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III) MICROBIOLOGIA ESPECIAL - BACTERIOLOGIA

Prtica 12 - Colorao de Gram.


Observaes das principais formas e estruturas bacterianas.
I) Introduo
A morfologia individual e as reaes tintoriais constituem, em geral, os critrios preliminares
para identificao das bactrias e sua posterior classificao. O exame microscpico direto de
um microrganismo comumente suplementado com exame microscpico aps colorao que,
alm de facilitar sua observao, permite a visualizao de determinadas estruturas.
A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holands Hans Christian
Gram. Esta colorao uma das mais importantes e rotineiramente utilizada no laboratrio de
Microbiologia.
O mtodo de colorao de Gram permite colocar as bactrias em dois grandes grupos: as que
retm o corante Violeta de Genciana e que so denominadas Gram-positivas e as que no retm
este corante e se denominam Gram-negativas. Esta caracterstica um dos pontos de partida
para a classificao das bactrias.
O mecanismo da colorao de Gram tem sido explicado por vrias teorias. Sabe-se hoje que
ele est ligado permeabilidade da parede celular bacteriana, que retm o complexo
iodopararrosanilina (composto da Violeta de Genciana + Lugol) permitindo ou no a
descolorao pelo lcool.

II) Objetivo: Demonstrar a importncia desta colorao e estabelecer a distino entre:


- Bactrias Gram-positivas e Gram-negativas;
- As morfologias cocos ou bacilos;
- Arranjos bacterianos (estafilococos, estreptococos, estreptobacilos, etc) .
III) Tcnica de preparo do esfregao
Procedimento
A - PREPARO DO ESFREGAO:
A1- Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio Lquido:
1) Flambar a ala corretamente;
2) Esfri-la nas paredes do tubo;
3) Introduzir a ala no meio lquido de maneira que este forme um filme sobre a ala;
4) Colocar o material coletado sobre uma lmina limpa e seca;
5) Espalhar o material sobre a lmina, procurando obter um esfregao fino;
6) Secar a temperatura ambiente;
7) Aps o esfregao ficar completamente seco, com auxilio da pina de madeira, fix-lo
na chama do bico de Bunsen, passando a lmina 2 a 3 vezes pela chama; aguardar at o
resfriamento da lmina.
8) Realizar a colorao.
A2- Preparao do esfregao para colorao de cultivos em meio Slido
1. Com a ala de platina transferir uma pequena gota de gua para a lamina;
2. Flambar a ala corretamente;
3. Esfri-la no meio slido (regio sem colnias);

4. Coletar 1 colnia e transferir para a pequena gota de gua na lmina. Espalhar bem
com movimentos suaves evitando a quebra dos agrupamentos bacterianos;
5) Secar a temperatura ambiente;
6) Aps o esfregao ficar completamente seco, com auxilio da pina de madeira, fix-lo
na chama do bico de Bunsen, passando a lmina 2 a 3 vezes pela chama; aguardar at o
resfriamento da lmina
7) Realizar a colorao.

B - TCNICA DE COLORAO:
1. Cobrir o esfregao com soluo Violeta de Genciana por 1 minuto.
OBS.:ATENO PARA NO COLOCAR A LMINA INVERTIDA!!!!!!!!

2. Cobrir todo o esfregao com Lugol por 1 minuto;


3. Lavar rapidamente em gua corrente;
4. Gotejar, rapidamente, com lcool;
5. Lavar rapidamente em gua corrente;
6. Caso ainda esteja com muito corante, repetir 4 e 5;
7. Cobrir todo o esfregao com Fucsina por 30 segundos;
8. Lavar novamente em gua corrente;
9. Secar a lmina com papel de filtro, retirando apenas o excesso de gua;
10. Observar ao microscpio com objetiva de imerso.
IV) Interpretao
1. Bactrias Gram-positivas: coradas em roxo.
2. Bactrias Gram-negativas: coradas em vermelho.
QUESTES PARA RELATRIO
1. Descreva como so e do que se compem as paredes das bactrias Gram-positivas e
Gram-negativas.
2. Faa um desenho esquemtico de cada uma das bactrias que foram observadas em
aula:

E. coli

Bacillus sp

Staphylococcus sp

Streptococcus sp

3. Comente cada uma das etapas da colorao de Gram.

Prtica 13 - Fisiologia bacteriana.


Nutrio bacteriana.
I) Introduo
Bactrias so capazes de crescer em diferentes ambientes e utilizar diversas fontes de
nutrientes. Em condies de laboratrio, o cultivo de bactrias pode ser feito em meios ricos ou
complexos que possuem uma grande diversidade de nutrientes, em geral de composio
especfica desconhecida em funo da adio de materiais como extrato de carne, leveduras ou
sangue. Bactrias cultivveis apenas nestes meios so exigentes nutricionalmente e incapazes de
sintetizar alguns componentes obtidos diretamente do meio de cultura. Por outro lado, existem
bactrias capazes de crescer em meios muito simples constitudos por uma nica fonte de
carbono (em geral, um acar) e sais minerais. Estes meios denominados meios mnimos ou
sintticos permitem o crescimento apenas de bactrias capazes de sintetizar todos os seus
precursores metablicos e obter energia a partir de carboidratos. Bactrias cultivveis em meio
mnimo so denominadas protrficas enquanto que as auxotrficas dependem da adio de
componentes adicionais ao meio de cultura, como aminocidos e vitaminas. Um outro mtodo de
avaliar a capacidade de uma bactria utilizar um determinado substrato como fonte de carbono e
energia emprega meios de cultura especiais denominados meios indicadores. Estes meios
possuem na sua composio, um revelador cromognico especfico que muda de cor quando a
bactria semeada capaz de utilizar um substrato especfico.
.
II) Objetivo
Avaliar o crescimento de algumas bactrias em diferentes meios de cultura para analisar as
exigncias nutricionais das bactrias e empregar um meio indicador para determinar a
capacidade de fermentao da lactose.
III) Material
1.

3 tubos de ensaio contendo culturas bacterianas de : Escherichia coli K12 (linhagem J53 e
linhagem BB) e Salmonella dublin.
2. Trs tubos de ensaio com meios de cultura: (a) meio mnimo sem adio de leucina; (b) meio
mnimo com adio de leucina; (c) meio rico feito com extrato de levedura.
3. Placa com gar MacConkey acrescida de lactose.
4. Alas para inoculao.

IV) Procedimento
1.Flambar a ala de platina e efetuar a coleta de uma amostra ( uma alada) para cada um dos
tubos com meios diferenciais. Repetir o procedimento com as outras 2 bactrias.
2.Dividir a placa com Meio McConkey em 3 e semear por esgotamento , uma bactria em cada
um das 3 reas marcadas da placa.
3.Incubar os tubos e as placas em estufa bacteriolgica a 37C por 24 horas.
4.Avaliar o crescimento das bactrias.

V) Resultados
1. Anotar o crescimento de cada uma das bactria fornecidas nos trs meios de cultura lquidos.
2. Verificar a colorao das colnias cultivadas nas placas de gar MacConkey.

QUESTES PARA RELATRIO


1.Baseado nos resultados de crescimento das bactrias nos diferentes meios lquidos, como
voc classificaria cada amostra em funo de suas caractersticas nutricionais.
2.Que bactria foi capaz de utilizar lactose como nutriente? Por qu?
3.Como as diferentes exigncias nutricionais podem afetar a distribuio e ocorrncia das
bactrias?
4.Algumas bactrias no so cultivveis em meios de cultura. Por qu?
5.Idealize um experimento voltado para a determinao dos requerimentos nutricionais de
uma bactria sendo que ela capaz de crescer em meio rico, mas incapaz de crescer em
meio mnimo.

Prtica 14- Conjugao bacteriana.


I) Introduo
A conjugao bacteriana processo sexual" de transferncia de genes de uma bactria
doadora para outra receptora. Este processo foi descoberto por Lederberg e Tatum em 1946. Para
que uma linhagem bacteriana seja doadora ela deve conter um plasmdio conjugativo (elemento
extracromossmico).
O processo de conjugao foi descoberto em E. coli
K12, e o elemento
extracromossmico responsvel foi chamado de fator F (de fertilidade) ou plasmdio F. H
dois tipos de plasmdios conjugativos: os plasmdios auto-transmissveis e os mobilizveis. Esse
plasmdio pode estar ou no integrado ao cromossomo bacteriano. No primeiro caso, a linhagem
bacteriana chamada de Hfr (grande freqncia de recombinao) e, no segundo caso, de F+.
A clula F+, aps contato com clulas F-, transfere para esta ltima, em alta freqncia, uma
rplica do plasmdio F, tornando-a F+. Por outro lado, a linhagem Hfr (alta freqncia de
transferncia), cujo fator F est integrado, transfere seqencialmente marcadores localizados no
cromossomo, sendo o F raramente transferido.
Aps a descoberta do fator F, outros plasmdios conjugativos foram descobertos, como o
caso dos fatores ou plasmdios R. Esses plasmdios contm marcadores para resistncia
drogas antibacterianas e no reintegram normalmente no cromossomo bacteriano. Alguns
plasmdios no promovem conjugao, mas podem ser mobilizados por outros conjugativos.
Neste experimento ser utilizada como doadora uma linhagem portadora de plasmdio R.
II) Objetivo
Demonstrar a transferncia gentica da resistncia bacteriana tetraciclina atravs da
conjugao entre uma bactria doadora (linhagem de Salmonella typhimurium MG031 lac- tetr) e
uma bactria receptora (linhagem de Escherichia coli K12 lac+ nalr). O aluno ter a
oportunidade de conferir a importncia da resistncia aos antibiticos e sua disseminao entre
bactrias de relevncia clnica.
III) Material
1. Linhagens:
1.1 Doadora: Linhagem de Salmonella typhimurium MG031 ( lac- , Tetr ). Hospeda um
plasmdio que carrega o marcador que confere resistncia a Tetraciclina (Tcr ).
1.2 Receptora: Linhagem de Escherichia coli K12 (lac+ , nalr). O fentipo de resistncia ao
cido Nalidxico deve-se a uma mutao cromossomal.
2. Antibiticos
2.1 cido Nalidxico (Nal) usar a concentrao de 50g/ml
2.2 Tetraciclina (Tet) usar a concentrao de 25 g/ml
III) Procedimento
Dia anterior:
1. Fazer os pr-inculos das linhagens doadoras e receptoras em 4,0ml de meio TSB mais
antibiticos. Incubar temperatura de 37C por uma noite.
Dia 1:
1. Lavar as culturas com salina para remover os antibiticos. Ressuspender as clulas em
TSB;
5

2. Semear as culturas de K12 e MG031 nos espaos destinados em meio slido Mac
Conkey contendo os diversos antibiticos (conforme indicado abaixo);
K12

MG

K12

Mist. Conj.

Meios: MC

MG

K12

MG

Mist. Conj.

Mist. Conj.

MC+Tc

MC+Nal

K12

MG

Mist. Conj .

MC+Tc+Nal

3. Adicionar em um tubo de ensaio contendo 1,0ml de TSB as seguintes culturas:


-1,0 ml da linhagem S. typhimurium MG031 (doadora) e
-1,0 ml da linhagem E. coli K12 (receptora)
4. Agitar bem e incubar por 1 hora sem agitao temperatura de 37C;
5. Semear a mistura de conjugao em meio slido Mac Conkey contendo os diversos
antibiticos (conforme a figura acima);
6. Incubar em estufa temperatura de 37C por 16-24 horas (durante uma noite).
IV) Anlise dos resultados
1.
Verificar o crescimento de colnias, vermelhas ou brancas, nas placas de
gar MacConkey sem antibitico, com tetraciclina, com cido nalidxico ou com ambos os
antibiticos.
2. Registrar os resultados observados na tabela como indicado:

Meio seletivo

Propriedades de crescimento (R/S e Lac+/ Lac-)


Cultura A
Cultura B
Cultura C
( MG031)

( K12)

( mist.conj.)

MacConkey sem antibitico


MacConkey com tetraciclina
MacConkey com c. Nalidxico
MacConkey com tetraciclina e
cido nalidxico
- crescimento: R - presena de colnias / S - ausncia de colnias.
** - fermentao da lactose: Lac+ - colnia vermelha / Lac- - colnia branca.
QUESTES PARA RELATRIO
1. Por que as duas bactrias utilizadas precisam expressar algum tipo de resistncia para que o
experimento possa ser feito?
2. Qual a bactria doadora neste experimento? Por qu?
3. Voc descartaria a possibilidade de que uma das linhagens tenha sofrido uma mutao
espontnea que a tornasse resistente ao segundo antibitico? Por qu?
4.Quais as possveis repercusses deste fenmeno observado em laboratrio para o problema da
resistncia bacteriana em hospitais e no ambiente?

Prtica 15 - Antibiograma.
I) Introduo / Objetivo
O antibiograma um teste que permite a verificao in vitro da sensibilidade de uma bactria
aos antibiticos. Esta sensibilidade demonstrada pela zona ou halo de inibio de crescimento
que se forma em volta do disco de antibitico. De acordo com o tamanho do halo de inibio dizse que a bactria sensvel, pouco sensvel ou resistente (quando no h formao do halo).
II) Procedimento
1. Depositar 0,1 ml da cultura no centro da placa de Petri (E. coli ou S. aureus)
2. Espalhar uniformemente com ala de Drigalski ou zaragatoa.
3. Deixar secar a superfcie.
4. Colocar os discos de antibiticos usando a pina.
5. Incubar a 37oC durante 24 horas.
6. Ler e registrar os resultados (verificar se h ou no halo de inibio de crescimento em torno
de cada disco).

Tabela de sensibilidade dos discos de antibiticos ( em mm)


Antibitico
Ampicilina(Staphylococcus)
Ampicilina ( BGN)
Cefalotina
Cefoxitina
Cefotaxima
Eritromicina
Gentamicina
Sulfazotrim
Tobramicina
Vancomicina

Sigla
AMP
AMP
CFL
CFO
CTX
ERI
GEN
SUT
TOB
VAN

resistente
28 ou 13 ou 14 ou 14 ou 14 ou 13 ou 12 ou 10 ou 12 ou 9 ou -

Intermedirio
14 a 16
15 a 17
15 a 17
15 a 22
14 a 22
13 a 14
11 a 15
13 a 14
10 a 11

Sensvel
29 ou +
17 ou +
18 ou +
18 ou +
23 ou +
23 ou +
15 ou +
16 ou+
15 ou +
12 ou +

E.coli

S.aureus

QUESTES PARA RELATRIO


1. Quais foram os resultados experimentais obtidos pelo seu grupo?
2. O que e para que serve o antibiograma?
3. Por que devem ser utilizados disquinhos de antibiticos diferentes para pesquisa de
sensibilidade de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas?
4. Qual a diferena de um antibitico bacteriosttico e um bactericida?
5. O que MIC?

Prtica 15 b - Pesquisa de Produtos Naturais antibacterianos.


I) Introduo
Muitos vegetais contm compostos que so inibidores de crescimento de microrganismos e
exercem papel importante na resistncia destes vegetais a patgenos. Um importante exemplo
deste processo o alho.
A presena de substncias antimicrobianas pode ser verificada atravs de extratos ou partes
homogeneizadas de vegetais colocados frente a culturas de microrganismos.
II) Objetivo
Estudar a presena de compostos antimicrobianos em vegetais.
III) Material
1. Placas de TSA.
2. Alho e cebola.
3. Cotonetes.
4. Graal e pistilo.
5. Discos de papel de filtro.
6. Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.
IV) Procedimento
1. Mergulhar o cotonete na suspenso do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfcie do meio com o prprio cotonete embebido na cultura;
3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em graal,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e coloc-los sobre a superfcie do meio
semeado;
5. Incubar a 25C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibio.

V) Resultados
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Prtica 16 - Identificao de cocos Gram-positivos.


I) Introduo /Objetivo
Este grupo de bactrias formado, entre outras, por estafilococos e estreptococos, bactrias
patognicas para o homem. Os estafilococos so pequenos (0,8-l,0m de dimetro), Grampositivos e se apresentam reunidos em agrupamentos com forma de cachos de uva. Dentre as
espcies potencialmente patognicas para o homem temos: Staphylococcus aureus,
Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus epidermidis. O estafilococo um germe
piognico por excelncia, podendo ser agente em certos processos supurativos como, por
exemplo, a osteomielite, a furunculose, o terol, o impetigo , infeces urinrias, alm de causar
toxiinfeces alimentares.
Os estreptococos so cocos pequenos (0,8 m dimetro), Gram-positivos que, no pus ou nas
culturas em caldo, se apresentam em forma de cadeias. Podem ser os agentes primrios de
doenas supurativas como erisipella, faringite, otite mdia, pneumonia, meningite, septicemia
puerperal, endocardite ou doenas no supurativas como glomerulonefrite e febre reumtica.
A catalase uma enzima produzida por certas bactrias e que desdobra o perxido de
hidrognio em gua e oxignio livre (2 H 2O2 2 H2O + O2) e que se traduz pela formao de
bolhas quando se adiciona gua oxigenada cultura. A prova da catalase utilizada para
diferenciar estafilococos de estreptococos.
A prova da coagulase serve para se observar a capacidade que determinados
microrganismos possuem de coagular o plasma pela ao da enzima coagulase. Esta prova
utilizada especificamente para diferenciar espcies dentro do gnero Staphylococcus.
As hemolisinas so enzimas ou toxinas que destroem os glbulos vermelhos. Existem muitas
hemolisinas, com diferentes propriedades, que so produzidas no somente pelas bactrias
patognicas como tambm pelas no patognicas. Dentre as bactrias que comumente produzem
hemolisinas esto os Streptococcus. Quando semeadas em gar sangue, estas bactrias produzem
halos claros em torno da colnia (halo de hemlise). No que diz respeito aos estreptococos,
quando o halo totalmente claro, transparente, diz-se que a hemlise beta (destruio total das
hemcias); quando parcialmente claro ou esverdeado, diz-se hemlise alfa (destruio parcial das
hemcias) e, quando no h hemlise, esta chamada do tipo gama. Esta prova denominada
prova da hemolisina.
Na provas da optoquina (cloreto de etil-hidrocupreina), discos de papel de filtro embebidos
com reativo, so colocados na superfcie de placas de gar sangue semeado com o estreptococo
alfa-hemoltico. Se o germe em estudo for pneumococo, uma zona de inibio de crescimento de
15 a 30 mm ir se formar.
A prova da bacitracina serve para diferenciar os estreptococos beta-hemolticos do grupo A
dos demais grupos. Um disco contendo 0,05 unidades de bacitracina depositado na superfcie
de placas de gar sangue semeado com a bactria em estudo. Os estreptococos beta-hemolticos
do grupo A apresentam zona de inibio de 12 a 17 mm enquanto que os outros grupos de
estreptococos geralmente no so inibidos.
III) Material
8 lminas;
1.
H2O2
2.
1 placa de gar DNase; 2 placas de gar sangue;
3.
Pina, ala de platina,
4.
Culturas: S. aureus, S. saprophyticus; S. pyogenes, S. peneumoniae, S. faecalis
5.

IV) Esquema empregado para a identificao:


Cocos Gram-Positivos
catalase

--------------------------

--------------------------------

coagulase/DNase

hemlise

S. faecalis

novobiocina
--------------

bacitracinaS

S. pyogenes

S
S. epidermidis

optoquinaS
S. pneumoniae

R
S. saprophyticus

II) Procedimento
1. Realizar a colorao de Gram das culturas;
2. Realizar a prova da catalase em lminas de todas as culturas;
3.

Staphylococcus: - Realizar a prova da DNAse em placa contendo meio slido gar-DNA;


- Observar a sensibilidade novobiocina

4.

Streptococcus: - Observar os halos de hemlise das culturas;


- Observar a sensibilidade s drogas bacitracina e optoquina.

5.

Completar os quadros de diagnstico acima.

QUESTES PARA RELATRIO


1.Quais so as principais espcies de Staphylococcus causadoras de doena no homem?
Como so identificados no laboratrio? Quais so as principais caractersticas
patognicas? Quais so as principais doenas que causam no homem?
2.Os estafilococos produzem uma variedade de doenas, incluindo a sndrome da pele
escaldada estafiloccica, a sndrome do choque txico, intoxicao alimentar, intoxicaes
cutneas e endocardite. De que maneira os sintomas clnicos destas doenas diferem?
Quais destas doenas so intoxicaes?
3.Comente sobre duas principais espcies de Streptococcus causadoras de doena no
homem? Como so identificados no laboratrio? Quais so as principais caractersticas
patognicas, e as doenas que causam no homem.
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Prtica 17 - Bacilos Gram-positivos:


Clostridium, Corynebacterium e Bacillus.
I)
II)
Introduo
No gnero Clostridium, representado por bactrias Gram-positivas, anaerbias estritas,
esporuladas, encontramos pelo menos 4 espcies de importncia mdica: Cl. tetani, Cl. botulinum,
Cl. perfringens e Cl. difficile. Todas elas fazem parte da microbiota normal das fezes, sendo
encontradas no meio ambiente contaminado por estas (solo, vegetais, gua) na sua forma
esporulada, podendo, em condies especiais, produzir doenas bastante graves no homem e nos
animais.
O Cl. tetani responsvel pelo desenvolvimento do ttano que, nos indivduos susceptveis,
(no vacinados), vtimas de contuses traumticas que favoream um ambiente de anaerobiose, se
caracteriza por contraes espstica da musculatura, ocasionada por uma toxina denominada
tetanoespasmina. Esta toxina inibe a liberao da glicina que responsvel pela inibio da
neurotransmisso, fazendo com que exista uma constante ao da acetilcolina, causando uma
contrao espstica dos msculos extensores e flexores simultaneamente.
A espcie Cl. botulinum compreendida por vrios subtipos, sendo que, somente os dos
grupos A, B, E e F ocorrem no homem. As vias de transmisso destas bactrias so alimentos
enlatados, embutidos, ou conservas caseiras feitas, mormente com carne e vegetais. Os esporos do
Cl. botulinum so bastante resistentes fervura e, quando tais alimentos so preparados e
estocados, os mesmos germinam e produzem uma toxina que tem ao inibidora da liberao de
acetilcolina, que a mediadora da contrao muscular, causando uma paralisia flcida. Em ambos
os casos, a morte se d por paralisia respiratria.
O Cl. perfringes tem vrios tipos, sendo os dos tipos A e C, os patognicos para o homem.
Esto envolvidos em casos de gangrena gasosa no homem, sempre como conseqncia de
ferimentos profundos, que comprometam a circulao local, contribuindo para uma anoxia
tecidual que favorece a germinao dos esporos. A bactria produzir vrias toxinas, entre elas, a
toxina , que uma lecitinase. Em mulheres que provocam o aborto em condies precrias de
higiene, pode ocorrer o chamado aborto sptico, que se trata de uma mionecrose do tero, sempre
rpida e fatal. Os tipos A e C produzem uma enterotoxina responsvel por intoxicaes
alimentares.
O Cl. difficile ocorre somente em casos de indivduos submetidos a uma antibioticoterapia
intensa e demorada, em especial quando se usa a clindamicina, embora possa ocorrer com
qualquer antibitico de largo espectro. Todos os clostrdios so Gram-positivos, porm as
clulas bacterianas so Gram-negativas na fase de esporulao.
Dentre as Corinebactrias que merecem destaque, encontramos o C. diphterae, causador do
chamado crupe, ou difteria. Esta enfermidade se deve produo por amostras da bactria
que esto lisogenizadas por um fago (), sendo este o responsvel pela produo da toxina
diftrica que inativa o fator de elongamento EF2. As Corinebactrias se caracterizam por serem
bactrias Gram-positivas, com grnulos de metafosfato em seu interior, denominados de
granulaes metacromticas. Estas granulaes so visveis por coloraes especiais, ou at
mesmo com azul de metileno, e se coram em vermelho, da o nome derivado de metacromasia. A
bactria no invasora, e a leso que caracterizada por uma pseudomembrana fica, geralmente,
restrita ao trato areo superior, a partir de onde a toxina invade a corrente circulatria causando
leses graves em vrios rgos, em especial corao (miocardite), rins e nervos (neurite).

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No gnero Bacillus, encontramos vrias bactrias que tm como habitat o solo, o ar e a gua.
Entre os patognicos para os animais e para o homem se destaca o B. anthracis causador no gado
do carbnculo hemtico e, no homem do antrax, ou anthrax (antraz no a denominao
correta). A importncia deste agente aumentou consideravelmente nos dias atuais, devido s
ameaas do bioterrorismo. Outra bactria do gnero que pode causar intoxicaes alimentares no
homem o B. cereus. A maioria dos bacilos cresce rapidamente em meios simples formando
colnias grandes em meio slido. Geralmente, quando se observam as bactrias coradas pelo
mtodo de Gram, possvel visualizar-se estruturas intracelulares arredondadas que no se coram
correspondentes aos esporos.
II) Material
Em cada laboratrio sero colocados dois grupos de materiais constitudos por:
1. Uma jarra do tipo Gaspak para demonstrao de como se proceder para cultivos de bactrias
anaerbias. Acompanham dois envelopes de ANAEROGEN.
2. Placas de TSA (Tryptic Soy Agar) semeadas com Bacillus subtilis.
3. Dois grupos de 3 tubos contendo meio de tioglicolato.
4. Culturas de Escherichia coli (anaerbio facultativo), Pseudomonas aeruginosa (aerbio
estrito) e Clostridium perfringens.

III) Procedimento
1. Demonstrao de como se incuba para anerobiose com jarra Gaspak;
2. Fazer esfregaos das culturas de B. subtilis semeada no meio TSA e realizar a colorao de
Gram, procurando verificar se existem esporos (zonas no coradas dentro do corpo bacteriano);
3. Semear como indicado pelo professor os meios de tioglicolato, com cada uma das 3 bactrias
(Cl. perfringens, P. aeruginosa e E. coli).

QUESTES PARA RELATRIO


1. Qual a finalidade de se ter semeado as 3 bactrias em meio de tioglicolato e por que o Cl.
perfringens foi capaz de crescer neste meio, j que um anaerbio estrito. A Pseudomonas
aeruginosa cresceu s na superfcie do meio? Por qu?
2. Supondo-se que o B. subtilis fosse o B. anthracis. Que risco voc antecipa, se que existe
algum, em se lidar com uma cultura deste tipo sem utilizar proteo e demais cuidado
laboratorial?
3. Um tcnico de laboratrio acidentalmente se inoculou com uma cultura de C. diphterae.
O que voc acha que pode acontecer, supondo que ele tenha se submetido vacinao
com DTP, conforme recomendado pelas autoridades sanitrias?

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Prtica 18 - Identificao de Enterobactrias.


I) Introduo
Sabemos que vrios agentes so capazes de causar doenas no aparelho digestivo, normalmente
atravs de infeces exgenas. Dentre estes agentes, com exceo das espcies Campylobacter
jejuni, Aeromonas hydrophila, Vibrio cholerae, vbrios no-colricos Pseudomonas aeruginosa
entre os Gram-negativos e Clostridium perfringens, Clostridium difficile entre os Gram-positivos,
os mais freqentes enteropatgenos encontrados no Brasil, pertencem famlia Enterobacteriaceae,
que se caracterizam por serem bastonetes Gram-negativos, anaerbios facultativos, mveis ou
imveis, sendo, quando mveis, portadores de flagelos peritrquios, oxidase positivos,
fermentativos (Prova de OF), e reduzem nitratos a nitritos. O objetivo desta aula a
identificao de um destes agentes conhecidos (Shigella, Salmonella, Yersinia e Escherichia coli,
alm de outras enterobactrias), atravs de provas bioqumicas, que devero ser classificadas
utilizando tabelas de identificao.
Outras provas complementares (sorolgicas, testes biolgicos) so utilizadas na prtica, para
complementao destas provas, principalmente no que diz respeito identificao de uma das cinco
categorias de E. coli enteropatognicas para o homem: EPEC, EIEC, ETEC, EHEC e EAEC.
II) Material
Para cada grupo:
1. Uma cultura pura para (Culturas 1, 2, 3 ou 4) em placa contendo meio slido MacConkey
(haver: E. coli, Salmonella sp, Shigella sp e Proteus sp);
2. Srie Bioqumica (EPM, MILi, CITRATO );
3. Alas e agulhas.
III) Procedimento
1. Leitura da placa de MacConkey. Anotar morfologia e fermentao da lactose (+ ou -);.
2. Com a agulha, tocar a colnia bacteriana isolada e inocular na srie bioqumica: meios
EPM, MILi e citrato. Incubar a 37oC por 24 horas;
3. Leitura das sries Bioqumicas e identificao dos microrganismos, conforme TABELA abaixo.
IV) Leitura das Provas
1. gar MacConkey: colnias Lactose positiva: colorao vermelha.
colnias Lactose negativa: colorao transparente.
2. Meio EPM (Escola Paulista de Medicina): os testes de produo de gs, na fermentao da
glicose, H2S e produo da enzima urease, so verificados na base. O teste da enzima
L-triptofano desaminase, na superfcie do meio.
Obs: Todas as enterobactrias fermentam a glicose.

a) GLICOSE - Fermentao desse acar, com produo de gs.


Prova positiva: base amarela, com presena de bolhas de ar.
Prova negativa: base amarelada, sem bolhas de ar.
b) H2S
Prova positiva: base preta.
Prova negativa: base amarela, azul ou inalterada.

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c) UREASE
Prova positiva: base azul.
Prova negativa: base amarela ou inalterada.
d) TRIPTOFANO DESAMINASE
Prova positiva: superfcie verde escuro.
Prova negativa: superfcie azulada, amarela ou inalterada.
3. Meio de MILi (Motilidade, Indol e Lisina-descarboxilase): os testes de Motilidade e LLisina descarboxilase so verificados na base e o teste do Indol feito, adicionando-se
algumas gotas do reativo de Kovacs (dietilaminobenzaldedo) na superfcie do meio,
retirando-se o tampo de algodo.
a) MOTILIDADE
Prova positiva: meio turvo.
Prova negativa: meio lmpido ou crescimento s no local do inculo.
b) INDOL
Prova positiva: colorao vermelha.
Prova negativa: colorao amarela.
c) L-LISINA
Prova positiva: colorao roxa.
Prova negativa: colorao amarela.
2. gar CITRATO DE SIMMONS
Prova positiva: colorao azul
Prova negativa: colorao do meio inalterada
Observe que quando no ocorre utilizao do citrato, na prova negativa, no temos crescimento
bacteriano.
TABELA PARA IDENTIFICAO BIOQUMICA DAS ENTEROBACTRIAS
EPM
Bactrias

Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Enterobacter cloacae
Citrobacter freundii
Arizona
Shigella sp
Edwardsiella tarda
Salmonella sp
Serratia marcescens
Proteus mirabilis
Providencia rettgeri
Yersinia enterocolitica

Lactose

+
+
+
- /+
+
-

Glicose
com
produo
de gs

+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

H2S

- /+
+
- /+
+
-/+
-

CITRATO

MILI

Urease

L-TD

+
- /+
- /+
- /+
+
+

+
+
-

Motili- Indol
dade

- /+
+
+
+
+
+
+
+
+
- /+

+
-/+
- /+
+
- /+
+
-/+

Lisina
Citrato
Descarbo
-xilase

+
+
- /+
+
+
+
+
-

+
+
+
+
+
+
- /+
+
- /+

L-TD: L-triptofano desaminase

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IV) Reaes sorolgicas para identificao de sorogrupo de Escherichia coli:


Suspenses densas de culturas semeadas em gar nutriente s quais foram adicionados 3 ml
de soluo salina. Depois de obtidas as suspenses, estas foram submetidas fervura, para
destruio do antgeno K (que impede a aglutinao O).
V) Procedimento
1. Com o auxlio de uma ala, colocar um pouco de uma das suspenses bacteriana formalizadas
sobre uma lmina limpa e desengordurada. Sobre esta suspenso colocada na lmina, pingar uma
gota de um dos antissoros especficos e homogeneizar com o auxlio de um palito estril. Em
outra regio da mesma lmina, colocar a suspenso como descrito acima e, ao invs de anti-soro,
pingar uma gota de soluo fisiolgica estril. Repetir a mesma conduta com o outro antissoro
recebido.
2. Esperar aproximadamente um minuto e verificar se ocorre ou no aglutinao com algum dos
antissoros. Em no ocorrendo aglutinao com soluo fisiolgica (cultura rugosa), identificar o
sorogrupo da suspenso da cultura recebida.

QUESTES PARA RELATRIO


1. Qual foi o material utilizado e quais os resultados obtidos pelo seu grupo?
2. Compare os resultados obtidos entre as diversas bactrias estudadas na aula prtica por
outros grupos de seu laboratrio.
3. Pesquise sobre os meios seletivos para as Enterobactrias.
4. Quais so as doenas causadas pelas bactrias estudadas na aula prtica?
5. Diferencie disenteria e diarria.

Enterobactrias Provas Bioqumicas EPM

EPM
Glicose

Bactria
Fermenta
glicose
produo de
cido vira
indicador para
amarelo

formiase

Bactria
Fermenta
glicose
produo de
cido frmico
enzima
formiase
desdobra c.
Frmico em
CO2 e H2 bolhas

Urease
Tiossulfat
o-redutase

Bactria produz
tiossulfato
redutase age
no tiossulfato
de Na produz
H2S. H2S reage
com Fe do
Citrato de Fe
amoniacal
sulfeto de Fe
(precipitado
negro)

Bactria produz
urease - age
sobre a uria
formando CO2
e NH3. NH3
dissolve-se sob
forma de
carbonato de
amnia
alcaliniza o
meio - azul

L-triptofanodesaminase

Bactria produz
LTD que provoca
desaminao de
a.a., convertendoos em -cetocidos. No caso do
L-triptofano, formase cido indol
pirvico reage
com sais de Fe
origina composto
cclico de cor verde
escura

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Enterobactrias Provas Bioqumicas - Mili


MILi

Motilidade

Motilidade amostras
mveis se difundem
partir do inculo inicial
turvando o meio.
Amostras imveis
somente crescem no
local onde foram
semeadas

Lisina
descarboxila
se

Descarboxilases
promovem remoo
de CO2 dos a.a.
produz amina
alcalinizando o meio
cor prpura
Se a.a. no utilizado,
atravs da
fermentao da
glicose, acidifica-se o
meio amarelo nos
2/3 inferiores

Triptofanas
e

Indol anel de indol faz


parte da molcula de
triptofano. Triptofanase
age no a.a. libera anel
pirrlico. Coloca-se reativo
de Kovacs reage com
indol anel vermelho

Enterobactrias Provas Bioqumicas Citrato


de Simmons

Citrato de
Simmons
Amostras que utilizam citrato
como nica fonte de C tambm
utilizam sal de amnia como
nica fonte de Ni libera o Na.
Na junta-se com H2O e forma
NaOH alcaliniza o meio, que
vira indicador azul de bromotimol
para azul

16

Prtica 20 - Colorao de Ziehl-Neelsen


I) Introduo
As micobactrias so bacilos alcool-cido-resistentes (BAAR), ou seja, so bactrias na
forma de bacilos que, aps terem sido coradas pela fucsina, no se deixam descorar por uma mistura
de lcool e cido clordrico. Esta propriedade parece decorrer da firme fixao da fucsina a certos
lipdeos presentes na parede das micobactrias. Esta colorao foi desenvolvida por Ziehl-Neelsen.
Os BAAR so agentes etiolgicos de enfermidades que ocorrem em homens e animais. Neste
ltimo caso tambm podem ser consideradas zoonoses. As espcies de maior importncia so:
Mycobacterium tuberculosis (agente causal da tuberculose humana); Mycobacterium bovis,
(tuberculose bovina, que pode ser transmitida ao homem pelo leite in natura) e Mycobacterium
leprae (agente causal da Hansenase ou Lepra).
Dentro deste gnero, existem outras espcies que so consideradas oportunistas, ou atpicas,
ou ainda MOTT (Mycobacterium Other than Turbecle Bacilli). Geralmente, s causam
doenas quando existe uma imunodepresso ou outras molstias intercorrentes afetando os
pulmes, tais como: silicose, asbetose, ou qualquer outra patologia pulmonar. Atualmente, por
causa da AIDS tem ocorrido um aumento significante de casos de tuberculose em pacientes
HIV+, causados pelo M. tuberculosis e as Micobactrias oportunistas, em especial as do
complexo MAIS (ou M. avium, M. scrofulaceum e M. intracellulare). O diagnstico, em
qualquer dos casos de origem pulmonar, se faz pelo exame do escarro, corando-se pela tcnica
de Ziehl-Neelsen, seguido de cultivo em meios especficos como Lwenstein-Jensen, ou
Middlebrook 7H10 e identificao por mtodos bioqumicos especiais. Recentemente, tambm
esta sendo empregado o PCR.
b. Material
1. Lminas sabidamente positivas para BAAR (M. tuberculosis) para serem coradas pelo
mtodo de Ziehl-Neelsen (vide mtodo abaixo).
2. Vrias culturas de BAAR, em especial M. tuberculosis, e algumas micobactrias
oportunistas. Bactrias com pigmentao como: M. kansasii, M. gordonae; e, outras no
cromognicas como: M. avium e/ou M. intracellulare;
3. Bateria de corante para colorao de Ziehl-Neelsen.
III) Procedimento
1. Esfregao, j fixado, de secreo pulmonar (escarro);
2. Realizar a colorao pela tcnica de Ziehl-Neelsen para observar os BAAR;
3. Colorao de Ziehl Neelsen:
a) Cobrir os esfregao com fucsina de Ziehl. Aquecer at a emisso de vapores (No deixar o
corante secar). Esperar 5 minutos;
b) Lavar com gua corrente;
c) Descorar com lcool (97%), cido clordrico (1%);
d) Lavar em gua corrente;
e) Corar com azul de metileno por 1 minuto;
f) Lavar e secar;
g) Observar ao microscpio as lminas coradas;
h) Como se apresentam os BAAR.

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IV) Resultados

QUESTES PARA RELATRIO


1. O que so BAAR? Estas bactrias so de crescimento lento ou rpido? Quais so as
principais caractersticas especificas destas bactrias?
6. Por que, quando se suspeita de tuberculose, a colorao de Gram no empregada para
a anlise bacterioscopica do escarro na tentativa de identificao de micobactrias?
7. A tuberculose voltou a ser uma doena que preocupa os rgos de defesa sanitria de
vrios paises, inclusive do Brasil. somente a bactria M. tuberculosis que esta sempre
envolvida nestes quadros clnicos?
3. Quais as principais caractersticas de semelhanas e diferenas entre Mycobacterium
tuberculois e Mycobacterium leprae?

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