno
procedente de la inflamacin. El aspecto se presenta sero-purulento cuando contiene abundantes clulas y es
francamente purulento cuando contiene pus pura, o hemorrgicos con sangre.
El color vara de amarillo plido al pajizo cuando no contienen sangre. A veces presenta coloracin
amarilla verdosa debido a la presencia de Pseudomonas
32
B) OLOR
Generalmente son inodoros o expiden un olor dulzn, excepto cuando son retenidos por mucho tiempo
y muestran alteraciones putrefactas. Los exudados ocasionados por grmenes intestinales poseen en muchos
casos un olor fecal debido a la necrosis de los tejidos.
C) CONSISTENCIA
Son fibrinosos o mucoide de fcil coagulacin por su riqueza en fibringeno.
D) COAGULACIN
Para su comprobacin se coloca una pequea cantidad de lquido una vez extrado, en un tubo que no
contenga anticoagulante y se observa si la coagulacin ocurre espontneamente. Generalmente los exudados
coagulan por la gran cantidad de protenas, sino produce coagulacin se observan usualmente grandes
flculos. No se presenta en las cavidades, si no despus de hacer la aspiracin parcial o completa;
particularmente en el caso de la infecciones neumoccicas. El hecho de que no se presente la coagulacin, se
debe a la destruccin de la fibrina por enzimas tisulares bacterianas.
E) pH
El pH es alcalino o levemente cido y se determina con el potencimetro o papel pH.
F) DENSIDAD
Se mide usando los densitmetros comunes para orina, pero si la cantidad es pequea con el uso del
refractmetro. El peso especfico de los exudados es mayor que el de los trasudados, varia entre 1.018 a
1.025 debido a la mayor cantidad de protenas existentes.
EXAMEN QUMICO
A)
A)
Determinacin cualitativa y cuantitativa de protenas
B)
Determinacin de glucosa
C)
Determinacin de cloruros
D)
Determinaciones de lpidos
E)
Determinacin de calcio
DETERMINACIN CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS

La determinacin de protenas en los exudados se efectan por los diferentes mtodos existentes para
orina y/o suero sanguneo. Debido a que los exudados contienen una alta concentracin de protenas es
conveniente realizar una dilucin previa de los mismos (1:10) con solucin salina isotnica, multiplicndose el
resultado obtenido por el factor de dilucin.
En los exudados purulentos consecutivos a inflamaciones graves en los que hay formacin o derrame
de pus como en el caso de empiema, la protena total de la porcin serosa sobrepasa por lo regular los 3 g % y
33
llega a ser aproximadamente igual que en el plasma sanguneo. En los exudados consecutivos a procesos
inflamatorios de menor intensidad la protena total es por lo general de 0.l a 0.5 g %.
REACCIN CUALITATIVA DE RIVALTA PARA MUCOPROTENAS

FUNDAMENTO.
Se basa en el principio de desnaturalizacin de las protenas en presencia de un cido dbil.
REACTIVOS
1. CIDO ACTICO GLACIAL G.R.
2. AGUA DESTILADA

2

gradilla
TCNICA
1. Coloque en un tubo 5 ml de agua destilada agregar 0.01 ml de cido actico glacial y completar con agua
destilada a los 10 ml. Mezclar por inversin. Sobre esta solucin se dejan caer unas gotas (5 a 10) del
lquido y se observa cuidadosamente, la formacin de una nubcula parecida al humo de un cigarrillo. La
intensidad de turbidez se expresa en cruces.
VALOR DE REFERENCIA
En los exudados se forma una nubcula por lo que el resultado es positivo. Y en general en los
trasudados la prueba es negativa.
B) DETERMINACIN DE GLUCOSA
La cuantificacin de glucosa en exudados se hace igual que en las tcnicas descritas para suero y/o
sangre completa. La glucosa en los exudados existe en cantidades muy bajas comparado con la concentracin
de glucosa sangunea, esta disminucin obedece a que la gluclisis es continua por la accin de las bacterias y
clulas; dependiendo hasta cierto punto de la gravedad del proceso inflamatorio.
TCNICA
Revisar la tcnica disponible
34
B) DETERMINACIN DE CLORUROS
La determinacin de cloruros se hace igual que en el plasma o suero. La concentracin de cloruros es
menor en los exudados que en los trasudados pero muy parecida a la del plasma sanguneo. El grado de
disminucin depende del aumento de protenas, de acuerdo con las leyes que regulan la concentracin de las
sustancias fcilmente difusibles a travs de una membrana semipermeable.
TCNICA
C) DETERMINACIN DE LPIDOS Y CALCIO

Los procedimientos para la cuantificacin de lpidos y Calcio son los mismos que en suero sanguneo.
Puede haber en los exudados grasas neutras y cidos grasos. La colesterina se presenta sobre todo en los
exudados retenidos en las cavidades durante mucho tiempo. Probablemente la presencia de esta sustancia se
deba a las alteraciones degenerativas que ocurren en el contenido de los exudados o de la cubierta serosa de
los mismos.
La determinacin de Calcio es una prueba que nos ayuda a diferenciar los exudados de los trasudados.
En los exudados la concentracin del calcio es mayor que en los trasudados, como consecuencia de la fraccin
no difusible del calcio que est combinada con las protenas. Esto es vlido tambin para la concentracin de
magnesio a causa del incremento de la concentracin de las protenas.
TCNICA
Revisar las tcnicas disponibles
EXAMEN MICROSCPICO
1)
OBSERVACIN DIRECTA (muestra en solucin salina)
2)
PREPARACIONES TEIDAS (con tinciones hematolgicas y bacteriolgicas)
REACTIVOS.
1. COLORANTE PARA TINCION DE MAY GRUENWALD GIEMSA
2. COLORANTE PARA TINCION DE WRIGHT
3. SOLUCIN BUFFER DE FOSFATOS PARA T. WRIGHT
4. CITRATO DE SODIO
5. ACEITE DE INMERSIN EN FCO GOTERO
6. SOLUCION SALINA DE CLORURO DE SODIO
35

1
1
5
5
tubo de ensaye de 13 x 100 mm con anticoagulante estril

portaobjetos
cubreobjetos
gradilla, perilla
puente de tincin
papel Parafilm
INSTRUMENTACIN
Microscopio binocular con iluminacin Koheler
TCNICA.
A) OBSERVACION DIRECTA EN FRESCO
La observacin directa en fresco se realiza a los exudados de origen vaginal, uretral, prosttico y de
lesiones chancroides, obtenindose de manera especial para cada caso, por medio de hisopos, pipetas Pasteur
capilares (chancro) depositando la muestra en el tubo de ensaye con solucin salina. La observacin
microscpica se hace de una preparacin entre portaobjetos y cubreobjetos de la muestra homogeneizada en

solucin salina, primero se observa con objetivo seco dbil y luego con seco fuerte para investigacin de
parsitos, hongos, espiroquetas, predominio de flora bacteriana, etc.
B) OBSERVACION MICROSCOPICA DE MUESTRAS TEIDAS

I) TINCIONES HEMATOLGICAS
1. Depositar una pequea gota de material a estudiar sobre el portaobjeto limpio y seco.
2. Hacer un extendido delgado tipo hematolgico o bacteriolgico.
3. Dejar secar y teir con la tcnica de May Gruenwald Giemsa para efectuar la diferenciacin celular.
4. Puede teirse con Wright, Papanicolaou, etc.
Es conveniente agregar citrato sdico a la muestra biolgica para evitar coagulacin.
II) TINCIONES BACTERIOLOGICAS

Se usan las tinciones Gram y Ziehl Neelsen para teir los frotis.
REACTIVOS
1. TINCION DE GRAM
CRISTAL VIOLETA
IODO LUGOL
ALCOHOL ACETONA
SAFRANINA
36
2. TINCION DE ZIEHL NEELSEN (BAAR)

FUCSINA FENICADA
ALCOHOL ACIDO
AZUL DE METILENO

1
1
5
5
tubo de ensaye de 13 x1200 mm estril con anticoagulante

portaobjetos
cubreobjetos
gradilla,
puente de tincin
papel Parafilm
INSTRUMENTACIN
TINCION DE GRAM
1. Se prepara el extendido bacteriolgico y se deja secar al aire, se fija por calor suave sobre a la flama de un
mechero Bunsen y luego pasadas a travs de ella (debe tenerse cuidado para evitar calor excesivo, que
altere morfologa bacteriana).
2. La preparacin se coloca en un puente de tincin y se cubre con cristal violeta tiendo por un minuto, se
escurre.
3. Se cubre con Yodo lugol por un minuto, se escurre y se decolora con alcohol acetona en 2 tiempos de 15
segundos cada uno enjuagando entre ellos con agua de la llave (para no exceder la decoloracin), se
contratie con zafranina de 30 a 60 segundos. Se escurre se enjuaga con agua, se deja secar y se observa
al microscopio con inmersin.
TINCION DE ZIEHL NEELSEN

1. Se efecta un extendido delgado del material a teir, sobre un portaobjetos NUEVO, se deja secar al aire y
se fija a la flama.
2. Se coloca sobre un puente, se cubre con solucin de fucsina fenicada y se calienta suavemente hasta
emisin de vapores dejando actuar por 5 minutos calentando varias veces, reponiendo el colorante que se
pierda por evaporacin.
3. Se lava con agua, se decolora con alcohol acido hasta que el extendido tome un color rosa plido, se
neutraliza con agua de la llave.
4.
Se cubre con azul de metileno por 1 minuto, se escurre, se lava con agua, se deja secar y se observa en
inmersin.
37
TECNICA
1. Seguir los procedimientos habituales de cada tincin y observar las preparaciones con aceite de inmersin
en el microscopio.
2. Al trmino de la observacin asegrese de dejar limpios los objetivos y la platina. As como colocar en
posicin de transporte segura el microscopio.
38
PRCTICA No. 9
ANLISIS DE TRASUDADOS.
EXAMEN FSICO
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Aspecto y color
Olor
Consistencia
Coagulacin
pH
Densidad

1
tubo de ensaye de 13 x 100 mm estril sin anticoagulante
tubo de ensaye de 13 x 100 mm estril con solucin salina isotnica

hisopos estriles

1
portaobjetos
gradilla,
papel Parafilm
INSTRUMENTACIN
A) COLOR Y ASPECTO.
El aspecto normal va de transparente a opaco y el color suele ser de verde a amarillo, a menos que
contenga sangre ser de tono rosado-rojizo.
Los trasudados en las ictericias se observan de color amarillo oscuro debido a la presencia de
bilirrubina. Los lquidos pleurales son quilosos (lechosos), al igual que los peritoneales. Generalmente los
trasudados recin extrados son transparentes, al enfriarse se tornan lechosos.
39
B) COAGULACIN
La coagulacin en los trasudados suele ser negativa o ligeramente positiva, y es ms lenta que en los
exudados. Excepto en caso de trasudados hemticos y quiloides, especialmente cuando se debe a la presencia
de tumores malignos.
De 1 2 ml de lquido recin extrado se colocan en un tubo de ensaye de 13 x 100 mm y se observa con qu
rapidez coagula.
C) DENSIDAD
Por lo general la densidad de los trasudados es inferior a la de los exudados, varia de 1.006 1.015,
esta prueba ayuda a su diferenciacin; sin embargo, los resultados estn sujetos a considerables alteraciones,
de acuerdo a la cantidad de protena presente, lo cual depende de la permeabilidad de los capilares del cuerpo.
As, los trasudados pleurales y peritoneales contienen mayor cantidad de protenas y por consiguiente son de
mayor densidad. En los trasudados tumorales la densidad se eleva hasta 1.025. La tcnica empleada es la
misma utilizada para muestras de orina.
D) pH.
El pH de los trasudados es alcalino cerca de 7.4. y se determina con el potencimetro o papel pH.
EXAMEN QUMICO
1.
Determinacin cualitativa y cuantitativa de protenas
2.
Determinacin de glucosa
3.
Determinacin de cloruros
4.
Otras determinaciones
A) DETERMINACIN DE PROTEINAS
Esta determinacin es de gran valor para diferenciar los trasudados de los exudados. Se realiza con los
mismos mtodos que se usan para sangre y orina, efectundose diluciones multiplicndose la cifra obtenida por
el factor de dilucin y los resultados se expresan en g/ l.
En los trasudados pleurales y peritoneales, en caso de insuficiencia cardiaca congestiva, cirrosis,
nefrosis, pueden mostrar de 0.1 a 1 g/ 100 ml en la concentracin de protena. Si estos trasudados permanecen
varios das en la cavidad, el lquido se reabsorbe ms por lo que la concentracin de protenas en estos casos
esta elevada, llegndose a confundir algunas veces con los exudados, (que a diferencia de los trasudados son
de origen inflamatorio).
B) DETERMINACIN DE CLORUROS
La determinacin de cloruros se hace igual que en suero. El cloruro en los trasudados suele ser mayor
que el cloruro plasmtico, varia de 720 a 750 mg / 100 ml de NaCl. Esta diferencia se debe al equilibrio Donan
el cual depende de la mayor concentracin de protenas en el plasma que en los trasudados.
40
C) OTRAS DETERMINACIONES
Se pueden hacer determinaciones de glucosa, creatinina, cido rico, urea, fsforo inorgnico,
enzimas teniendo concentraciones iguales que en el suero, las tcnicas son las mismas que se emplean para
las determinaciones sricas. Se recomienda tambin electroforesis de protenas. El contenido de Ca se
encuentra ms elevado en los trasudados y exudados que en el plasma debido a las protenas presentes los
valores de Na, Mg, K se encuentran disminuidas con respecto a los plasmticos.
La presencia de bilirrubinas se ve en los trasudados pleurales y peritoneales sin que exista aumento en
la sangre. Por lo general, no contienen lpidos pero el aspecto quiloso es debido a la presencia de pequeas
cantidades de lecitina y colesterol.
La determinacin de mucoproteinas es importante porque se elevan en procesos neoplsicos o
disminuyen en cirrticos, los valores de referencia se encuentran entre 60 y 100 mg / 100 ml.
La determinacin de la deshidrogenasa lctica es til en el diagnstico de
tumores metastticos,
pleurales o ascticos. Todas estas determinaciones son los mismos que se realizan en sangre.
EXAMEN MICROSCPICO
A) OBSERVACIN DIRECTA (muestra en solucin salina)
B) PREPARACIONES TEIDAS (con tinciones hematolgicas y bacteriolgicas)
REACTIVOS.
4. CITRATO DE SODIO
6. SOLUCION SALINA DE CLORURO DE SODIO 0.9%

1
tubo de ensaye de 13 x1200 mm con anticoagulante estril
portaobjetos
cubreobjetos
gradilla, perilla
puente de tincin
papel Parafilm
INSTRUMENTACIN
41
TCNICA.
A) OBSERVACION DIRECTA O EN FRESCO
Puede realizarse la observacin directa en fresco a los trasudados aunque poseen escasas clulas,
una segunda opcin en concentrar por centrifugacin las muestras lquidas con anticoagulante y del sedimento
se hace una preparacin entre portaobjetos y cubreobjetos para la observacin microscpica, primero se
observa con objetivo seco dbil y luego con seco fuerte para bsqueda de clulas mesoteliales, linfocitos,
clulas tumorales, leucocitos, eritrocitos, etc.
B) OBSERVACION MICROSCPICA DE MUESTRAS TEIDAS
TINCIONES HEMATOLGICAS
La observacin de muestras teidas tiene dos propsitos fundamentales el primero: al utilizar
colorantes para extendidos sanguneos tratamos de distinguir procesos infecciosos agudos (donde existe
predominio de clulas polimorfonucleares) de los procesos infecciosos crnicos (el predominio es de clulas
mononucleares -tuberculosis, sfilis, tumores-), mientras que si se distinguen eosinfilos predominantemente
sugiere procesos alrgicos o parasitarios. Y el segundo objetivo con las tinciones bacteriolgicas, es informar
de manera rpida la poblacin bacteriana persistente para instituir el protocolo de tratamiento lo ms pronto
posible.
TECNICA
4. Depositar una pequea gota de material a estudiar sobre el portaobjeto limpio y seco.
5. Hacer un extendido delgado tipo hematolgico o bacteriolgico.
6. Dejar secar y teir con la tcnica de May Gruenwald Giemsa para efectuar la diferenciacin celular.
7. Puede teirse con Wright, Papanicolaou, etc.
Es conveniente agregar citrato sdico a la muestra biolgica para evitar coagulacin.
TINCIONES BACTERIOLOGICAS
REACTIVOS
1. TINCION DE GRAM
CRISTAL VIOLETA
IODO LUGOL
ALCOHOL ACETONA
SAFRANINA

FUCSINA FENICADA
ALCOHOL ACIDO
AZUL DE METILENO
42

1
portaobjetos
cubreobjetos
gradilla,
puente de tincin
papel parafilm
INSTRUMENTACIN
TECNICA
1. Seguir los procedimientos habituales de cada tincin y observar con aceite de inmersin en el microscopio,
las preparaciones.
2. Al trmino de la observacin asegrese de dejar limpios los objetivos.
EXAMEN BACTERIOLOGICO
Para los lquidos extravasculares revisados en esta unidad se recomienda realizar simultneamente los
exmenes bacteriolgicos que se requieran, de acuerdo a la sospecha clnica. Siguiendo el protocolo habitual
tcnico-microbiolgico para la inoculacin, cultivo, aislamiento e identificacin de los microorganismos
patgenos.
43
CORRELACIN DE ALGUNAS CARACTERSTICAS FISICOQUMICAS Y

MICROSCPICAS DE LQUIDOS EXTRACELULARES.
LQUIDO PERICRDICO.
CARACTERSTICA REFERENCIA
SIGNIFICADO CLNICO
10 15 ml
VOLUMEN
ASPECTO
TRANSPARENTE
TURBIO
=
PROCESOS
INFECCIOSOS, MALIGNOS
QUILOSO = ALTERACIONES DE
SISTEMA LINFATICO
HEMORRGICO
=
AFECCIN
TUBERCULOSA O MALIGNA
SANGUINOLENTO =
PUNCIN
ANMALA, USO DE FRMACOS
ANTICOAGULANTES
LEUCOCITOS
TOTALES
< 200 / mm3
> ETIOLOGA INFECCIOSA
DIFERENCIAL
PMN 25%
MN 45 65%
CLULAS
MESOTELIALES
20%
> % PMN
BACTERIANA
CLASIFICACIN
ARTICULARES
SIGNIFICADO
PATOLGICO
DE
LOS
ENDOCARDITIS
TRASTORNOS
CLASIFICACIN DE GRUPOS
SIGNIFICADO PATOLOGICO
NO INFLAMATORIOS
II
INFLAMATORIOS
TRASTORNOS DEGENERATIVOS
EVENTOS
INMUNOLGICOS:
ARTRITIS
REUMATOIDE,
LUPUS
ERITEMATOSO DISEMINADO
III.
SPTICOS
IV
INDUCIDOS
INSOLUBLES
HEMORRGICOS
INFECCIONES BACTERIANAS
POR
SOLUTOS CIDO
RICO:
PSEUDOGOTA
GOTA
LESIONES
TRAUMTICAS,
DEFICIENCIAS DE COAGULACIN
44
LIQUIDO PERITONEAL
ALTERACIONES
ASPECTO
TRANSPARENTE
HEMORRGICO, POR TUMORES

MALIGNOS
TURBIO, POR CARGA BACTERIANA
O MICTICA
VOLUMEN
< 3.5 ML
COLOR
pH
AMARILLO
VERDE 0 DERRAME BILIAR
CLARO O PLIDO
6.9 7.6
DENSIDAD
1.010 1.026
COAGULACIN
NEGATIVA
GLUCOSA
50 75 mg%
ELEVADO = > CARGA DE SOLUTOS

POSITIVA = ETIOLOGA INFECCIOSA
BACILAR
DISMINUIDO = CARGA BACTERIANA
Y/O CLULAS NEOPLSICAS
< 3 g%
ALBMINA
50
- ELEVADO
70%
PROTENAS
GLOBULINAS
PROCESO
INFLAMATORIO
30 AGUDO PREDOMINIO DE ALBMINA
45 %
CRNICO
FIBRINGENO
GLOBULINAS
PREDOMINIO
DE
0.3 -4.5%
CLORUROS
AMILASA
AMONIACO
FOSFATASA
ALCALINA
RELACIN DE CONCENTRACIN
INVERSA CON PROTENAS
PATOLOGIAS PANCRETICAS Y
> QUE VALORES
PERFORACIONES
SERICOS
GASTROINTESTINALES
ELEVADO = LCERA PPTICA
IGUAL
QUE
PERFORADA
VEJIGA DESGARRADA (JUNTO CON
SUERO
DE CREATININA)
IGUAL
QUE
ELEVADO = PERFORACIN DE
INTESTINO DELGADO
SUERO
118 128 meq/l
< 200 / mm3
CLULAS
CLULAS
MESOTELIALES
DEL 20 30%
PMN < 25%
MN 45 65% 45
PREDOMINIO LINFOCITOS SUGIERE

ETIOLOGA CRNICA BACILAR
CLULAS
NEOPLSICAS
=
TUMORES
PREDOMINIO PMN SUGIERE
PERITONITIS
BACTERIANA
Y
CIRROSIS
LQUIDO SINOVIAL
GRUPO I
GRUPO II
No
inflamatorio
inflamatorio
GRUPO III
sptico
GRUPO IV
Compuestos
insolubles
GRUPO VI
hemorrgicos
VOLUMEN
< 3.5 ml
> 3.5 ml
> 3.5 ml
> 3.5 ml
> 3.5 ml
> 3.5 ml
ASPECTO
Transparente
Transparente
Turbio
Turbio
Turbio - lechoso
Turbio rojizo
COLOR
Amarillo claro
Amarillo
Amarillo
opalescente
Amarillo a verde
Amarillo
Amarillo
opalescente
Alta
Alta
Baja
Baja
Alta
Alta
Positiva compacto
Positivo
compacto
Positivo -friable
Positivo- friable
Positivo compacto
Positivo -friable
Igual que suero
Igual que
suero
> de 25 mg%
< que srica
> de 25 mg%
Disminuida
Normal
PROTENAS
1.36 g%
< 5.0
< 5.0
> 5.0
< 5.0
< 5.0
GLOBULINAS
0.05 g%
< 5.0
< 1.8
> 2.0
< 5.0
< 1.8
CIDO RICO
Igual que suero
No ponderado
No ponderado
No ponderado
Elevado
No ponderado
< 200/mm3
200 a 3000 /
mm3
300 a 10 000
/mm3
> 100000 / mm3
500 - 200000 / mm3
< 5000 /mm3
PMN > 25%
> 30%
> 50%
> 75%
> 90%
< 50%
ERITROCITOS
< 5 /mm3
Ausentes
Ausentes
Ausentes
Ausentes
Abundantes
CRISTALES
Ausentes
No ponderado
No ponderado
No ponderado
Presentes
Ausentes
VISCOSIDAD
COAGULACIN
GLUCOSA
CLULAS TOTALES
PMN
46
LQUIDO PLEURAL
CARACTERSTICA
VOLUMEN
ASPECTO
COLOR
DENSIDAD
COAGULACIN
pH
GLUCOSA
AMILASA
TRIGLICRIDOS
CLULAS
TOTALES
LEUCOCITOS
DIFERENCIAL
ERITROCITOS
REFERENCIA
SIGNIFICADO CLNICO
< 3.5 ml
TURBIO
=
AUMENTO
DE
POBLACIN
CELULAR (LEUCOCITOS)
TRANSPARENTE
QUILOSO = QUILOTRAX
HEMORRGICO O PURULENTO
AMARILLO
CLARO
<
DE
1.015
= CIRROSIS, NEFROSIS,
1.008 1.020
CARDIOPATAS O NEOPLASIAS
> DE 1.018 = PLEURESIA TUBERCULOSA
NEGATIVA
> = HIPERPROTEINEMIA
< 7.3 EXUDADO?, EMPIEMA, AFECCIONES
MALIGNAS,
7.4
PLEURESIA REUMATOIDE, PLEURITIS POR
LUPUS,
TUBERCULOSIS Y ROTURA ESOFGICA
> 60 mg% : AFECCIONES TUBERCULOSAS Y
MALIGNAS; EN DERRAMES POR LUPUS
IGUAL QUE
ERITEMATOSO DISEMINADO
SUERO
< 60 mg%. AFECCIONES BACTERIANAS O
PLEURITIS REUMATOIDE, AFECCIONES
TUBERCULOSAS Y MALIGNAS
> = AFECCIONES PANCRETICAS, TUMORES
IGUAL QUE
PANCRETICOS Y NEUMONIAS, ROTURA
SUERO
ESOFGICA
< = DERRAMES TUBERCULOSOS Y OTROS
VALORES > 2 O 3 VECES LO NORMAL =
IGUAL QUE
QUILOTRAX
SUERO
PLEURESA TUBERCULOSA
< 200/mm3
>
= PROCESO INFLAMATORIO, DERRAME,
HEMORRAGIA
80% DE TRASUDADO Y 20% DE EXUDADOS
> 10 000/mm3 = NEUMONA, PANCREATITIS,
< 1000/mm3
SNDROME
DE
POSTINFARTO
AL
MIOCARDIO Y LUPUS ERITEMATOSO
DISEMINADO
PMN 25%
50 % O >
LINFOCITOS PEQUEOS
=
MN 45 65%
DERRAMES TUBERCULOSOS, MALIGNOS
CLULAS
> 30% PMN = NEUMONIAS, PANCREATITIS,
MESOTELIALES
ENFERMEDADES DE COLAGENA
20%
< DE 5 /mm3
> 100 000 /mm3 = TODOS TIPOS DERRAMES

>
100
000/
mm3
=
ENFERMEDAD
PLEURALMALIGNA, INFARTO PULMONAR
O TRAUMATISMO
47
UNIDAD NO. 4 ANLISIS DE LQUIDO CEREBROESPINAL.

Los problemas neurolgicos son relativamente frecuentes, ya sea de tipo infeccioso, metablico,
traumtico, degenerativo, hemorrgico o por invasin tumoral. Es por ello que en el estudio del lquido
cerebroespinal tiene gran valor como medio diagnstico directo o indirecto en muchos padecimientos del
sistema nervioso central, sobre todo cuando son realizados adecuadamente y los resultados son interpretados
en relacin con las manifestaciones clnicas. Por otra parte su estudio tiene un valor adicional en la evaluacin
del tratamiento y su pronstico.
En esta unidad se incluyen las pruebas de laboratorio ms utilizadas en el estudio del LCR, omitindose
lo relativo al examen microbiolgico e inmunolgico que no se revisan en esta experiencia educativa, ya que se
consideran ampliamente en sus respectivas experiencias.
El anlisis del lquido cerebroespinal incluyen las siguientes determinaciones:
I.
Examen Fsico
a) Volumen
b) Presin
c) Color
d) Aspecto
e) Coagulacin
2. Examen qumico
a) Glucosa
b) Protenas globulinas
c) Enzimas
d) Cloruros
3. Examen microscpico
a) Recuento celular total
b) Recuento diferencial
OBTENCION DE MUESTRAS
Normalmente el LCR se extrae por puncin lumbar (puncin espinal) entre la III y IV IV y V vrtebras
lumbares. Es el medio ms comn para recolectar una muestra de LCR y esta solo debe realizarse por un
mdico con experiencia. Debe realizarse en el consultorio o en el laboratorio, pero es recomendable hacerla en
el hospital pues conviene que el paciente permanezca por lo menos 8 horas en cama despus de la extraccin
del lquido para evitar complicaciones posteriores. El paciente deber estar enana posicin adecuada esto es
sentado o mejor an acostado en decbito lateral sobre todo cuando los pacientes son nios o adultos
1
encamados. Se debe pedir al paciente que se acueste de lado con las rodillas encogidas hacia el abdomen y la
barbilla pegada al trax. (Ocasionalmente, este procedimiento se realiza con la persona sentada y doblada
hacia adelante).
48
El clnico deber estar en condiciones aspticas y usar medidas de seguridad. Se proceder a

desinfectar perfectamente la piel del paciente previa localizacin de la zona intervertebral. La puncin debe
hacerse con o sin anestesia local (novocana al 0.1%). La penetracin de la aguja se hace suavemente, una
sensacin de vaco (resistencia que cede) implica que la aguja se encuentra en el espacio subaracnoideo o
bien, para comprobar si efectivamente se encuentra en este lugar de vez en cuando se saca el mandril o
estilete de la aguja, la salida de lquido la confirma, en los casos de no salir lquido lo que se hace es girar la
aguja e introducir otros milmetros ms hasta la salida de este. Una vez que se ha insertado la aguja
adecuadamente en el espacio subaracnoideo, se mide la presin inicial del lquido, si es normal la presin se
extrae de 10 a 20 ml si hay hipertensin solo se extraen unos pocos ml.
Se recolecta el lquido en tres tubos estriles uno para las pruebas fsicas, otro con anticoagulante para
evitar coagulacin en esta muestra se realizan las pruebas qumicas as como las microscpicas y el tercer tubo
se utiliza para un examen microbiolgico. Despus de recolectar la muestra, se mide la presin nuevamente y
se retira la aguja, se limpia el rea y se aplica un vendaje. El paciente debe permanecer acostado o casi
acostado por al menos seis u ocho horas despus del examen.
La puncin lumbar con recoleccin de lquido puede ser tambin una parte de otros procedimientos,
particularmente de un mielograma (radiografa o TC despus de que se ha introducido el medio de contraste en
el LCR)., para medir presin del LCR y detectar alteraciones en el flujo del mismo , introducir anestsicos y/o
medicamentos.
NO DEBE PRACTICARSE LA PUNCIN LUMBAR CUANDO:
Proceso infeccioso en sitio de puncin
Septicemia
Sospecha de equipo no estril
Desarrollo de tumor dermoide
Presin > de 150 mm H20
Paciente NO apto
Los mtodos alternativos para obtener el LCR son pocas veces utilizados, pero pueden ser
recomendables si el paciente presenta un problema como deformidad lumbar o infeccin, lo cual puede
imposibilitar la puncin lumbar o hacerla no confiable.
La puncin cisternal implica la insercin de una aguja debajo del hueso occipital (parte posterior del
crneo). Esto puede ser peligroso porque la aguja se inserta cerca del tronco enceflico.
La puncin ventricular es an menos comn, pero se puede recomendar cuando es necesario obtener
la muestra de LCR en personas con posible hernia cerebral inminente y se realiza generalmente en el
quirfano. Se perfora un orificio en el crneo y se inserta una aguja directamente en el ventrculo lateral del
cerebro.
49
CONDICIONES DE EMBALAJE
1. El paciente deber llevar a cabo las mismas condiciones ptimas que se recomiendan para la obtencin de
muestras sanguneas.
2. Se anotara la hora en que se inicia y termina la extraccin, el estado del paciente, el aspecto del LCR y las
presiones de los lquidos.
3. Cada muestra de LCR debe ser tomada de manera asptica y recogida en 3 tubos estriles.
4. Las muestras obtenidas debern trasladarse al laboratorio lo ms pronto posible y procesarse de inmediato,
pues como liquido hipertnico modifica clulas produciendo lisis y esto altera caractersticas fsicas, qumicas
y microscpicas del LCR.
3. Es aconsejable para el examen microbiolgico sembrar directamente LCR en un medio de cultivo similar al
utilizado para hemocultivos, el que debe remitirse al laboratorio inmediatamente. El retraso en el envo puede
ocasionar la muerte de grmenes patgenos delicados. El material debe ser procesado y sembrado lo ms
rpido posible. Si hubiera inconvenientes, colocar u tubo con LCR en estufa a 37C o en un termo
50
PRCTICA NO. 10
ANLISIS DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO
EXAMEN FSICO
A)
B)
C)
D)
E)
Volumen y presin
Color
Aspecto
Coagulacin
Densidad y pH

1
portaobjetos

gradilla
papel pH
INSTRUMENTACIN
A) VOLUMEN Y PRESION
El volumen varia de 100 a 150 ml aproximadamente, es por ello que la extraccin de 10 a 12 ml es
inocua. Antes de proceder a retirar cualquier cantidad de lquido deber medirse la presin y observar la
elevacin del mismo en el interior del manmetro graduado y esterilizado. La presin normal en el adulto es de
70 a 150 mm de agua en posicin de decbito lateral, en posicin sentada aumenta al doble.
Cuando la presin intracraneal esta elevada (ms de 200 mm de agua) debern extraerse de 1 a 2 ml
solamente. Si la presin desciende del 25 al 50% de la inicial es un dato patognomnico de hernia cerebral o
compresin de la columna vertebral, si esto es as no debe extraerse ms lquido.
Una presin inferior a 50 o superior a 250 mm de agua puede considerarse patolgico, siempre y
cuando no se considere como dato aislado.
La tos o un esfuerzo violento, usualmente causan una elevacin rpida y una cada subsiguiente de
presin. Esto se debe a que la presin de lquido cefalorraqudeo est relacionada con venas yugulares y
espinales y el crecimiento resultante de la presin en el contenido en el espacio subaracnoideo.
El incremento patolgico de la presiona se debe generalmente a una inflamacin de las meninges o la
lesin que ocupa espacio, como puede ser un tumor, absceso, edema cerebral o hemorragia intracerebral,
51
insuficiencia cardiaca, congestiva, etc. Puede encontrarse una hipotensin en casos de un obstruccin medular
total, (tumores y en estado de deshidratacin).
B) COLOR
El lquido cefalorraqudeo normal es claro, incoloro e inodoro. Las diferentes coloraciones que puede
tener son producidas por alteraciones patolgicas excepto cuando la coloracin es debida a la presencia de
sangre como resultado de una puncin traumtica, esto se corrobora por ausencia de hemlisis al centrifugarse
el lquido, la presencia de esta es evidencia de hemorragia menngea evidente.
A veces puede aparecer una coloracin amarilla que se denomina xantocroma (puede aparecer un
rosa plido o un naranja plido). Muchas veces esta xantocroma va acompaada de coagulacin espontnea
poco despus de la recoleccin. Las causas posibles de la xantocroma son:
1. Protenas que sobrepasen los 100mg/100ml.
2. Puncin traumtica con lisis de eritrocitos.
3. Bilirrubina.
4. Por contaminacin de mertiolato que se emple para la desinfeccin de la piel.
5. Hemorragia intracerebral o subaracnoidea.
6. Carotenemia o metahemoglobinemia.
7. Oxihemoglobinemia.
8. Presencia de tumores en las ltimas vrtebras lumbares.
C) ASPECTO
El aspecto del lquido cefalorraqudeo es transparente. Aparece el enturbiamiento como resultado de
elevadas densidad de poblacin de elementos celulares o por la presencia de contaminacin bacteriana. La
turbiedad del lquido puede variar desde una ligera opalescencia tpica de la meningitis tuberculosa, hasta un
aspecto ms o menos purulento como en algunos casos de meningitis pigena.
En el reporte del resultado se anota si el lquido es transparente o turbio. Esta turbidez se valora de 1 a 3
cruces.
ESCALA DE PONDERACIONES DE ALGUNOS PARMETROS
PONDERACIN
ASPECTO
RECUENTO CELULAR
TRANSPARENTE
< 5 CELULAS /mm3
LIGERAMENTE TURBIO
< 200 CELULAS / /mm
++
MODERADAMENTE TURBIO
XANTOCRMICO
500 A 2000 CLULA/mm
++
TURBIO
HEMORRAGICO
2000 A 6000 CLULAS //mm
52
D) COAGULACIN
Normalmente el lquido cefalorraqudeo carece de coagulacin. Esta puede ocurrir debido a una
puncin traumtica o atribuirse a un nivel muy elevado de protena asociado con meningitis tuberculosa.
La deteccin de fibrina se manifiesta por la presencia de un retculo. En la meningitis tuberculosa puede
aparecer formada dicha pelcula. En la meningitis purulenta puede aparecer cogulos poco despus de
obtenida la muestra, mientras que en la meningitis tuberculosa la coagulacin es tarda.
E) DENSIDAD y pH
El LCR es semejante en su composicin al plasma, con un contenido mayor de agua y una densidad de
1.007, lo que hace de su contenido de molculas en general sea ligeramente inferior al plasma. Carece casi
totalmente de clulas, tiene pocas protenas y abundantes cloruros.
Solo en eventos patolgicos se altera la cantidad de solutos en el LCR como en alteraciones de la barrera
hematoenceflica, inflamaciones de meninges, rompimiento de vasos sanguneos, entre otros.
El pH del LCR es 7.40 7.50 se determina con el potencimetro o en su defecto con papel pH.
EXAMEN QUMICO
A)
DETERMINACIN DE GLUCOSA
B)
DETERMINACIN CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTENAS
C)
DETERMINACIN DE CLORUROS

15
1

6
3
pipeta lineal de 2.0 ml (1/100)
vaso de precipitado de 50 ml
vidrio de reloj
gradilla
Perilla
INSTRUMENTACIN
53
Centrifuga clnicas
o
Bao Mara precalentado a 37 C

Espectrofotmetro - celdillas
A) DETERMINACIN CUANTITATIVA DE GLUCOSA.

La cuantificacin de glucosa en LCR se hace igual que en las tcnicas descritas para suero y/o sangre
completa. La glucosa en el LCR existe en cantidades muy bajas comparada con la concentracin de glucosa
sangunea (aproximadamente 20% menos).
TCNICA
Revisar la tcnica disponible.
En adultos la cantidad normal de glucosa varia de 50 a 75 mg/100 ml de lquido cefalorraqudeo, en los
nios hasta los 10 aos es de 70 a 90 mg/100ml.
INTERPRETACIN CLINICA
El aumento de glucosa en lquido cefalorraqudeo se conoce como hiperglucorraquia, se encuentra en
todos los procesos hiperglucmicos, una ligera hiperglucorraquia puede observarse en encefalitis epidmica y
en la poliomielitis.
Cuando hay meningitis bacteriana, tuberculosa, mictica o carcinomatosa, la concentracin de glucosa
suele estar disminuida (hipoglucorrquia), en el mecanismo de produccin de la hipoglucorrquia puede intervenir
la intensa actividad metablica de las clulas en rpido crecimiento (neoplsicas y microorganismos), la
fagocitosis y trastornos de la glucosa.
COMENTARIOS.
La cuantificacin de la glucosa en LCR tiene las mismas variaciones que la glucosa sangunea, por
ello es preferible que la extraccin del LCR sea despus de un periodo de ayuno. Al igual que la sangre el LCR
posee otras sustancias reductoras que aumentan el nivel de la glucosa real. Cuando la concentracin de
protenas esta elevada es comn observar una variacin en la glucorraquia.
B) DETERMINACIN DE PROTEINAS TOTALES

El estudio de las protenas del LCR es muy til, se cuantifican a partir de 1 ml de LCR, si las cifras son
bajas, son insuficientes para el equilibrio cido-bsico del LCR, por tanto como mecanismo compensatorio para
los cationes se elevan los cloruros. Las determinaciones de protenas individuales como albmina se hace por
mtodos enzimticos preferentemente y para globulinas se recomienda por inmunodifusin radial o turbidimetra
por las cantidades tan bajas que se cuantifican. Los mtodos presentados aqu para globulinas son de inters
por su facilidad operativa.
54
B1. DETERMINACIONDE PROTEINAS TOTALES POR BIURET MODIFICADO

FUNDAMENTO
La reaccin de Biuret se basa en la formacin de un complejo de iones de cobre II con 4 tomos de N
peptdico en medio alcalino. Reacciona especficamente con los pptidos, polipptidos y protenas, excepto con
amoniaco, urea, aminocidos y otros compuestos nitrogenados simples. Desarrollando un complejo colorido
azul, cuya intensidad de color es directamente proporcional al nmero de uniones peptidicas (cantidad de
protenas) presentes en la muestra. La adicin de urea impide el efecto Tyndall (turbidez leve).
REACTIVOS
1. REACTIVO PRECIPITANTE (FOSFOTNGSTICO)
2. REACTIVO BSICO.
3. REACTIVO DE BIURET - MODIFICADO
4. PROTENA ESTNDAR 50 mg/100 ml.
TCNICA
1.
En 3 tubos de ensaye previamente marcados, medir:

PROBLEMA (ml)
2.
ESTNDAR (ml)
BLANCO (ml)
Ac. Fosfotungstico
0.5
0.5
Liq. Cerebroespinal
0.5
Estndar
0.5
Mezclar durante 1 minuto continuamente. Deje reposar 15 minutos (hasta que el precipitado comience a
precipitarse). Centrifugue durante 5 minutos. Retire el sobrenadante cuidadosamente, sin resuspender el
precipitado que es lo que vamos a cuantificar. Una vez eliminado sobrenadante resuspenda el precipitado
enrgicamente. Contine como se indica a continuacin
Precipitado
+++
+++
Agua destilada
0.2
Reactivo bsico
0.5
0.5
0.5
3.
Mezclar el precipitado el tiempo necesario (1-2 min.) para lograr una completa resolubilizacin
precipitado.
4.
Agregar a cada uno de los 3 tubos 0.5 ml del reactivo de Biuret.
5.
Mezcle y deje en reposos durante 30 min, a temperatura ambiente o 10 minutos a 37 C. Lea la extincin
del Problema, Estndar y el Blanco de reactivos ajustando a cero con agua destilada a 546 nm.
CLCULO
mg / 100 ml = EP
EB X 50
EE
EB
55
del
La informacin que se tiene al respecto es poco precisa por lo que se recomienda obtener los valores
de referencia en base a la poblacin en estudio, no obstante se presentan los siguientes valores a considerar
en cuanto a las concentraciones de protenas de lquido cefalorraqudeo y a sus diferentes fracciones. En recin
nacidos hasta con un mes de vida se consideran normales valores de hasta 100 mg/100ml; edades posteriores
pueden ser normales concentraciones que oscilan entre 20 a 44 mg/100ml. La cantidad de albmina es de 15 a
30 mg% y la de globulinas de 4 a 9 mg%, no detectadas por las tcnicas habituales.
COMENTARIOS
1. El mtodo descrito es lineal hasta concentraciones de 600 mg%.
2. Se recomienda efectuar una determinacin cualitativa mediante una tira de prueba. Si la concentracin
proteica es de 3+, se preparar la determinacin con menos LCR. Si por el contrario, se encuentran solo
vestigios, su precipitacin puede mejorarse utilizando 1 ml de cido fosfotngstico
B2.
DETERMINACIN DE GLOBULINAS (METODO DE NONNE ALPET).9, 14
FUNDAMENTO
Las globulinas son insolubles en agua pura, pero solubles en soluciones neutras diluidas de sales de
lcalis y cidos y coagulan por el calor. Precipitan en la solucin por semisaturacin con sulfato amnico.
REACTIVOS.
1. SOLUCIN SATURADA DE AMONIACO
TCNICA.
1. Homogeneizar muy bien la muestra de LCR. En un tubo de ensaye se mide 1 ml de la solucin saturada de
sulfato de amonio.
2. Sobre esta se deposita con precaucin por las paredes y sin que se mezcle 1 ml de LCR. Se deja reposar
5 min.
3. Cuando existe un exceso de globulina aparece un anillo blanco o gris en la zona de contacto de los dos
lquidos.
VALORES DE REFERENCIA.
Globulinas negativas.
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B3. DETERMINACIN DE GLOBULINAS POR LA REACCION DE PANDY.

FUNDAMENTO
Las globulinas representadas principalmente por la fraccin de Inmunoglobulinas, en una solucin
saturada de fenol acuosa precipitan, produciendo una turbidez visible microscpicamente.
REACTIVO.
1. SOLUCIN SATURADA DE FENOL
TCNICA.
1. En un tubo de ensaye se coloca 1 ml de reactivo y se agrega una gota de LCR.
2. Si el lquido es normal no aparece enturbamiento o bien solo se origina una ligera opalinidad.
3. Si la opalinidad es marcada o aparece enturbiamiento dbil, marcado o lechoso se establecen los 3 grados
de positividad correspondiente a +, ++, +++ en ese orden.
4. Esta reaccin puede hacerse en vidrios de reloj, facilitndose la lectura sobre un fondo negro.
Negativo
INTERPRETACION CLINICA
Los aumentos de protenas de lquido cefalorraqudeo se presenta en
cualquier enfermedad
inflamatoria aguda o crnica, enfermedades degenerativas (esclerosis mltiple), alteraciones de la barrera

hemato-enceflica y en muchos casos de tumores cerebrales. El incremento suele ser leve, moderado y
elevado de acuerdo a la evolucin del padecimiento.
Un aumento notable se da en los casos de compresin medular con obstruccin total acompaado de
coagulacin masiva y xantocrmica (sndrome de Froin) y por lo general cifras bajas de elementos celulares.
La meningitis aguda presenta elevacin de las protenas acompaada de pleocitosis proporcional. En la
meningitis crnica, principalmente las sifilticas se observan aumentos moderados de protenas.
Puede observarse un ascenso ligero
de la proteinorraquia con aumento desproporcionado de
elementos celulares en algunos procesos inflamatorios agudos no infecciosos. Cuando las globulinas son
positivas se revela que el proceso paso a ser crnico. El ndice de suero/LCR es til para valorar dao en
barrera y sntesis local (tabla 1). Los siguientes padecimientos son considerados afectaciones de barrera.
LCR/ suero < 160:
Meningitis viral (neutrfilos y clulas mononucleares)
Estados iniciales de meningitis bacterianas
Accidentes de padecimientos no vasculares, inflamatorios polineuropatas
57
Enfermedades degenerativas (esclerosis lateral amiotrpica, tumores cerebrales malignos y

benignos
Hernia de disco vertebral
TABLA 1. DAO DE BARRERA LCR/ SUERO EN ESCLEROSIS MLTIPLE

Suero (mg/dl)
LCR (mg/dl)
ndice Suero/LCR
Albmina
3420
24.30
141
IgG
1250
11.5
109
IgA
185
0.34
544
IgM
326
0.67
487
COMENTARIOS.
1. Los valores normales de protenas en lquido cefalorraqudeo vara segn la edad del paciente y el mtodo
utilizado.
2. Las tcnicas para la investigacin cualitativa de las globulinas no son
aplicables a los lquidos
cefalorraqudeos que contengan sangre.,

3. Las protenas estn constituidas por albminas y globulinas, en relacin de 5 a 1.
C) DETERMINACIN CUANTITATIVA DE CLORUROS. METODO DE MOHR.

FUNDAMENTO
Se basa en el papel del in cloro presente en le lquido cefalorraqudeo desproteinizado, como cloruro de
plata, despus de reaccionar con una solucin de nitrato de plata , usndose como indicador el cromato de
potasio. el exceso de AgNO3 se identifica por el cambio de color del indicador.
REACTIVOS
1. SOLUCIN DE NITRATO DE PLATA 0.0342 N

2. SOLUCIN DE CROMATO DE POTASIO AL 48.33%
3. SOLUCIN DE TUNGSTATO DE SODIO AL 10%
4. SOLUCIN DE CIDO SULFRICO 2 / 3N
TCNICA
1. En un Erlen Meyer (o en un tubo dependiendo de los volmenes a mezclar) se colocan 2 ml de LCR con 14
ml de agua destilada, 2ml de solucin. De tungstato de sodio al 10% y 2ml de ac. Sulfrico 2/3 N, se agita y
se filtra o centrifugar por 10 minutos a 3400 rpm.
2. Se miden 10 ml de filtrado o sobrenadante (que equivalen a un mililitro de LCR) y colocar en un Erlen Meyer.
58
3. Se aaden 10 gotas de solucin de cromato y 20 ml de agua destilada.

4. Se titulan con una solucin de nitrato de plata hasta una coloracin roja.
CLCULOS
Los mililitros gastados de la solucin de AgNO 3 se multiplican por 0.002 y por 2000 para obtener el
valor de los cloruros en gramos por litro.
VALORES DE REFRERENCIA
Las cifras de cloruros en el lquido cefalorraqudeo, clorurorraquia, es un promedio de 125 a 135 meq/l
o de 7.30 g / l expresado como cloruro de sodio o de 700 a 760 mg %.
Las alteraciones en la concentracin de cloruros generalmente se presentan como disminucin de los
niveles de ellos en el LCR. Los descensos muy marcados de los niveles de cloruros en este lquido es frecuente
observarlos en los casos de meningitis tuberculosa, disminuciones modernamente marcadas se observaran en
meningitis aguda excepto en los tipos sifilticos.
Esta disminucin, puede ser el resultado de la hipocloremia debido a vmitos intenso, lesiones en la
barrera hematocerebral y tambin puede ser causado por la sustitucin osmtica de los cloruros por protenas
en valores elevados.
EXAMEN MICROSCPICO
A) RECUENTO TOTAL DE CLULAS
B) RECUENTO DIFERENCIAL CON PREPARACIONES TEIDAS
(Por tinciones hematolgicas y/o bacteriolgicas)
A) RECUENTO TOTAL DE CLULAS

La celularidad se efecta por el conteo total y diferencial de la muestra obtenida de LCR, normalmente
3
se encuentras de 0 a 5 clulas /mm , elevndole en cualquier proceso inflamatorio

Es recomendable practicarlo dentro de una o dos horas de obtenido el LCR, ya que los elementos
celulares sufren modificaciones importantes. El recuento celular debe efectuarse en forma minuciosa cuando el
nmero de clulas esta levemente o moderadamente elevados. Proporciona un dato diagnstico diferencial de
los casos de meningitis tuberculosa, poliomielitis aguda, sfilis del SNC y encefalitis letal. y se clasifica como
sigue:
59
Leve
de 5 a 50 clulas /mm
Moderada de 50 a 200 clulas /mm

Grave
ms de 200 clulas /mm
Cuando los LCR muestren macroscpicamente la presencia de sangre, no se les debe practicar recuento
celular. Pues ese encontraran cifras elevadas.
Para el recuento celular pueden utilizarse comnmente dos tcnicas a elegir dependiendo del volumen de
LCR con el que se cuente, con lquido de dilucin se emplea mayor volumen o la carga de la muestra
homogeneizada directamente en la cmara de Neubauer.
REACTIVOS
1. LQUIDO DE DILUCIN CRISTAL VIOLETA

1
1
10
5
1
1

portaobjetos
cubreobjetos
Cmara de Neubauer
Pipeta Thoma para leucocitos -boquilla
gradilla, perilla
puente de tincin
papel Parafilm
INSTRUMENTACIN
TCNICA A
1. Se aspira lquido de dilucin hasta la marca de pipeta 0.5
2. Aspirar LCR previamente homogeneizado hasta la seal 11, se agita por 1 minuto mecnicamente y se
desechan las dos o tres primeras gotas.
3. Se carga la cmara de Neubauer y se esperan unos 5 minutos, para que sedimenten las clulas y se
efecta el recuento.
4. Se cuentan todas las clulas contenidas en 9 cuadros grandes del nmero de clulas se divide entre 9 y se
3
multiplica por 10 para obtener el valor correspondiente a un mm .
60
TCNICA B
1. Se homogeniza muy bien el LCR y se carga la cmara de Neubauer y se esperan unos 5 minutos, para que
sedimenten las clulas y se efecta el recuento.
2. Se cuentan todas las clulas contenidas en 4 cuadros grandes (divididos en 16 cuadros pequeos) del
3
nmero de clulas se divide entre 4 y se multiplica por 10 para obtener el valor correspondiente a un mm .
De 0 a 5 clulas / mm
3.
Se denomina pleocitosis al nmero elevado de clulas
el LCR, es comn encontrar cifras
elevadas en las enfermedades neurolgicas.

Un incremento de 10 a 100 clulas /mm
se encuentran en casos de meningitis tuberculosa,
poliomielitis, neurosfilis, tumores cerebrales y medulares, etc. Se observa un predominio de linfocitos.

3
Una pleocitosis de 100 a 500 clulas o mas /mm es frecuente observarla en las formas de meningitis
con predominio de polimorfonuclerares.
B) RECUENTO DIFERENCIAL CON PREPARACIONES TEIDAS

(Por tinciones hematolgicas y/o bacteriolgicas)
i) TINCIONES HEMATOLGICAS
La frmula celular en muchos casos proporciona datos de importancia diagnostica,, a este recuento se
le denomina citodiagnstico
REACTIVOS.
10. CITRATO DE SODIO
12. SOLUCION SALINA DE CLORURO DE SODIO
A) Preparacin de la muestra
La muestra de LCR se centrifuga durante 10 minutos por 2500 rpm, no conviene centrifugar a mayor
velocidad por el riesgo de hemlisis. El Lquido sobrenadante se separa cuidadosamente y es el que se emplea
para las determinaciones qumicas, mientras que el sedimento se emplea para las preparaciones a teir.
TECNICA
1) Depositar una pequea gota de material a estudiar sobre el portaobjeto limpio y seco.
2) Hacer un extendido delgado tipo hematolgico o bacteriolgico.
3) Dejar secar a temperatura ambiente. Y teir con la tcnica de May Gruenwald Giemsa para efectuar
la diferenciacin celular.
61
4) Puede teirse con Wright, Papanicolaou, etc. Una vez seca la preparacin examnela al microscopio
con objetivo inmersin, cuente de 100 a 500 clulas (leucocitos) distinguindolos.
Generalmente solo ser encuentra linfocitos y clulas epiteliales.
INTERPRETACIN CLINICA.
Una pleocitosis menor de 300 clulas / mm
suele ser linfocitaria y una pleocitosis mayor o excesiva
generalmente existe predominio de granulocitos neutrfilos.

Cuando predomina linfocitos (linfocitosis) se trata de procesos subagudos o crnicos, como meningitis
tuberculosa, reacciones agudas no bacterianas, neurosfilis, etc.
Predomina una neutrofilia en los procesos spticos agudos atribuido a meningococos, estreptococos,
neumococos, entre otros procesos.
La aparicin de Eosinfilos tiene valor significativo en el diagnstico de cisticercosis cerebral.
HALLAZGOS EN EL EXAMEN CITOQUIMICO DEL LCR EN INFECCINES DEL SNC

PARAMETROS
MENINGITIS
Clulas / mm
Protenas (mg/dl)
Glucosa (mg/dl)
PURULENTA
TUBERCULOSA
VIRAL
100 a 10 000
200 a 1000
50 a 100
100 a 599
100 a 200
50 a 90
10 a 40
21 a 40
40 a 50
OBSERVACION MICROSCOPICA DE MUESTRAS TEIDAS

II) TINCIONES BACTERIOLGICAS
REACTIVOS
2. TINCION DE GRAM
CRISTAL VIOLETA
IODO LUGOL
ALCOHOL ACETONA
SAFRANINA
FUCSINA FENICADA
ALCOHOL CIDO
AZUL DE METILENO
62
TINCION DE GRAM
1. Se prepara el extendido bacteriolgico (del sedimento obtenido en la centrifugacin de la muestra) y se deja
secar al aire, se fija por calor suave sobre a la flama de un mechero Bunsen y luego pasadas a travs de
ella (debe tenerse cuidado para evitar calor excesivo, que altere morfologa bacteriana).
2. La preparacin se coloca en un puente de tincin y se cubre con cristal violeta tiendo por un minuto, se
escurre.
3. Se cubre con Yodo lugol por un minuto, se escurre y se decolora con alcohol acetona en 2 tiempos de 15
segundos cada uno enjuagando entre ellos con agua de la llave (para no exceder la decoloracin), se
contra tie con Safranina de 30 a 60 segundos. Se escurre se enjuaga con agua, se deja secar y se
observa al microscopio con inmersin.
TINCION DE ZIEHL NEELSEN

1. Se efecta un extendido delgado del material a teir, sobre un portaobjetos NUEVO, se deja secar al aire y
se fija a la flama.
2. Se coloca sobre un puente, se cubre con solucin de fucsina fenicada y se calienta suavemente hasta
emisin de vapores dejando actuar por 5 minutos calentando varias veces, reponiendo el colorante que se
pierda por evaporacin.
3. Se lava con agua, se decolora con alcohol acido hasta que el extendido tome un color rosa plido, se
neutraliza con agua de la llave.
4.
Se cubre con azul de metileno por 1 minuto, se escurre, se lava con agua, se deja secar y se observa en
inmersin.
TECNICA
3. Seguir los procedimientos habituales de cada tincin y observar las preparaciones con aceite de inmersin
en el microscopio.
4. Al trmino de la observacin asegrese de dejar limpios los objetivos y la platina. As como colocar en
posicin de transporte segura el microscopio.
EXAMEN MICROBIOLGICO
El estudio bacteriolgico del LCR es esencial en el diagnstico etiolgico de las meningitis infecciosas.
En las meningitis bacterianas el LCR frecuentemente es purulento, con celularidad mayor de 1000/mm3 y
predominio de polimorfonucleares, la concentracin de glucosa esta disminuida y la cuenta bacteriana es
superior a 10 UFC/ml (Unidades Formadoras de Colonias).
En la meningitis causada por Mycobacterium tuberculosis, virus, hongos y parsitos, el LCR suele no ser
purulento, la pleocitosis es discreta con predominio de mononucleares y la concentracin de glucosa es normal
o ligeramente disminuida, la cuenta bacteriana es inferior a las 10 UFC.
63
TABLA NO. 2 AGENTES INFECCIOSOS ASOCIADOS A MENINGITIS

BACTERIAS
HONGOS
VIRUS
PARSITOS
Mycobacterium Tb
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Enterobacterias
Pseudomonas
Sthaphilococcus aureus
Streptococcus agalactiae
Criptococcus neoformans
Coccidioides inmitis
Histoplasma capsulatum
Blastomyces dermatitidis
De Parotiditis
Toxoplasma
Enterovirus
Cisticerco
Herpes virus simples
Naeagleria
Acantamoeba
Hartmanella
Herpes virus Zoster

Arbovirus
COMENTARIOS
1. Volumen ptimo requerido de LCR es de 7 ml y mnimo aceptable de 2 ml
3. Algunos agentes infecciosos son lbiles a temperatura ambiente. La muestra no deber refrigerarse antes
del examen microbiolgico.
4. Los frotis debern realizarse en portaobjetos nuevos.
EXAMEN INMUNOLGICO
El diagnstico temprano de las enfermedades infecciosas del SNC influye directamente en la evolucin y el
pronstico del paciente, por ello se han diseado varios procedimientos de diagnstico temprano como son
deteccin de endotoxinas, de anticuerpos y de fracciones antignicas en el LCR. Con los cuales es posible
hacer el diagnstico especfico en unos cuantos minutos.
Los procedimientos actualmente en uso son:
A) Deteccin de endotoxina por ensayo lmulus
- Bacilos Gram-negativos
B) Deteccin de Antgenos
- Por tcnicas de Coaglutinacin (o aglutinacin de ltex)
Haemophilus influenzae tipo B
Streptococcus pneumoniae
Neisseria meningitidis
Streptococcus agalactiae grupo B
Cryptococcus neoformans
- Por tcnica de ELISA
Mycobacterium tuberculosis
Cisticerco
La muestra del LCR puede filtrarse o centrifugarse, y el sobrenadante se utilizar para las determinaciones
inmunolgicas
64
TABLA NO.3 DATOS INICIALES EN LQUIDO CEREBROESPINAL EN ENFERMEDADES SUPURADAS DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL Y
MENINGES. 12
ENFERMEDAD
PRESION DE
AGUA (mm)
LEUCOCITOS/mm3
PROTEINAS
(mg%)
GLUCOSA
(mg%)
MENINGITIS BACTERIANA
>300
200 60 000
CON PREDOMINIO DE PMN
100 500
A VECES > 1000
< 40 EN MAS DEL

50% DE LOS
CASOS
EMPIEMA SUBDURAL
PROMEDIO > 300
DE 100 A 500
NORMAL
ABSCESO CEREBRAL
ELEVADO
DE 75 A 400
NORMAL
AUSENCIA DE MO. EN FROTIS Y CULTIVO
EMPIEMA VENTRICULAR
(ROTURA DE ABSCESO
CEREBRAL)
ABSCESO CEREBRAL
EPIDURAL
ABSCESO EPIDURAL
ESPINAL
TROMBOFLEBITIS
ENDOCARDITIS
BACTERIANA
ENCEFALITIS
HEMORRGICA
ENCEFALITIS
TUBERCULOSA
< 100 HASTA UNOS MILES,PREDOMINAN

PMN
DE 10 A 200, EN RAROS CASOS ES
ACELULAR, PREDOMINIO PMN
DATOS ESPECIFICOS
MICROORGANISMOS GENERALMENTE OBSERVADOS EN EL
FROTIS, OBTENIDOS POR CULTIVO EN MS DEL 90% DE LOS
CASOS
AUSENCIA DE MO. EN FROTIS O CULTIVO, A MENOS QUE HAYA
MENINGITIS
MUY ELEVADA
DE MILES A 100 000, GENERALMENTE

PREDOMINIO EN MAS DEL 90% DE PMN
> 100
< 40
PRESENCIA DE MO. EN FROTIS Y CULTIVO
LIGERAMENTE ELEVADA
DE POCOS A VARIOS CENTENARES

CON PREDOMINIO DE LINFOCITOS
DE 200
NORMAL
AUSENCIA DE MO. EN FROTIS Y CULTIVO
> 100
NORMAL
AUSECIA DE MO. EN FROTIS Y CULTIVOS, LA PUNCIN PUEDE

ENTRAR EN EL ABSCESO Y PROPORCIONAR PUS
NORMAL
AUSENCIA DE MO. EN FROTIS Y CULTIVO.
NORMAL
AUSENCIA DE MO. N FROTIS Y CULTIVO
NORMAL
AUSENCIA DE MO. EN FROTIS Y CULTIVO.
DE 100 200
O MAS
< DE 50 EN EL
75%DE LOS CASOS
PUIEDE ENCONTRARSE MO. BAAR, EN FROTIS DE COAGULOS U

OBTENERSE POR CULTIVO
DE 20 A 500
DE 30 EXCEPTO EN
PACIENTES
DIABETICOS
PRESENCIA DE MO. OBSERVADOS CON TINTA CHINA Y EN

CULTIVOS (SABOUREAUD, CRECEN EN AGAR SANGRE Y
PRODUCEN ALCOHOL POR FERMENTACION DE GLUCOSA)
NORMAL
V.D.R.L. POSITIVO
GENERALMENTE
REDUCIDA, CON
BLOQUEO ESPINAL
GENERALMENTE
ELEVADA
NORMAL O LIGERAMENTE
ELEVADA
GENERALMENTE
ELEVADA
GENERALMENTE
ELEVADA PEROPUEDE
SER BAJA
ENCEFALITIS
CRIPTOCOCCOCICA
ELEVADO PROMEDIO 225
E. SIFILTICA
GENERALMENTE
ELEVADA
DE 10 A 100, PREDOMINIO DE
LINFOCITOS
POCOS A VARIOS CENTENARES DE PMN
Y LINFOCITOS
POCOS A < DE 100, LINFOCITOS Y PMN
POCOS A MENOS DE MIL PREDOMINIO
PMN
DE 25 A 100, ES RARO MAS DE 500,
PREDOMINIO MN EXCEPTO ETAPAS
INICIALES
DE 0 A 800,PREDOMINIO MN
DE 500, PREDOMINIO DE MN
LIGERAMENTE
ELEVADO
LIGERAMENTE
ELEVADO
MODERADAMENTE
ELEVADA
DE 100,
PREDOMINIO
GAMMA GLOBULINA
65
SARCOIDE
NORMAL A ELEVADA
DE 0 A < DE 100, PREDOMINAN MN
LIGERAMENTE
ELEVADA
NORMAL
SIN SIGNOS ESPECIFICOS
NEPLASIA
GENERALMENTE
ELEVADA
DE 0 A VARIOS CENTENARES DE
CELULAS, PREDOMINIO MN
ELEVADA
NORMAL A
DISMINUIDA
PUEDEN IDENTIFICARSE CELULAS NEOPLASICAS
VIRAL
NORMAL O LIGERAMENTE
ELEVADA
DE 500 A MAS DE MIL
NORMAL O
LIGERAMNTE
ELEVADA
NORMAL O
DISMINUID
PUEDE OBSERVARSE EL VIRUS EN CULTIVOS
66
UNIDAD NO. 5 ANLISIS DE CLCULOS

Los clculos son masas solidas patolgicas constituidas por cristales y material orgnico
(mucoproteinas, clulas exfoliadas, leucocitos digeridas, bacterias, cogulos, etc.), habitualmente
localizados en sitios de mayor trnsito de secreciones. El anlisis cualitativo de clculos se basa en
identificar sus constituyentes qumicos que es la clave para conocer la alteracin que indujo su
formacin.
El propsito del anlisis de clculos es identificar la causa que facilito su formacin, as como
tambin la de apoyar en el tratamiento clnico y prevenir nuevas formaciones de clculos en los
pacientes.
Se han obtenido clculos en rin, intestino, conductos biliares, conductos pancreticos,
glndulas salivales, canal prosttico entre otros sitios, pero los que ms frecuencia causan
alteraciones son de origen biliar y renal.
Los mtodos de anlisis de identificacin de clculos pueden ser simples y complejos, dentro
de los simples est el anlisis fisicoqumico que consta de:
1. Examen Fsico
Nmero
Forma
Aspecto
Tamao
Color
Dureza
Peso total
Superficie
Friabilidad
2. Examen Qumico
Investigacin cualitativa de los componentes qumicos ms comunes de acuerdo al origen
tisular.
CONDICIONES PARA LA OBTENCION Y CONSERVACION DE MUESTRAS

1. Los clculos se obtienen por intervencin quirrgica, necropsia y/o por recolecta tras la
expulsin durante la miccin como es en los casos de clculos renales.
2. La extirpacin quirrgica de la vescula biliar (colecistectoma), o por coledocotomia
(extraccin de clculos del coldoco), son generalmente las tcnicas para la obtencin de
clculos biliares.
3. Mediante nefrectoma se retiran clculos de gran tamao del rin, por medio de cistoscopia o
tcnicas percutneas es posible eliminar clculos con canastillas o por medio de litotripsia con
ultrasonido, tambin en los casos agudos se utiliza le ureterolitotomia quirrgica.
67
4. El clculo se lava con agua destilada para eliminar todo vestigio de cogulos sanguneos,
restos de fibrina y/o soluciones conservadoras.
5. Se secan con papel filtro y en horno de aire caliente a 60-80 C por 48 horas.
6. Se mantiene por 60 minutos en un desecador y se conservan secos a temperatura ambiente
en un recipiente de tapa de rosca anexando un desecador.
7. Los clculos conservados secos se mantienen por un largo tiempo incluso por aos.
68
PRCTICA No 11
ANLISIS DE CLCULOS BILIARES
MTODO DE HENRY Y OSSER MODIFICADO
FUNDAMENTO
El colesterol determina mediante la reaccin de Liberman Burchard que se basa en la
extraccin cloroformica de colesterol del material biolgico y a tratarse con anhidrido actico cido
sulfrico concentrado produce un color verde. El calcio como oxalato se identifica por un precipitado
blanco que se obtiene al ajustar la solucin y un pH entre 3 y 4 con acetato sdico. El fosfato de
identifica en forma de fosfomolibdato amnico por el desarrollo de un color y/o formacin de un
precipitado amarillo. La bilirrubina se detecta mediante la reaccin de Ehrich.
REACTIVOS
ter
Oxalato potsico al 10%
Cloroformo
cido clorhdrico 2.0 N
cido ntrico concentrado
Reactivo para pruebas de fosfatos
cido sulfrico concentrado
Diazo reactivo de Ehrich
Anhdrido actico
Solucin de cido sulfanilico
Metanol
Solucin de nitrito sdico al 0.5%
Etanol
Agua destilada
Solucin saturada de acetato sdico
MATERIAL Y EQUIPO
2 matraces Erlen Meyer de 25 ml
2 vasos de precipitados de 50 ml
1 embudo de tallo corto
4 tubos de ensaye de 15 x 150 mm
1 pipeta lineal de 1 ml
1 gradilla
1 perilla
1 esptula
1 mechero Bunsen
69
1 mortero con pistilo
1 perilla de succin de lquidos
Tiras de papel pH
Papel filtro No. 40
INSTRUMENTACIN
Parrilla elctrica de calor regulable
TCNICA
1. Describir siempre que sea posibles caractersticas fsicas como nmero, forma, tamao, peso,
color, superficie, aspecto, dureza y friabilidad de los clculos.
2. Corte, aserre o rompa cuidadosamente el clculo para examinar su interior. Buscar cualquier
cuerpo extrao que haya podido de servir de ncleo para su formacin. Describir color y
contextura de su interior.
3. Pulverizar el clculo y reducirlo a polvo fino en un mortero. Coloque aproximadamente 15 mg
del polvo en un tubo de ensaye marcado como A y procure conservar una cierta cantidad del
mismo como reserva.
4. Extraer varias veces el polvo con porciones de 3 ml de ter. Filtre a travs de papel filtro
dentro de un embudo y reciba el extracto en un matraz Erlen Meyer, combine los extractos.
5. Evaporar los filtrados a sequedad y comprobar la presencia de colesterol.
6. Con 5 ml de cloroformo disuelva el extracto etreo desecado. Agregue 2 ml de anhdrido
actico y 2 gotas de cido sulfrico concentrado, mezcle y coloque en la oscuridad por 40
minutos a temperatura ambiente. La aparicin de un color verde traduce la presencia de
Colesterol.
7. Al residuo que queda en el tubo A despus de la extraccin etrea del paso No. 3, agregar 3
ml de HCL 2 N. Mezclar y verter a travs del mismo papel filtro empleado en la extraccin
etrea. Repita el tratamiento con cido, este extracto se rotula como filtrado acido.
8. Utilizar 0.5 ml del filtrado acido para comprobar la existencia de Calcio como oxalato: aadir
acetato sdico saturado hasta conseguir un pH de 4.0 aproximadamente (comprobndose con
papel pH), aada 2 gotas de oxalato potsico al 10%. Mezcle. Deje en reposo 10 minutos. La
presencia de un precipitado o turbidez blanquecina indica prueba positiva.
9. Para la determinacin de Fosfatos: utilizar 0.5 ml de filtrado acido, agregar 0.5 ml de cido
ntrico concentrado y hervir suavemente durante 5 segundos. Agregar 1.0 ml de reactivo de
70
fosfatos y hervir suavemente durante 3 o 4 segundos. El desarrollo de color y precipitado

amarillos indica presencia de Fosfatos.
10. Lave el papel filtro (empleado en el paso No. 5) con agua y squelo. Extrigalo varias veces
con cloroformo en caliente. Guardar el papel para otro paso posterior.
11. Si el filtrado clorofrmico tiene un color amarillo dorado seala que hay Bilirrubina.
12. Evapore el extracto a sequedad y compruebe la presencia de Bilirrubina mediante la reaccin
de Ehrlich: disolver el extracto en 5 ml de metanol, agregar 1.0 ml de diazo reactivo recin
preparado, la aparicin de un color rosa a violeta indica la presencia de Bilirrubina.
13. Extraer el papel filtro como ha quedado en el paso No 8 con etanol en caliente. Si hay
bilirrubina el filtrado debe tener un color verde.
71
CONSIDERACIONES GENERALES PARA EL MANEJO DE CLCULOS URINARIOS
1. Si no se ha hecho antes, lavar el clculo de sangre, moco, soluciones conservantes, etc., los
que llegan al laboratorio despus de la litotripsina presentan sangre y tejidos adheridos y son
difciles de limpiar.
2. Colocar los clculos en un envase adecuado, tapar con varias capas de gasa sujetas con
bandas de goma y lavar al agua corriente.
3. Escurrir, quitar con cuidado las gasas y secar los clculos el encase de una regadera (no con
agua corriente).
4. Registrar las dimensiones del clculo.
5. Describir brevemente el color y la consistencia al tacto de la superficie externa, hacer
fotografas para archivo si interesa.
6. Cortar, aserrar o romper el clculo a fin de estudiar su aspecto interno. Anotar el posible
cuerpo extrao que puede haber servido como ncleo de formacin.
7. Describir el color y consistencia del interior y de las distintas capas, si existen.
8. Pulverizar los clculos pequeos hasta obtener un polvo fino con el mortero.
9. Si es posible y el clculo es muy grande, puede ser aconsejable realizar anlisis separados de
las distintas capas que parezcan estar formadas por componentes diferentes.
72
PRCTICA No 12
ANLISIS DE CLCULOS URINARIOS
MTODO DE HENRY Y OSSER MODIFICADO
FUNDAMENTO
Los uratos se detectan por reduccin del fosfotungstato alcalino a azul de tungteno; la cistina
por el color rojo que forma en la prueba de cianuro clcico de nitroprusiato; el carbonato por liberacin
de CO2 despus de la acidificacin; el oxalato clcico por precipitacin a pH 3 a 4; otros tipos de
calcio por precipitacin con oxalato despus de eliminar el oxalato clcico intrnseco, el fosfato por
precipitacin como fosfomolibdato amnico; el magnesio mediante la reaccin del amarillo titn y la
xantina mediante la reaccin de la murexida y estudiando su espectro de absorcin ultravioleta. La
presencia del ion amonio de identifica por la aparicin de un color azul en la reaccin de hipoclorito
alcalino.
REACTIVOS
Carbonato de sodio al 14%
Cianuro de sodio al 5%
cido ntrico concentrado
Amarillo titn al 0.05%
Amonio en solucin concentrada
Hidrxido de sodia al 20%
cido clorhdrico concentrado
Reactivo de fosfatos
Acetato potsico reactivo de acido
Hidrxido de sodio 0.1 N
Reactivo de hipoclorito alcalino
Nitroprusiato sdico
Reactivo de color de fenol
Hidrxido de potasio 1 N
Oxalato potsico al 3%
Agua destilada
Fosfotngstico
MATERIAL Y EQUIPO
1 placa de porcelana excavada
1 varilla de vidrio
1 pinzas para tubo de ensaye
1 crisol
1 pipeta lineal de 1 ml
1 pipeta Pasteur con bulbo
73
1 mechero bunsen
1 esptula
1 gradilla
Papel filtro No 40
1 perilla de succin de lquidos
Tiras de papel pH
INSTRUMENTACION
Parrilla elctrica de calor regulable
Bao mara a 60C
Bao mara a 30C
Centrifuga clnica y serofugue
TECNICA
1. Describir siempre que sea posible las caractersticas fsicas como nmero, forma, tamao,
peso, color, superficie, aspecto, dureza y friabilidad de los clculos.
2. Corte, aserre o rompa cuidadosamente el clculo para examinar su interior. Buscar cualquier
cuerpo extrao que haya podido de servir de ncleo para su formacin. Describir color y
contextura de su interior. Los clculos de oxalatos suelen sr muy duros y muestran a menudo
una superficie regular, cristalina o con facetas; los de cido rico son menos duros; los de
fosfatos son blandos, incluso friables; los de cistina tienen una consistencia blanda y crea.
3. Pulverizar el clculo en un tubo de ensaye con una varilla de vidrio o en un mortero segn
tamao. Transferir aproximadamente 2 mg del clculo pulverizado a otro tubo de ensaye para
el anlisis de amonio (paso 12). Guardar siempre una cantidad del material como reserve.
4. Transferir de 5 a 10 mg del clculo pulverizado en un tubo de ensaye de 12 x 75 mm. Agregar
1 ml de NaOH 0.1 N y calentar en un bao de agua a 60 C durante 5. Agitar el tubo de 2 a 3
veces durante este periodo. Centrifugar entonces y descarte el sobrenadante a otro tubo de
ensaye marcado como A para la prueba de uratos y cistina (paso 5). Enjuagar las paredes
del tubo que contiene el precipitado con 1 ml de agua, mezclar, centrifugar y eliminar el
sobrenadante. Repetir el lavado una vez ms. Guardar el residuo para otras pruebas (paso 6).
5. A) Transferir una gota del extracto de NaOH (del tubo A) obtenido en el paso anterior, a una
placa plana. Agregar una gota de Na2CO3 y mezclar con una varilla de vidrio. Agregar una
gota da cido fosfotngstico y mezclar. La presencia de un color azul oscuro indica la
presencia de cido rico y/o Uratos (un color azul dbil no es significativo)
74
B) Transferir una gota del extracto de NaOH obtenido en el paso 4 a una placa agregar una
gota de amonio y una gota de cianuro sdico CUIDADOSAMENTE!!, inmediatamente de
utilizar el reactivo vulvalo a tapar ALTAMENTE TOXICO. Dejar en reposo durante 5
minutos y agregar entonces una gota de reactivo de nitroprusiato. El desarrollo de un color
purpura oscuro indica la presencia de Cistina.
6. Agitar el tubo que contiene el residuo lavado despus de la extraccin con NaOH (paso 4) y
dejar caer en el mismo resbalando por la pared una gota da cido clorhdrico concentrado.
Observe atentamente en el tubo en el momento en que hace contacto la gota de cido con el
residuo sdico. La aparicin de burbujas de gas, momentnea pero abundante indica la
presencia de Carbonato, agregar luego 0.2 ml de HCL y 0.5 ml de agua destilada. Hervir
suavemente durante unos pocos segundos, enfriar y centrifugar.
7. Transferir 0.3 ml del sobrenadante obtenido en el paso 6 a un tubo de ensaye de 12 x 75 mm.
Agregar al mismo, reactivo de acetato potsico, pH 3 a 4. (utilcese el papel pH para confirmar
el valor). Dejar reposar 10 minutos, la aparicin de un precipitado o de un notable
enturbiamiento traduce la presencia de Oxalato de calcio (la cistina puede dar un resultado
positivo falso). Centrifugue.
8. Transferir el sobrenadante del paso 7 a otro tubo de 12 x 75 mm. Agregar 2 gotas de la
solucin de oxalato potsico y suficiente cantidad de agua para aproximadamente duplicar el
contenido del tubo. Dejar reposar durante 10 minutos. Si aparece un precipitado o un
enturbiamiento fuerte, ello indica la presencia de calcio distinto al oxalato. Centrifugar.
9. Transferir 2 gotas del sobrenadante del paso 6 a otro tubo de 12 x 75 mm. Agregar 2 gotas de
cido ntrico concentrado y hervir suavemente durante 5 segundos cuidadosamente. Aadir 2
gotas de reactivo de fosfomolibdato y hervir suavemente durante 3 a 4 segundos. Si aparece
un color y/o precipitado amarillo indica la presencia de Fosfato.
10. Transferir el resto del sobrenadante del paso 8 a otro tubo de 12 x 75 y agregar 2 gotas de
reactivo de amarillo titan y 0.5 ml de las solucin de NaOH al 20%. Si aparece un color rojo,
que cambia en aproximadamente en uno o dos minutos apareciendo entonces un precipitado
del mismo color, ello indica la presencia de Magnesio.
11. Si una notable porcin del clculo se disuelve en sosa (paso 4) y la prueba de la cistina, del
cido rico son negativas, entonces comprobar la eventual presencia de Xantina en los
extractos obtenidos con el NaOH en forma siguiente:
a. Transferir 4 gotas del extracto obtenido con NaOH en un pequeo mortero o crisol de
porcelana limpio y agregar al mismo 2 gotas de cido ntrico concentrado. Evaporar a
sequedad en un bao de agua. Agregar 1 gota de KOH 1N. si se desarrolla un color
rojo purpura indica la presencia de Uratos. Calentar el mortero sobre el bao de agua
75
durante aproximadamente 1 minuto. Si solo hay uratos, el color rojo purpura

desaparecer; si hay xantina se presenta u color amarillo antes del calentamiento y
despus de la mismo vira a color rojo purpura.
12. Agregar al clculo pulverizado (2 mg) contenido en un tubo de ensaye 0.1 ml de cido
clorhdrico concentrado cuidadosamente. Agregar 0.3 ml de agua, mezclar y hervir. Transferir
2 gotas de este extracto acido a otro tubo de ensaye y aadir al mismo 0.5 ml de agua, 3
gotas de NaOH al 20% y 0.1 ml de reactivo de fenol y mezclar. Aadir 0.1 ml de la solucin de
hipoclorito alcalino y mezclar. Incubar a 37 C durante 20 minutos. La aparicin de un color
azul evidente traduce la presencia de Amonio. Un color azul ligero, incluso si es un poco ms
azul que el del blanco no debe considerarse. Analizar un blanco o control negativo omitiendo
el extracto acido, procselo exactamente igual que el problema. Y el control positivo haciendo
la determinacin con 4 ml de agua a la que se haya agregado un pequeo cristal de sulfato de
amonio. Seguir la tcnica como si fuera problema.
76
UNIDAD NO. 6 ANLISIS DE LQUIDO SEMINAL

Siendo la esterilidad un problema mdico frecuente y de alta repercusin en la vida de una
pareja, es importante la aportacin del laboratorio clnico en la investigacin de la causa que la origina
para poder establecer conductas teraputicas.
Es conveniente mencionar que los trminos esterilidad e infertilidad para muchos autores
significan lo mismo, incapacidad de producir un fruto. Pero empleando un criterio ms amplio se
considera una pareja estril cuando despus de un ao de haber dejado de usar anticonceptivos la
mujer y de tener relaciones sexuales conyugales normales, no hay embarazo. Sin embargo, cuando
hay embarazo pero aborta en forma repetida y cuando se logra un hijo, pero despus tiene abortos
repetidos o no llega a embarazarse a esta pareja se le considera infrtil.
Inicialmente el laboratorio se limitaba a estudiar el semen directamente para averiguar
alteraciones cualitativas y cuantitativas de espermatozoides, sin embargo actualmente se considera
que la esterilidad es un problema de la pareja por lo que se han elaborado procedimientos para
estudiar al mismo semen pero en medio ambiente vaginal tratando de investigar si existen causas
locales (pH, infecciones, etc) que dificulten el paso de los espermas a travs del canal cervical.
Otras aplicaciones importantes del estudio del semen es en el campo de medicina legal, en
los problemas especficos de exclusin de paternidad alegando esterilidad, en los casos de violacin
o estupro alegada o sospechada, demostrando la ausencia o presencia de lquido seminal en
materiales biolgicos y otros materiales diversos. Finalmente otro inters del examen es, en el control
de natalidad utilizndose para comprobar la eficiencia de una vasectoma. En esta unidad se
describen procedimientos de laboratorio utilizados ms frecuentemente para estudiar al lquido
seminal.
El estudio del semen consta de tres tipos de exmenes que son el fsico, qumico y
microscpico, estos a su vez incluyen las siguientes determinaciones:
I.
EXAMEN FSICO
a) Volumen
b) Color
c) Aspecto
d) Viscosidad y licuefaccin
e) pH
II.
EXAMEN MICROSCPICO
a)
Recuento
b) Motilidad
77
c) Vitalidad
d) Morfologa
III.
EXAMEN QUMICO
a) Capacidad fecundante
b) Fosfatasa cida
c) Fructosa
Se incluyen pruebas adicionales para comprobar la presencia de semen en diversos

materiales.
OBTENCIN DE LA MUESTRA
El lquido seminal puede analizarse por dos procedimientos de acuerdo a la tcnica de obtencin de la
muestra:
a) Espermatobioscopa directa
b) Espermatobioscopa indirecta.
La recoleccin de la muestra es la diferencia bsica entre ambas; para realizar la Espermatobioscopa
directa la muestra se obtiene por masturbacin, sea en el laboratorio o en el domicilio del paciente y tambin
puede recolectarse por coito interrumpido. Mientras que, para realizar la Espermatobioscopa indirecta o
funcional se recurre a una prueba postcoito su recoleccin se detalla ms adelante.
En ambas pruebas se debe informar explcitamente al paciente en qu y cmo se debe obtener la
muestra.
OBTENCIN DE LA MUESTRA PARA ESPERMATOBIOSCOPA DIRECTA
Para asegurar una mejor calidad del semen es conveniente que el paciente se someta a un rgimen
de abstinencia sexual que comprenda por lo menos 4 das antes de la prueba. La muestra debe depositarse de
preferencia en recipientes de vidrio de boca ancha, de color mbar, perfectamente limpios, los recipientes
tambin pueden ser los contenedores habituales de plstico. El frasco que recibir la muestra deber estar a
temperatura corporal en el momento de la eyaculacin, a fin de no afectar la vitalidad-movilidad de los
espermatozoides. Si la muestra se obtiene fuera del laboratorio debe ser trasladada inmediatamente a ste,
procurando mantenerla lo ms cerca del cuerpo para que la temperatura no disminuya. El frasco que contenga
la muestra debe rotularse de la siguiente manera: Si durante el transporte o la manipulacin de la muestra parte
de ella se pierde (por eyaculacin incompleta, derrame, etc.) una muestra as no es representativa por tanto no
es til para el anlisis.
- Nombre del paciente

- Fecha
- Hora de eyaculacin
- Das de abstinencia sexual
78
PRCTICA No. 13
ANLISIS DE LQUIDO SEMINAL
ESPERMATOBIOSCOPA DIRECTA
La Espermatobioscopa directa tiene como objetivo investigar si la calidad y la cantidad de lquido
seminal son las adecuadas para lograr la fertilizacin.
EXAMEN FSICO
A) Volumen
B) Color
C) Aspecto
D) Viscosidad y licuefaccin
E) pH

1
pipeta lineal de 10 ml (1/10)
varilla de vidrio
portaobjetos
papel pH
gradilla
INSTRUMENTACIN
No necesaria
A) VOLUMEN
El volumen vara ampliamente de 1.0 a 1.6 ml aproximadamente. La mayor parte de lquido seminal
est constituido por la secrecin de vesculas seminales y la prosttica y una menor proporcin de secreciones
de las glndulas bulbo uretrales.
La determinacin del volumen se hace ocupando una probeta o pipeta graduada de 10 ml. Cuando la
cantidad de lquido seminal es muy escasa se reporta como menos de 0.5 ml o unas pocas gotas.
Se han considerado infrtiles aquellos smenes con volmenes menores de 1.5 ml, aunque las pruebas
de morfologa y motilidad se encuentran normales. Tambin caen dentro de esta consideracin aquellos
79
smenes con volmenes elevados cuyo nmero de espermatozoides est debajo de los 60 millones por ml.
Que es el caso ms comn en los matrimonios estriles.
B) COLOR
Generalmente el lquido seminal es de color blanco grisceo a blanco amarillento. Un color amarillo
puede observarse en la abstinencia sexual prolongada y amarillo intenso en los casos que hay pus
(piospermia). Generalmente no hay relacin entre la cantidad de leucocitos y la intensidad del color amarillo del
semen.
Un color caf-rojizo se debe a sangre bemolizada como se observa en casos de vesiculitis seminal y
prottica. Un color rojo se debe a la presencia de sangre (hemospermia) que se encuentra en prostatitis y
traumatismos. Un color verdoso puede deberse a infeccin por pseudomonas.
C) ASPECTO
El lquido seminal recin emitido tiene un aspecto heterogneo (8) ya que se encuentra en forma de
coagulo, muy viscosos y opaco (4), despus de transcurrida la licuacin se hace homogneo. La turbiedad se
relaciona con la densidad de la poblacin celular por lo que depende del nmero de los espermatozoos, los
leucocitos, los eritrocitos y algunos microorganismos.
D) VISCOSIDAD Y LICUEFACCIN
La secrecin espermtica recin eyaculada exhibe una gran viscosidad, seguida de una licuefaccin
que se completa entre 15 y 30 minutos adquiriendo un aspecto homogneo.
La viscosidad tiene cierta importancia sobre todo cuando los espermatozoides presentan vitalidad y
movilidad inferior a lo normal. La determinacin
de la viscosidad es muy sencilla y consiste en agitar
fuertemente el esperma contenido en le frasco con una varilla de vidrio, se retira la varilla suavemente
calculando al levantarla la longitud del filamento formado.
Otro procedimiento consiste en colocar una gota de semen (homogeneizado y despus de la completa
licuefaccin) sobre un portaobjetos y ayudndonos con un palillo proseguir en la forma ya descrita. Se
considera normal una viscosidad de 2 a 5 mm. La licuacin depende de las fibrinolisinas potente presentes en
condiciones normales. La viscosidad disminuida se presenta generalmente en smenes con muy pocos
espermatozoides. La viscosidad aumentada puede interferir en la movilidad de los espermatozoides y suele
observarse en prostatitis crnica y vesiculitis seminal.
E) pH
El esperma recin emitido tiene un pH ligeramente alcalino que vara de 7.3 a 7.5 , esta determinacin
se hace lo ms pronto posible debido a que en contacto con en el medio ambiente el semen se va alcalinizando
pudiendo llegar hasta un pH de 8.
80
EXAMEN QUMICO
A) Capacidad fecundante
B) Fosfatasa cida
C) Fructosa
A) DETERMINACIN DE LA CAPACIDAD FECUNDANTE.

FUNDAMENTO
Los espermatozoides consumen oxgeno y producen sustancias oxidadas que disminuyen el potencial
oxido-reduccin hasta valores negativos. El grado de variacin de dicho potencial depender del nmero de
espermatozoides y la intensidad del metabolismo de los mismos. La variacin se mide aadiendo un indicador
como el azul de metileno que en estado reducido es azul y al oxidarse se vuelve incoloro.
REACTIVOS:
1. SOLUCIN DE AZUL DE METILENO 0.01%

1
tubos capilares de 3 x 200 mm

plastilina
gradilla
INSTRUMENTACIN
Estufa a 37oC
TCNICA
1. En un tubo de ensaye se coloca volmenes iguales de esperma y azul de metileno (por ejemplo 1 ml de
colorante y 1 ml de esperma), el cual deber estar completamente licuado hasta con una hora de emitido,
mezclar.
2. Se utilizan 2 tubos capilares, en uno de ellos se coloca la mezcla anterior (problema) y en el otro que se usa
como testigo se carga con solucin de colorante.
3. Se sellan con plastilina los extremos de los tubos y se colocan en la estufa a 37 C. Se anota la hora y se
hacen observaciones cada 5 minutos hasta determinar el momento en que comienza la decoloracin.
4. Se anota este tiempo y se continan las observaciones hasta que se complete la decoloracin total. Se
informa el tiempo del comienzo de la decoloracin y el tiempo de la decoloracin total.
81
La decoloracin total se produce en 15 a 30 minutos Cuando la fertilidad es ptima la decoloracin se
produce en 15 a 30 minutos y cuando es moderada de 60 minutos aproximadamente
B) DETERMINACIN DE FOSFATASA ACIDA

Revise la tcnica disponible y ajstela a las condiciones de determinacin, o bien emplee el mtodo
tradicional que a continuacin se describe.
La fosfatasa cida del lquido seminal es de origen prosttico casi exclusivo se halla en concentraciones
muy altas comparado con la concentracin de fosfatasa cida srica, por ello es necesario efectuar diluciones
convenientes antes de realizar la determinacin. La determinacin de esta enzima se realiza por los mtodos
habituales empleados para las muestras sricas. Es comn emplear el mtodo de Bessey & Lowry Broock que
se basa en la hidrlisis del p-nitrofenilfosfato catalizada por la enzima fosfatasa cida liberando p-nitrofenol,
que en un medio alcalino se transforma en p- nitrofenolato de sodio que es un in amarillo cuya intensidad es
proporcional a la actividad de la enzima presente en la muestra
REACTIVOS:
1. SOLUCIN TAMPONADA DE CIDO CTRICO-CITRATO DE SODIO
2. SUSTRATO TAMPONADO: P-NITROFENILFOSFATO NaOH 0.02 N
3. SOLUCIN ESTNDAR DE P-NITROFENOL
4. SOLUCIN DE CALIBRACIN DE P-NITROFENOL

7
gradilla
plastilina
INSTRUMENTACIN
o
Bao mara a 37 C
Espectrofotmetro
82
TCNICA:
1. Diluir el esperma 1:100 y 1:1000 con solucin salina isotnica
2. En 3 tubos de ensayo marcados como blanco, problema 1 (%) y problema 2 (%o), agregar 1 ml de sustrato
o
tamponado. Llevar a bao de agua a 37 C por 3 minutos.
3. Agregar a los problemas 0.2 ml de dilucin del esperma respectivamente. Incubar a 37 C durante 30
minutos.
4. Retirar del bao y agregar a cada tubo 10 ml de NaOH al 0.02 N. En este momento agregar 0.2 ml de la
dilucin del semen al tubo blanco. Mezclar por inversin los tubos.
5. Leer la absorbancia llevando a cero con el blanco 400 nm.
6. Interpolar en la curva de calibracin.
7. Multiplicar por el factor de dilucin (1000).
De 55 000 a 137 500 mUI / ml
CURVA DE CALIBRACIN.
1. En 5 tubos de ensaye marcados respectivamente como T 1, T2, T3, T4 , T5 , depositar 1 ml de sustrato
tamponado a cada tubo.
2. Incubar a 37 C durante 5 minutos. Agregar a cada tubo 0.2 ml de las soluciones de calibracin de pnitrofenol respectivas
3. Incubar durante 30 minutos a 37 C.
4. Retirar y agregar inmediatamente 10 ml de NaOH 0.02 N, mezclar por inversin los tubos.
5. Leer en absorbancia a 400 nm, ajustando a cero con el blanco de reactivos.
6. Graficar en papel semilogartmico. Colocando en las abcisas las concentraciones de los testigos en mU/I y
en el eje de las ordenadas las densidades pticas.
CLCULOS:
Para convertir las concentraciones de los testigos en mUI/ml, recordar que micromol /litro es igual 1 UI/
litro.
C) DETERMINACIN DE FRUCTOSA.5
FUNDAMENTO
Est basado en el calentamiento de la fructosa en presencia de HCL resorcinol (Reactivo de Seliwanoff)
produce el oxi-metil-furfural que con la resorcina produce un compuesto de color rojo cuya intensidad es
proporcional a la concentracin de este carbohidrato en la muestra de lquido seminal.
REACTIVOS:
1. SOLUCIN DE RESORCINA AL 0.1 %
2. SOLUCIN CLORHDRICA AL 30 %:
3. SOLUCIN MADRE DE FRUCTOSA AL 1 %
4. SOLUCINES TESTIGO DE FRUCTOSA
83

6
gradilla
plastilina
INSTRUMENTACIN
o
Bao mara a 80 C
Espectrofotmetro
TCNICA
1. Se diluye el esperma 1: 10 y 1: 100 en solucin salina isotnica..
2. En unos tubos marcados como problema se colocan 2 ml de la dilucin de esperma. En otro tubo marcado
como blanco se colocan 2 ml de agua y a otros 3 tubos marcados con T 1, T2, T3, colocar 2 ml de cada
dilucin testigo.
3. A cada tubo se agregan 2 ml de solucin de resorcina y 6 ml de solucin clorhdrica. Se agitan.
4. Colocar todos los tubos en bao de agua a 80 C durante 8 minutos. Se retiran los tubos y enfriarlos.
5. Leer a 520 nm ajustando a 0 de absorbancia con el blanco.
6. Graficar en papel milimtrico las lecturas obtenidas de los testigos.
7. Interpolar la lectura del problema en la grfica obtenida
PREPARACION DEL DESPROTEINIZADO DEL SEMEN

REACTIVOS
1. Solucin de NaoH 0.1 M (50 ml)
2. Solucin de Sulfato de Zinc 1.8% (p/v) (50 ml)
1. Diluya el semen 1:50 con agua destilada, agregando 0.l ml de semen a 4.9 ml de agua destilada
2. Coloque l ml de semen diluido en un tubo de 13 x 100 mm.
3. Agregue 0.3ml de sulfato de Zinc y mezcla.
4. Agregue 0.2 ml de NaOH y mezcle perfectamente.
5. Deje en reposo 15 minutos y centrifugue a 3400 rpm por 10 minutos.
6. Separe cuidadosamente el sobrenadante para realizar la cuantificacin de fructosa.
84
VALOR DE REFERENCIA
De 200 a 400 mg/100 ml
Considere factible la desproteinizacin del semen para que la turbidez natural de esta muestra no interfiera en
los resultados colorimtricos.
EXAMEN MICROSCPICO
A) Recuento
B) Motilidad
C) Vitalidad
D) Morfologa
A) MOVILIDAD

5
portaobjetos
cubreobjetos
pipetas Pasteur con bulbo

gradilla
INSTRUMENTACIN
Microscopio binocular
TECNICA
1. Despus de que la licuefaccin se ha completado se coloca una gota de semen entre portaobjetos y
cubreobjetos. Previendo mezclar la muestra por inversin antes de tomar la gota de muestra.
2. Utilizando el objetivo seco fuerte de microscopio se cuenta por separado el nmero de espermatozoides:
inmviles o acinticos; con motilidad in situ y con movilidad de progresin (la que puede ser rpida o lenta),
presentes en diez campos (aproximadamente 200 espermatozoides como mnimo).
3. Se informa en por ciento el promedio de espermatozoides en cada una de las cuatro categoras
mencionadas.(MPR, MPL, MI, Inmviles)
4. Adems de observar la motilidad de los espermatozoides se busca la presencia de leucocitos, eritrocitos,
clulas epiteliales, piocitos, cristales, parsitos y hongos.
85
Normalmente despus de las 2 horas de eyaculacin un 60 a 70 % de espermatozoides muestran
movilidad progresiva rpida. De 6 a 8 horas la movilidad es de un 25 a 40 %. Las formas mviles disminuyen
alrededor del 5 % por hora despus de la cuarta hora de la recogida.
Con respecto a la presencia de otros elementos formes, hallados en el semen se considera dentro de lo
normal el hallazgo de varios cristales y clulas epiteliales; no es comn encontrar eritrocitos, valores de
6
leucocitos hasta 4.7 por 10 ml de eyaculado.

Cuando la motilidad es elevada pero est reducida a espermatozoides mviles n situ o con
movimientos progresivos
lentos, no existiendo espermatozoides
con movimientos progresivos
rpidos, el semen no tiene la capacidad fecundante y se habla de una astenozoospermia absoluta a

valores menores del 30 %, la ausencia de motilidad se conoce con el nombre de adromozoospermia.
B) VALORACIN DE LA MORFOLOGA DEL ESPERMATOZOIDE

i)
Tcnica de tincin de Schaudin
ii)
Tcnica de tincin de Wright
i) TCNICA DE TINCIN DE SCHAUDIN

Las formas normales y anormales del espermatozoide se determinan en extensiones teidas, mediante
recuentos diferenciales.
REACTIVOS
1. SOLUCIN DE SHAUDIN (SOLUCIN ACUOSA DE BICLORURO DE MERCURIO)
2.
ALCOHOL AL 50 %
3. SOLUCIN DE TINTURA DE IODO

4. SOLUCIN ACUOSA DE EOSINA AL 5 %.
5. SOLUCIN ACUOSA DE HCL
6. HEMATOXILINA
7. SOLUCIN DE CIDO ACTICO GLACIAL
8. AGUA DESTILADA.

7
cajas Coplin
portaobjetos

gradilla
Pinzas para tincin
86
INSTRUMENTACIN
TCNICA:
1. Las extensiones se preparan en portaobjetos limpios de modo idntico a la sangre. La mejor tincin para un
detalle morfolgico mejor es el mtodo de Papanicolaou, otro tambin satisfactorio es el que a continuacin
se describe.
2. Se hacen frotis delgados sobre portaobjetos. La mejor manera de prepararlos es seguir la tcnica de
suspensiones bacterianas utilizando un palillo en lugar de una asa de platino. Los frotis preparados por la
tcnica de las extensiones sanguneas no son muy recomendables.
3. Fijar con un solucin de Shaudin sumergiendo un minuto en la solucin de bicloruro de mercurio. Secar.
4. Sumergir durante medio minuto en alcohol al 50 % . secar
5. Sumergir durante medio minuto en un solucin de iodo, lavar con agua corriente.
6. El frotis se colorea sumergindolo medio minuto en una solucin acuosa de eosina al 5 %, secar y sumergir
un minuto en una solucin de HCl, lavar con agua destilada. Sumergir durante dos y medio minutos en
hematoxilina.
7. Secar y sumergir las preparaciones en una solucin de cido actico glacial en dos tiempos de 15
segundos. Lavar con agua destilada, entre los tiempos, secar y observar al microscopio.
8. Se cuentan de 100 a 200 espermatozoides que con este mtodo se colorean el ncleo azulado y el
citoplasma rojizo. Se establece el porcentaje de formas anormales con respecto al tamao, forma y
disposicin nuclear.
Normalmente no deben encontrase anomalas morfolgicas (doble cabeza , macrocefalia, microcefalia,
cabeza periforme, cabeza amorfa, cuerpo o cola defectuosa, etc. ) en ms del 25 % del total de los
espermatozoides. Ms del 25 % de espermatozoides anormales tiene importancia en relacin con la
esterilidad y subfertilidad.
C) RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES
Prueba de Macomber y Sauders (1)
FUNDAMENTO
La cuantificacin de espermatozoides se obtiene de la misma forma como se hace para los leucocitos.
El lquido de Macomber y Sauder contiene bicarbonato de sodio que impide la accin del moco, fluidificndolo y
permitiendo una mejor visualizacin de los espermas y el formol los inmoviliza.
87
REACTIVOS
1.
LQUIDO DE MACOMBER Y SAUDERS

2
pipetas Thoma para leucocitos
cmara de Neubauer
boquilla con tubo de ltex de 40 cm
tubos de ensaye de 12 x 75 mm
gradilla
INSTRUMENTACIN
TCNICA:
1. Antes de cargar la pipeta de cuenta glbulos, la muestra debe homogeneizarse perfectamente puesto que
en el semen hay espermatozoides mviles e inmviles, sedimentando
en el frasco estos ltimos. La
homogeneizacin debe hacerse por rotacin cuidadosa evitando la formacin de espuma. Cuando los
smenes son muy viscosos es necesario rotar mucho la muestra para homogeneizar lo mejor posible y
cargar 2 pipetas Thoma promediando los resultados.
2. Con un pipeta para glbulos blancos se aspira semen hasta la marca de 0.5 y luego el lquido de dilucin
hasta la marca de 11 (dilucin 1:20), si el nmero de espermatozoides es muy bajo, conviene aspirar
semen hasta la marca de 1 de la pipeta (dilucin 1:10 ).
3. Se agita vigorosamente la pipeta hasta que el lquido en la porcin mpula sea homogneo.
4. Se desechan las 3 primeras gotas y se carga la cmara cuenta glbulos.
5. Se cuentan los espermatozoides en 4 mm cuadrados. Para el clculo se multiplica por dilucin y por
correccin de la profundidad de la cmara (10) para obtener la cifra por mm
obtener la cifra por mililitro.
CALCULOS
No. de espermatozoides /ml = No. de E (10)
(20)
(1000)
50 000
4
O =
No. de espermatozoides /ml = No. de E
E = espermatozoides
88
y finalmente por 1000 para
6
6
60 por 10 o ms por mililitro a 150 a 200 x 10 en la eyaculacin completa. La mnima normal es de 40
6
x 10 /ml. Se ha encontrado que las cuentas bajas de espermatozoides se relacionan frecuentemente con la
subfertilidad y a veces con la infertilidad del hombre
.
D) PRUEBA DE VITALIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES INMVILES
i)
i)
PRUEBA DE HURGO Y DI PAOLA
ii)
PRUEBA DE WILLIAMS
PRUEBA DE HURGO Y DI PAOLA
FUNDAMENTO:
Se basa en la propiedad de la eosina de colorear nicamente las clulas muertas y no las vivas. Debido
a que los espermatozoides muertos pierden la capacidad de controlar la selectividad de su membrana.
REACTIVOS
1. REACTIVO DE EOSINA AL 0.5 %.


2
portaobjetos
cubreobjetos
Aplicadores de madera
INSTRUMENTACIN
TCNICA
1. En un portaobjetos se colocan volmenes iguales de semen y reactivo (puede ser desde 30 hasta una
gota, se mezclan y se deposita un cubreobjetos. La observacin microscpica se hace dentro de las dos
primeras horas de recogido el semen.
2. Una vez mezclado el semen con el reactivo, se esperan 5 minutos y se observa al microscopio.
3. Se cuentan 200 elementos , teniendo en cuenta las tres categoras siguientes:
a) Espermatozoides muertos coloreados
b) Espermatozoides vivos inmviles no coloreados
c) espermatozoides vivos mviles no coloreados
4. Reportando diferencias de vitalidad cintica y esttica ( ver espermatobioscopia indirecta)
89
II) PRUEBA DE WILLIAMS
FUNDAMENTO:
Esta coloracin se basa en la propiedad que tiene los espermatozoides muertos de permitir la libre
entrada de sustancias coloridas a travs de su membrana, pues son incapaces de controlar la permeabilidad
selectiva de ella.
REACTIVOS
1. SOLUCIN ACUOSA DE NIGROSINA AL 10 %
2. SOLUCIN ACUOSA DE EOSINA AL 5 %

2
portaobjetos
cubreobjetos
Aplicadores de madera
INSTRUMENTACIN
TCNICA
1. Sobre un portaobjeto poner separadamente en un extremo una gota (puede ser menos)de la solucin de
nigrosina y en el otro una gota de la solucin de eosina y una gota de semen o esperma.
2. Mezclar la gota de semen con la eosina y luego la gota de nigrosina con la mezcla procedente. Se opera
con rapidez (15 a 20 segundos). Hacer un extendido, secar rpidamente y examinar al microscopio.
3. Slo se colorean de rojo los espermatozoides que estn muertos en el momento de la mezcla.
A los 30 minutos de eyaculacin es normal encontrar el 80 % de espermatozoides mviles y el 20 %
de inmviles, de los cuales el 16 % son coloreados (muertos) y el resto (4 %) son no coloreados o sea vivos
inmviles
90
.
Cuadro No. 1 RELACIN TIEMPO-MOVILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES
TIEMPO TRANSCURRIDO
30 minutos
2 horas
4 horas
8 horas
DESDE LA EYACULACIN
80
75
60
60
10
15
15
20
30
45
Mviles Progresivos Rpidos

Mviles Progresivos Lentos
Mviles in situ
Inmviles
El aumento de espermatozoides vivos con movimientos in situ y de espermatozoides muertos est

relacionado con la subfertilidad masculina. Ya que los espermatozoides tienen que atravesar el moco cervical
a los pocos minutos de la eyaculacin, y si hay un aumento de los espermatozoides muertos e inmviles vivos
en esta prueba, el nmero de espermatozoides mviles al atravesar el moco cervical va a disminuir por el pH
bajo de las secreciones vaginales.
91
PRCTICA No. 14
COMPROBACIN DE PRESENCIA DE SEMEN EN MATERIAL
PROCEDENTE DE VAGINA, PIEL, PELO Y ROPA.
FUNDAMENTO
En determinadas circunstancia cuando se sospecha de alguna violacin o ataque sexual que puede
terminar en homicidio, se recurre a la investigacin de la presencia de semen para esclarecer la situacin.
Deben seguirse precauciones especiales pues la afirmacin o negacin de ello es muy delicada.
DEMOSTRACIN DE PRESENCIA DE ESPERMATOZOOIDES
REACTIVOS:
1. SOLUCIN ACUOSA DE EOSINA AL 0.5%
2. SOLUCIN DE NaCl al 0.9%

2
Portaobjetos
cubreobjetos
INSTRUMENTACIN
Centrifuga y Microscopio binocular
OBTENCIN DELA MUESTRA

1. Las secreciones vaginales pueden obtenerse mediante aspiracin directa con una cnula, pipeta Pasteur o
con lavado de solucin salina.
2. En el caso de tejidos con manchas desamen es recomendable una visualizacin previa con luz ultravioleta
para seleccionar reas especficas para investigacin, ya que las manchas de semen producen una
fluorescencia blanca verdosa (otros lquidos producen tambin esta coloracin)
2
3. Se cortar un rea de 1 cm del tejido manchado y se sumergir en 1 o 2 ml de solucin salina en tubo de

ensaye, por un tiempo de 1 hr. Es aconsejable incluir en otro tubo un trozo de tejido lejano a la mancha
como control negativo.
4. Concentrar dicho lavado por centrifugacin a 2500 rpm por 5 minutos tanto el control negativo como el
problema, retirando previamente los tejidos (telas de los tubos)
5. Se separa el sobrenadante cuidadosamente y resuspenda el precipitado.
92
6. Coloque una gota de este precipitado con una gota de eosina entre porta y cubreobjetos. Observe
microscpicamente 10 campos por lo menos, en objetivo seco fuerte. Reporte los resultados obtenidos.
INTERPRETACION DEL RESULTADO

Negativo = ausencia de espermatozoos completos o sus cabezas
Positivo = presencia de espermatozoos completos y/o sus cabezas .
B) DETERMINACION DE FOSFATASA ACIDA

La muestra que se requiere en esta determinacin es el sobrenadante obtenido en la tcnica anterior.
Se realiza con las mismas tcnicas descritas para suero y/o sangre completa. El
mtodo
empleado
es
el
recomendado para la determinacin de fosfatasa acida en las pruebas qumicas de la espermatobioscopa

directa.
TCNICA
Menos de 5 U K/A/ml se reporte = NEGATIVO
Unidades K/A/ml = mUI/ml x 0.018
COMENTARIOS
1. No debe usarse preservativos ya que el polvo sobre el caucho es espermaticida
2. Debe descartarse el uso de envases trmicos para el traslado de la muestra, ya que esto contribuye a que
los espermatozoides consuman sustancias nutritivas. Las muestras seminales no deben ser obtenidas poco
despus de haber cesado padecimientos febriles.
3. Los extendidos para observaciones morfolgicas, deben ser delgados de manera que seque rpidamente,
si el frotis es grueso tarda ms en secar produciendo alteraciones morfolgicas de los espermatozoides,
que en ocasiones son difciles de evaluar. No debe emplearse calor para secar pues tambin altera
morfologa sobre todo las colas de los espermas (se enroscan)
4. La administracin de testosterona hace que aumente la actividad de FAL.
5. Los resultados de las pruebas de espermatobioscopa directa no deben evaluarse de forma aislada, sino
conjunta con todos los parmetros que se incluyen en el anlisis.
6. Deben ser evaluados 2 o 3 especimenes antes de establecer un diagnstico definitivo a partir de los
resultados obtenidos.
7. La visualizacin de la mancha amarillo verdosa caracterstica del lquido seminal, se observa mejor cuando
la luz ultravioleta no es perpendicular a la mancha.
93
ESPERMATOBIOSCOPA FUNCIONAL INDIRECTA

A)
PRUEBA DE SIMS HUHNER MODIFICADA POR RODRIGUEZ VILLA

Es una prueba espermtica post-coital. Para el mejor rendimiento clnico se tome en consideracin los
siguientes elementos; seleccin del da ptimo dentro del ciclo menstrual, para en l practicarla; fijacin de un
tiempo de reposo sexual previo a la prueba; descripcin de la tcnica para la recoleccin de la muestra seminal
y vaginal, y sistematizacin del horario para recoger esta muestra y la secrecin endocervical; y finalmente
enumeracin de los estudios microscpicos que se practican en estas muestras.
La prueba contempla la participacin activa del matrimonio que tiene problema de esterilidad, lo que la
ajusta al concepto doctrinario actual de que dicho problema de ninguna manera es individual, sino de pareja,
por lo que en su planteamiento y estudio debern tomarse e cuenta por igual al hombre y a la mujer que la
integran. De acuerdo con esto para que la espermatobioscopa funcional pueda realizarse debidamente es
necesario que tenga lugar una entrevista previa entre el matrimonio en estudio y el clnico que vaya a
practicarla ya que ser a travs de esta entrevista como se obtengan los elementos necesarios que intervienen
en la prueba para que en ella reciban los cnyuges las instrucciones para el debido desarrollo de la fase de la
prueba en que ellos van a intervenir.
La prueba debe ser practicada en poca ovulatoria ya que es en esta fase del ciclo menstrual cuando la
secrecin endocervical es ms receptiva a los espermatozoos, tanto en lo que se refiere a la penetracin, como
a la viabilidad intramoco cervical de los mismos. El punto de referencia es la fecha de ltima regla y en los ciclos
28 30 x 2 3 la prueba se har el catorceavo da con una variante de ms o menos dos das, salvo que la
paciente manifieste por temperatura basal o por citologa vaginal seriada, que su ovulacin tiene lugar otro da
como por ejemplo el dieciocho da del ciclo.
Por parte del varn la prueba deber ser precedida de un reposo sexual con objeto de garantizar una
mejor calidad de muestra, tanto a lo que se refiere la cantidad como la calidad maduracin de los
espermatozoos presentes en ella. El periodo de reposo sexual no debe ser igual para todos los varones sino
que debe ser fijado de acuerdo con la edad y frecuencia sexual del marido en estudio. El tiempo de reposo
sexual se fijar de acuerdo al a siguiente frmula:
FSP = FST + FSR
2
DONDE:
FSP = FRECUENCIA SEXUAL PRACTICADA, O SEA EL NMERO DE DAS QUE SE DARN DE
REPOSO PREVIO A LA PRUEBA.
FST = FRECUENCIA SEXUAL TERICA, O SEA EL NMERO MXIMO DE DAS QUE DEBEN
TRANSCURRIR ENTRE UNA RELACIN SEXUAL Y LA SIGUIENTE DE ACUERDO CON LA EDAD DEL
VARN. ESTE DATO SE OBTIENE UTILIZANDO LA SIGUIENTE CUADRO:
94
FRECUENCIA SEXUAL TERICA

EDAD DE HOMBRES
TIEMPO MXIMO ENTRE UNA
(AOS)
RELACIN SEXUAL Y LA SIGUIENTE

(FST) (DIAS)
20 30
30 40
40- 50
50 60
60 - 70
2A3
3A4
4A5
5A6
6A7
La relacin sexual base de la prueba la efectuar el matrimonio en estudio en su propio domicilio y no a

una hora fija, sino entre las siete y las diez de la maana, se instruir a los cnyuges, que se ajusten a las
condiciones de normalidad y naturalidad con as que habitualmente las realizan, procurando que el acto sexual
lo desencadenen por estimulacin sexual mutua, dando origen de este modo a la fase de excitacin femenina,
la mujer continuar 15 minutos en esta posicin a fin de favorecer durante este tiempo la permanencia del
semen dentro de la vagina, es una prueba in vivo de resistencia de los espermatozoides a los factores externos
(en este caso constituido por la secrecin vaginal cida). Se instruir al marido para que le pase a su mujer al
retirarse de ella dos almohadas una encima de otra para que las coloque debajo de la pelvis a fin de levantar un
poco la cadera en relacin al dorso..
Para la recoleccin de la muestra seminal- vaginal donde es la propia mujer la que se la recoge y no el
clnico. Al trmino de los 15 minutos de reposo postcoital la mujer se levantar, se pondr en posicin semi
sentada y separando los muslos se colocar directamente debajo dela vulva una caja Petr estril (suministrada
por el laboratorio) y se deja que escurra dentro de la caja, por gravedad el semen que retuvo en la vagina
durante un cuarto de hora. Una vez recogida la muestra seminal, se trasladar inmediatamente al laboratorio a
manera de llegar all entre una hora y hora y media despus de concluido el coito, sin haberse hecho ningn
aseo vulvar, incluyendo bao general, sin haber orinado o defecado despus del coito y sin aplicarse ninguna
toalla o proteccin sanitaria semejante, nicamente su ropa interior y la caja Petri que deber mantener en todo
momento en posicin horizontal a efecto d prevenir la salida del contenido.
La toma de la muestra endocervical se har en el laboratorio alrededor de dos horas despus de
efectuado el coito, para lo cual se coloca a la paciente en posicin ginecolgica habitual y se le inserta un
espejo bivalvo seco sin lubricante y una vez visualizado el orificio externo del cuello uterino se introduce en el
canal la extremidad de una cnula maleable ajustada en la otra extremidad a una jeringa, por medio del cual se
har la aspiracin de la secrecin endocervical postcoital.
Finalmente se toma una muestra del semen residual presente en el fondo del saco posterior de la vagina.
Para nominar las muestras seminales vaginales, endocervical y residual, se ha adoptado la siguiente
terminologa: a la primera el autor le ha llamado contenido vaginal postcoito, lo que significa que no se trata de
una muestra de semen puro, sino de una mezcla con exudado vaginal; a la segunda le denomin contenido
endocervical postcoito queriendo significar con ello que no siempre estar constituida por moco cervical puro de
la poca ovulatoria, sino que en mltiples ocasiones contiene sangre opus, a veces detectadas por el examen
95
microscpico. A la muestra residual semino vaginal le llamo contenido de fondo de saco posterior de la vagina
la que est constituida por semen mezclado con exudado vaginal.
Los estudios espermticos que se realizan en el contenido vaginal postcoital comprenden : determinacin
del nmero, morfologa, motilidad y vitalidad espermtica.
El nmero de zoospermos se determina en una muestra seminal vaginal diluida en 1:10, 1:20 1:100 en
solucin salina isotnica, mediante
una cmara cuenta clulas de Neubauer. El resultado se expresa en
nmero de espermatozoides por mililitro.

La morfologa espermtica comprende. 1) la determinacin del porcentaje de formas normales y
anormales, 2) la cuenta diferencia espermtica que abarca a su vez las formas ceflicas ovales y sus variantes,
redondas, piriformes y en flama de vela, en las que se conserva la relacin ncleo acrosmica y que por tanto
integran el grupo de zoospermos normales y por otra parte las formas anormales que presentan anormalidades
anatmicas a nivel de cualquiera de los segmentos del zoospermo: cabeza, cuello, pieza intermedia o cola,
detectadas en el examen en fresco, practicado con iluminacin estndar o microscopa de contraste de fases o
bien en preparaciones teidas por alguno de los mtodos que han sido descritos cuya suma va a constituir el
grupo de zoospermos anormales.
La motilidad espermtica comprende: 1) La determinacin en porciento de la formas mviles y de las
inmviles, 2) La tipificacin de la motilidad, que puede emplearse la siguiente clasificacin de los movimientos
espermticos:
MOVIMIENTOS DE TRASLACIN
Rpidos (4+)
Normoquinesia
Moderados (3+)
Lentos (2+)
Bradiquinesia
Movimientos In Situ:
Pendulares (ceflicos)
De reptacin
Disquinesia
Vibrtiles
Ausencia de movimientos
Aquinesia
La vitalidad espermtica comprende la medida del tiempo que duran con vida los espermatozoides, la
que se manifiesta por movimientos, a lo que se le denomina vitalidad cintica o bien en los casos de ausencia
de movimiento por la utilizacin de determinados colorantes que nicamente tien los espermatozoos muertos,
a esto se le denomina vitalidad esttica. Los resultados se expresan en porcentaje de formas vivas y se aprecia
a partir del momento en que se hace la primera observacin que es al recibo de la muestra del contenido
vaginal postcoito y despus a las 3, 6 12 y 24 hr hasta que pase toda clase de movimientos o hasta que todos
los espermatozoos estn teidos. A este estudio espermtico se aade el de determinacin de acidez inica
(pH).
96
Los estudios espermticos que se realizan en el contenido endocervical postcoito, comprenden al igual
que en la muestra semino-vaginal los 4 estudios que integran las Espermatobioscopa: numero, morfologa,
motilidad y vitalidad espermtica. La cuenta del nmero de espermatozoos no es absoluta, es decir, no se da en
cifras absolutas de elementos referida al volumen de la muestra, sino que es relativa con un aumento de 400
dimetros.
A nivel del contenido endocervical postcoito el estudio de la morfologa espermtica comprende
nicamente la determinacin del porcentaje de formas normales y anormales.
Al examen de la motilidad espermtica se incluyen los mismos que en contenido semino-vaginal. La
vitalidad e los espermas se hace el mismo estudio que se mencion antes en el contenido semino-vaginal. Pero
se le agrega las siguientes determinaciones: 1) Determinacin del pH, 2) Numero de leucocitos, piocitos y
eritrocitos por campo (40 x) y 3) Cristalizacin de la secrecin endocervical postcoital.
Los estudios espermticos que se realizan en el contenido del fondo de saco posterior de la vagina
fueron introducidos para examinar el semen residual vaginal y apreciar la presencia o ausencia de
espermatozoos.
A travs de la presencia de zoospermas podemos ver la accin tarda que sobre la motilidad espermtica
ha ejercido el medio cido vaginal. Como en el caso del contenido endocervical el nmero de espermatozoos
se da en cifras promedio por campo microscpico con un aumento de 400 dimetros.
El estudio de la motilidad espermtica comprende solo la determinacin del porcentaje de formas mviles
e inmviles. A este estudio se le ha aadido lo siguiente: 1) Determinacin del pH, 2) Investigacin de parsitos
tales como Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolitica, as como
esporas o micelios de hongos,
especialmente del gnero Cndida.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS.

1. Prueba Normal: a) La cantidad y la calidad biolgica de los espermatozoides presentes en el
contenido vaginal son normales. Esto indica que la eyaculacin seminal- vaginal es normal y por tanto el coito
fue efectivo. B) La cantidad y calidad biolgica de los espermatozoides presentes en el contenido endocervical
son normales esto indica que la migracin espermtica-vaginal-cervical es activa y por tanto normal.
2. Prueba subnormal de origen femenino. A) La cantidad y calidad biolgica de espermatozoides
presentes en el contenido vaginal son normales. Esto seala que la eyaculacin seminal-intravaginal es normal
y por tanto el coito fue efectivo. B) La cantidad de los espermatozoides presentes en el contenido endocervical
es excesivamente baja y en ocasiones definitivamente nula o bien la calidad espermtica muestra acentuada
deficiencia: encontrndose inmovilizacin total de los espermatozoides o bien necrozoospermia, en ocasiones
aglutinacin de los zoospermos. Esto indica que la migracin espermtica es cuantitativa y cualitativamente
anormal. Baja calidad biolgica del moco cervical, moco cervical hostil y/o anticuerpos anti espermtica.
3. Prueba subnormal de origen masculino. A) La cantidad de los espermatozoides presentes enel
contenido vaginal es marcadamente baja (oligospermia). La calidad anatmica es deficiente (diszoospermia,
que es aumento considerable delas formas anormales) encontrndose anisozoospermia que es la presencia de
espermatozoides
de
distintos
tamaos;
poiquilozoospermia
97
(diferentes
formas
de
espermatozoide);
teratozoospermia (presencia de espermatozoos altamente deformes). La calidad funcional es deficiente

(bradiquinesia, astenozoospermia), disquinesia (espermas con movimientos in situ cuando se encuentran
espermas inmviles; necrozoospermia. Esto indica que aunque el coito fue efectivo, la eyaculacin seminal
intravaginal es cuantitativa y cualitativamente anormal, b) Se detecta en algunos casos la presencia de escasos
espermatozoides mviles en el contenido endocervical, aprecindose en menor numero de formas anormales a
este nivel en comparacin con el encontrado en el contenido vaginal. Existe por tanto, una buena receptividad y
la selectividad espermtica es normal a nivel del contenido endocervical. Esto indica que la migracin
espermtica muy baja existe y que su deficiencia no es imputable a causas femeninas.
4. Prueba anormal: a) Aspectos masculinos. La cantidad de los espermatozoides presentes es
relativamente baja en
el contenido
vaginal.
La calidad morfolgica
y funcional son deficientes
(oligoastenozoospermia). Esto indica que la eyaculacin seminal intravaginal es cuantitativa y cualitativamente

anormal, y en casos en que no se detecte semen en el contenido de fondo de saco posterior de la vagina es
que el coito no fue efectivo. B) Aspectos femeninos. El coito no se realiza por ser imposible la penetracin
peneana, debido a deformaciones vulbares o vaginismo invencible. El coito se realiza pero el semen sale
inmediatamente de la vagina pro excesiva amplitud de la misma. En cualquiera de los dos casos no se detecta
semen en la vagina. El coito se realiza y se detecta semen en el contenido vaginal pero aparte de la mala
cantidad y la calidad espermtica no hay posibilidad de que la migracin espermtica vagino - cervical se
efecte, por causa de la mala calidad biolgica del moco cervical o moco cervical hostil debido a la presencia en
el canal cervical de sangre o de pus causado por procesos inflamatorios o infecciosos severos lo que se traduce
por ausencia de espermatozoides en el contenido endocervical.
5. Azoospermia. Hay contenido vagina postcoito en ocasiones cuantitativamente abundante, pero en el
canal vaginal despus de un estudio minucioso no se detectan zoospermas, tampoco en contenido
endocervical, ni en el contenido de fondo de saco posterior de la vagina.
98

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Q.C. CLAUDIA ARRONTE

MICROSCPICAS DE LQUIDOS EXTRACELULARES. ..................................................... 44

PRCTICA NO. 10 ANLISIS DE LQUIDO CEFALORRAQUIDEO .................................. 51

PRESENTACIN DEL CURSO

Anatoma y fisiologa normal del sistema tisular

II. Mecanismos fisiopatolgicos para comprender e interpretar los datos de

Anlisis de agua y electrolitos

II. Pruebas de Equilibrio cido base

Anlisis de lquidos biolgicos (Exudados y Trasudados)

IV. Anlisis de Lquido Cerebroespinal

Anlisis de Clculos Urinarios y Biliares

VI. Perfil de Fertilidad

tcnicas, el material, los reactivos y el equipo e instrumentacin empleados en el curso de Bioqumica

FUNDAMENTACIN DE LA EXPERIENCIA EDUCATIVA

realizando exmenes de laboratorio de forma regular lo que permitir detectar

RELACION DE LA EXPERIENCIA EDUCATIVA CON OTRAS DEL

OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA

2. Aplicar de manera eficiente el total de pruebas fsicas, qumicas, citolgicas y bacteriolgicas,

UNIDAD NO. 1 ELECTROLITOS SRICOS

Interferencias biolgicas: Trauma reciente, ciruga o shock, consumo de grandes o pequeas

ACETATO DE URANILO Y ZINC

MATERIAL, EQUIPO E INSTRUMENTACIN

MATERIAL PARA TOMA DE MUESTRA

tubos de ensaye de 13 x100 mm

pipeta Pasteur con bulbo

MATERIAL PARA LA PRUEBA:

tubos de ensaye de 13x 100 mm

Solucin patrn (ml)

Acetato de uranilo y Zinc (ml)

n por espacio de 01 hora

0.32 = REPRESENTA LA CONCENTRACION EN mg% de Na DE 0.5 ml DEL ESTANDAR

Figura no. 1. Principio de Medicin de Fotmetro de Flama.

Para minimizar el problema de las

interferencias, se recomiendan las siguientes acciones:

135 a 145 mmol / l o meq / l

MATERIAL, EQUIPO E INSTRUMENTACIN

MATERIAL PARA TOMA DE MUESTRA

tubos de ensaye de 13 x100 mm

pipeta Pasteur con bulbo

MATERIAL PARA LA PRUEBA

tubos de ensaye de 13 x100 mm

pipeta Pasteur con bulbo

MATERIAL PARA LA CURVA DE CALIBRACIN

tubos de ensaye de 13 x100 mm

exceso de cido cloranlico del

inadecuado con isoproplico). Deje reaccionar por 10 minutos a TA.

4.2 a 5.2 meq/l

B) CONTINE CON EL PROCEDIMIENTO A PARTIR DEL PASO NO.1 MANEJE LAS

SOLUCION PATRN DE CALCIO (10 mg%)

MATERIAL, EQUIPO E INSTRUMENTACIN

MATERIAL PARA TOMA DE MUESTRA

tubos de ensaye de 13 x100 mm

pipeta Pasteur con bulbo

MATERIAL PARA LA PRUEBA

matraces Erlen Meyer de 25 ml

pipetas lineales de 0.2 ml (1/10)

pipetas lineales de 0.2 ml (1/100)

pipetas de 2.0 ml (1/100) microbureta

pipeta Pasteur con bulbo

Patrn de calcio (ml)

Suero libre de clulas (ml)

Solucin de KOH 1.25N (ml)

3. Se valoran B, P y D con EDTA. La desaparicin de la fluorescencia verde amarillenta y la aparicin de color