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Ouro Branco
Junho/2015
Ouro Branco
Junho/2015
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Isabel Cristina Braga Rodrigues - Orientadora
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Natlia Rocha Barboza Examinador 1
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Edson Romano Nucci Examinador 2
Ouro Branco,___/___/____
RESUMO
ABSTRACT
SUMRIO
1. INTRODUO........................................................................................................7
2. OBJETIVO.................................................................................................................9
2.1 Objetivos Especficos....................................................................................9
3. REVISO DA LITERATURA...................................................................................10
3.1 - Aplicao de protenas recombinantes para a sade humana................13
3.2 A Tecnologia do DNA Recombinante.........................................................16
3.3 Vetores...........................................................................................................17
3.4 - Sistemas de expresso para a produo de biofrmacos.......................27
3.5 - Estudos de Caso...........................................................................................33
3.5.1 - Citocinas..................................................................................................33
3.5.1.1 - Interferon cIFN-.................................................................................34
3.5.2 - Fatores de crescimento hematopoitico..............................................34
3.5.2.1 - Eritropoietina.......................................................................................35
3.5.3 - Hormnios................................................................................................37
3.5.3.1 - Insulina................................................................................................37
3.5.4 - Fatores de coagulao sangunea........................................................38
3.5.4.1 - Fator IX da coagulao sangunea.....................................................39
3.6 - Aspectos de mercado...................................................................................40
4. CONCLUSO..........................................................................................................43
5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................................44
1. INTRODUO
A tecnologia do DNA recombinante ou engenharia gentica consiste em processos
de manipulao do DNA, podendo isolar sequncias de DNA e inseri-las em uma
clula hospedeira, sendo possvel, posteriormente, separar e purificar as protenas
produzidas nesse processo. Essa tecnologia abriu novos campos, no s de
possibilidades teraputicas, como tambm no entendimento de diversas doenas e
vem ganhando cada vez mais espao na economia (SOUSA, 2006; REIS, 2009). O
DNA do doador extrado ter os genes de interesse isolados e estes, sero inseridos
em vetores e transferidos para uma clula receptora, esta ir amplificar os
fragmentos gnicos por replicao do DNA (clonagem) ou, mediante a montagem
correta do vetor, com os sinais de expresso adequados, ir expressar a protena
codificada pelo gene clonado (GRIFFITHS et al., 2000).
gentica
para
produo
de
biofrmacos.
Biofrmacos
so
quando se pretende
2. OBJETIVO
Este trabalho tem como objetivo abordar as caractersticas dos principais vetores e
sistemas de expresso utilizados na produo de protenas recombinantes com
aplicaes teraputicas.
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3. REVISO DA LITERATURA
Desde os primrdios os microrganismos so utilizados na produo de alimentos e
bebidas. Durante a dcada de 1940 vrios processos de cultivo em massa de microorganismos, em condies estreis, desencadearam a produo comercial de
antibiticos, vacinas, enzimas, aminocidos e esterides (VILLEN, 2002).
Tambm a partir da dcada de 1940, foram firmadas evidncias diretas que o DNA
fosse a molcula possuidora da informao gentica, sendo o cdigo que determina
todas as caractersticas dos seres vivos, com os experimentos de Avery e seus
colaboradores. Culminando, em 1953, com a formulao da estrutura desta
macromolcula por James Watson e Francis Crick. Estes pesquisadores
propuseram, utilizando os postulados de Erwin Chargaff (1940) e dados de difrao
de raios X obtidos por Rosalind Franklin e Maurice Wilkins (1950), que a estrutura do
DNA era formada por duas cadeias de nucleotdeos ligadas por ligaes fosfodister
entre os nucleotdeos. Essas cadeias se encontram pareadas em uma orientao
antiparalela e unidas por ligaes de hidrognio entre as bases nitrogenadas
complementares (A/T e C/G). As duas cadeias formam uma hlice que lembra uma
escada em espiral onde os degraus so as bases nitrogenadas e o corrimo
formado pelas desoxirriboses e os grupos fosfatos. A partir da definio da estrutura
do DNA, os cientistas tambm propuseram as bases para transmisso da
informao gentica, na qual a replicao do DNA utilizaria um molde de DNA
parental e ocorreria pela complementaridade de bases nitrogenadas (WATSON e
CRICK, 1953; REIS, 2009). A partir de ento, vislumbrou-se grandes avanos nas
tcnicas da biologia molecular.
J na dcada de 1960, foi possvel verificar um grande progresso na decifrao do
cdigo gentico, sendo esta considerada a descoberta mais importante do sculo,
para a gentica molecular. A descoberta das enzimas de restrio, em 1978, por W.
Arber, H. Smith e D. Nathans, possibilitou a construo de molculas de DNA
recombinante, fazendo com que segmentos especficos de molculas de DNA de
origens diferentes pudessem ser ligados. As enzimas de restrio so protenas
bacterianas, de alta especificidade, capazes de reconhecer uma base especfica na
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novas
descobertas
que
permitiram
criao
de
vacinas,
12
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das
protenas,
alm
das
interaes
com
outras
protenas
recombinantes
(fator
VIII,
fator
IX);
agentes
trombolticos
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CLASSE
Fatores
sanguneos
PRODUTO
Fator VIII
Fator VIIa
Fator IX
Fator ativador de
plasminognio
Anticoagulantes
e trombolticos
Hormnios
Hirudina
Protena C ativada
Insulina
Insulina anloga
Insulina inalvel
Hormnio do
crescimento humano
Hormnio folculo
estimulante
Calcitonina
Fatores de
crescimento
Glucagon
Eritropoietina
Eritropoietina anloga
GM-CSF
Interferon alfa
Interferon e
Interleucinas
Enzimas
Interferon beta
Antagonista de receptor
de interleucina 1
Interleucina 2
Glicosidase
L-iduronidase
N-acetilgalactosamina
4-sulfatase
Alfa galactosidase
INDICAO
ANO
TERAPUTICA
APROVAO
Hemofilia A
Algumas formas de
hemofilia
Hemofilia B
Infarto do miocrdio e
infarto agudo do miocrdio
Terapia anticoagulante e
preveno de trombose
venosa
Septicemia
Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus
Diabetes Mellitus
Algumas formas de
deficincia de crescimento
Infertilidade, anovulao e
superovulao
Osteoporose psmenopausa e doena de
Paget
Hipoglecemia
Anemia
Anemia
Neutropenia induzida por
quimioterapia
Hepatite B e C e vrios
tipos de cncer
Esclerose mltipla
Artrite reumatide
1992
1996
Carcinona de clulas
renais
Doena de Pompe
Mucopolissacaridose I
Mucopolissacaridose IV
1992
Doena de Fabry
2001
1997
1996
1997
2001
1982
1996
2006
1985
1995
1999
1998
1989
2001
1991
1986
1993
2001
2006
2003
2005
16
das
condies
de
conservao
armazenamento
apresentam
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3.3 Vetores
So molculas de DNA carregadoras que levam uma sequncia de DNA (o gene)
para o interior da clula hospedeira possibilitando que este fragmento de DNA seja
replicado. O vetor parte principal para a expresso do gene, pois permite que os
fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados na clula
hospedeira, por conterem sinais moleculares que so reconhecidos pelas mesmas
(ALBERTS et al., 2009).
Estes vetores devem ser relativamente pequenos, se possvel, de tamanho inferior a
10kb. Isso se deve ao fato de que as molculas pequenas so mais fcies de
manipular e mais difceis de sofrerem fragmentao durante a purificao.
Geralmente os vetores so derivados de DNA de bacterifago, DNA viral eucaritico
ou plasmdeo e os mais utilizados so caracterizados por serem bons veculos de
clonagem (BROWN, 2003; ALBERTS et al., 2009). Todos os vetores de clonagem
devem conter sequncias que permitam sua replicao autnoma dentro da clula
hospedeira, possuir ao menos um stio nico de clonagem que um stio de
restrio que no se repete na molcula e permitir a insero stio-especifica de
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outra molcula de DNA (insertos). Alguns vetores possuem stios para vrias
endonucleases de restrio posicionados lado a lado, em um segmento denominado
de stio mltiplo de clonagem (ZAHA et al., 2014).
Em algumas ocasies as clulas procariticas so incapazes de produzir protenas
funcionais a partir de gene eucarioto, as expresses desses genes necessitam de
vetores que possuem os sinais para expresso gnica que so reconhecidos pelas
clulas selecionadas como sistemas de expresso (BROWN, 2003). Possuem
sequncias de DNA que direcionam a sntese da protena codificada no inserto
gnico, ou seja, possuem sequncia promotora reconhecida pela RNA polimerase
do sistema de expresso, bem como stios de ligao ao ribossomo e sequncias
terminadoras tambm reconhecidas pela clula hospedeira (ALBERTS et al., 2009).
So, portanto, destinados a ativar um gene clonado e produzir cpias da protena
codificada em uma clula dita recombinante (KLUG et al., 2010).
Os plasmdeos so molculas circulares de DNA e existem independentes da clula
bacteriana e em alguns organismos eucariticos unicelulares, como leveduras.
Quase sempre portam um ou mais genes responsveis por caractersticas teis
exibidas pela bactria hospedeira. Alm disso, todos os plasmdeos possuem pelo
menos uma sequncia de DNA capaz de atuar como origem de replicao sendo
apto a multiplicar-se no interior da clula independentemente do cromossomo
bacteriano principal (BROWN, 2003; ZAHA et al., 2014).
Os plasmdeos utilizados como vetores so os mais simples e combinam a facilidade
de purificao com a alta eficincia de transformao, devem possuir basicamente
uma origem de replicao (ORI), um marcador de seletividade e o stio de clonagem.
A origem de replicao consiste em uma sequncia especfica do plasmdeo com
cerca de 1.000 pares de bases (pb). Neste local, h um conjunto de elementos
regulatrios envolvidos no controle do nmero de cpias do plasmdeo que sero
produzidas em uma nica bactria. Reconhecida a origem, a replicao do DNA se
inicia e segue continuamente, independentemente do restante da sequncia de
nucleotdeos, fazendo com que qualquer sequncia inserida no plasmdeo seja
replicada. O marcador de seletividade, normalmente um gene de resistncia a
antibitico confere a capacidade de identificao da bactria que recebeu o
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Aps a infeco da E.coli o genoma do fago pode seguir duas vias: uma o estado
ltico (Figura 3a), em que o DNA do fago permanece na bactria como uma molcula
independente e ocorre a ativao de alguns genes do fago em conjunto com a
inativao de outros. Como resultado, o cromossomo do fago replicado e a sntese
das protenas do capsdeo ocorre imediatamente aps a replicao formando-se
novas partculas virais. Minutos aps a infeco, a clula hospedeira lisada e
ento ocorre a liberao de cerca de 100 novos fagos (BROWN, 2003;
NASCIMENTO et al., 2003).
A outra via que o cromossomo do fago pode seguir denominada de estado
lisognico (Figura 3b). O DNA do fago integrado ao genoma da bactria
hospedeira, por um processo de recombinao stio-especfica. Todos os genes do
profago, que a forma integrada do DNA do fago, ficam inativos, com exceo do
gene que produz a protena repressora do ciclo ltico. O profago pode ser liberado do
genoma da bactria e o fago reverte para o modo ltico, principalmente em situaes
de leso do DNA da clula hospedeira (BROWN, 2003). A bactria carregando o
profago multiplica-se e este replicado e distribudo para as bactrias descendentes
(NASCIMENTO et al., 2003).
Apesar de existir mais de um tipo de fago, todos eles possuem o mesmo padro de
infeco. O processo inicia-se com a fixao da partcula do fago na superfcie
externa da bactria e em seguida o seu material gentico injetado no interior da
clula, um processo denominado transfeco (Figura 3). Ento, enzimas especficas
replicam a molcula de DNA do fago que ento codificada por genes do seu
prprio cromossomo. Por fim, outros genes do fago dirigem a sntese dos
componentes proteicos do capsdeo fazendo com que novas partculas virais sejam
montadas e liberadas da bactria (BROWN, 2003).
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corretamente
impedem
degradao
do
cromossomo
por
nos
plasmdeos
que
ocorrem
naturalmente
em
Agrobacterium
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solo que infecta regies lesionadas do caule das plantas, induzindo a proliferao
cancerosa do tecido do caule. O plasmdeo Ti (indutor de tumor), presente nesta
bactria, um plasmdeo grande, superior a 200 Kb que est associado
capacidade de induo da doena dentro das clulas vegetais. Este plasmdeo
transporta diversos genes envolvidos no processo de infeco. Uma das principais
caractersticas do plasmdeo Ti que, aps a infeco, uma parte da molcula
integrada no DNA cromossomal da planta, o chamado T-DNA, esse mantido na
clula da planta e copiado para o genoma das clulas filhas. Desta forma, esta
propriedade explorada para inserir DNAs exgenos em clulas vegetais (BROWN,
2003; ZAHA et al., 2014).
Para a clonagem em clulas de mamferos, podem ser utilizados os retrovrus que
possuem a capacidade de insero de sequncias gnicas no genoma hospedeiro
ou pode ser realizada a microinjeo de plasmdeos bacterianos diretamente no
ncleo das clulas de mamferos (BROWN, 2003).
bactrias
(procariotos),
fungos
leveduriformes
(leveduras),
fungos
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sinalizadoras
que
direcionem
protena
heterloga
para
vacolos
de
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Bactrias
Leveduras
VANTAGENS
DESVANTAGENS
APLICAES
Regulamentao
definida; gentica
conhecida; manipulao
fcil e de baixo custo
Protenas no so
secretadas usualmente;
podem produzir
endotoxinas; no
ocorrem modificaes
ps-traducionais
Glicosilao excessiva
pode prejudicar a
bioatividade; pode
conter imunognicos e
antgenos
Regulamentao
incompleta;
crescimento lento; meio
de cultura caro;
infeco por
baculovirus (etapa
extra de purificao);
vrus humanos podem
infectar estas clulas
Mtodo caro;
crescimento lento; pode
conter alergnicos e
contaminantes,
purificao complicada
Mtodo
relativamente novo:
Novavax produz
partculas virais
aplicadas na
produo de vacinas
Pouca experincia em
regulamentao;
potencial para
contaminao viral
Hormnio de
crescimento
(cabras - Genzyme);
fator VIII (gado e
sunos - PPL
Therapeutics)
Vacina clera
(tabaco - Chorogen,
Inc.); lpase gstrica
(milho - Meristem);
vacina para hepatite
B (batatas - Boyce
Thompson)
Conhecido como
seguro; bom histrico de
uso; crescimento rpido;
baixo custo de
manipulao;
modificaes pstraducionais
Modificaes pstraducionais; alto
rendimento
Clulas de
inseto
Clulas de
mamferos
Animais
transgnicos
Plantas
transgnicas
Modificaes ps
traducionais; bom
histrico de
regulamentao; boa
opo no caso de
protenas grandes e
complexas
Processamento de
protenas complexas;
excelentes nveis de
expresso
Ciclos de
desenvolvimento
pequenos; fcil
armazenagem das
sementes; no existe
conhecimento do vrus
de planta que tenha
contaminado humanos
Apresenta potencial
para novos
contaminantes (fungos
do solo, bactrias e
pesticidas);
possibilidade de conter
alergnicos
Ativador
plasmognico de
tecido; fator VIII;
anticorpos
monoclonais
(Hercepin)
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3.5.1 - Citocinas
Citocinas so molculas proteicas produzidas por clulas do sistema imunolgico e
utilizadas na comunicao intercelular, so glicosiladas ou no e enviam diversos
sinais estimulatrios para diferentes clulas, apresentando papel fundamental na
regulao da resposta imune e inflamatria (DE OLIVEIRA, 2011). As mais
importantes so: os interferons, o fator de crescimento de granulcitos e as
interleucinas. O interferon- foi um dos primeiros biofrmacos a ser produzido pela
tcnica de DNA recombinante, indicado para o tratamento das Hepatites B e C, no
carcinoma renal e certas formas de leucemia (PFIZER, 2015). Na hepatite C O IFN-
age diretamente contra o vrus e tambm aumenta a resposta imune. Quando a
clula infectada pelo vrus, esse vrus fica alojado dentro dela. O interferon
estimula a exposio dos antgenos virais na superfcie das clulas infectadas,
reconhecendo esses antgenos, o sistema de defesa do organismo passa a atacar
essas clulas. Nesse caso, o interferon age especificamente contra o antgeno viral
que estiver na clula (CAMPOS, 2003).
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3.5.2.1 - Eritropoietina
A eritropoietina (EPO) um hormnio glicoprotico que regula a proliferao e a
diferenciao das clulas hematopoiticas, como os glbulos vermelhos. Ela
estimula as clulas tronco jovens da medula ssea, os eritroblastos, a aumentar sua
atividade mittica e se diferenciarem em eritrcitos. um hormnio produzido
naturalmente nos seres humanos e nos animais pelos rins e fgado. A eritropoietina
recombinante tem a mesma funo do hormnio natural. uma protena de grande
interesse comercial, devido ao seu amplo uso teraputico, como nas prevenes de
diversas formas de anemias, na insuficincia renal crnica, doenas hematolgicas,
cnceres, entre outras, porm precisa ser glicosilada corretamente para apresentar
atividade biolgica (FONSECA, 2006; MENDES, 2009).
A produo de EPO em culturas de clulas eucariticas um processo de alto custo
e baixo rendimento, alm disso, as modificaes ps-traducionais em culturas de
clulas no so adequadas, gerando uma protena recombinante com tempo de
meia vida curto, o que encarece o tratamento, por necessitar de mais aplicaes
dirias. Assim, a melhor alternativa a expresso desta protena em animais
transgnicos. Porm, diversas tentativas j foram realizadas em camundongos,
coelhos e sunos, mas diversos problemas com estes animais foram detectados
devido falta de especificidade das sequncias promotoras utilizadas para as
glndulas mamrias (MENDES, 2009). A glndula mamria escolhida como
biorreator, uma vez que as protenas do leite so expressas especificamente neste
local, sem escape para a circulao sangunea, e tambm apresentam altos nveis
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3.5.3 - Hormnios
Hormnios so substncias especficas produzidas pelo sistema endcrino ou por
neurnios e so responsveis pela regulao da produo de diversas molculas no
organismo. Os hormnios teraputicos mais conhecidos so a insulina, o glucagon,
o hormnio de crescimento e as gonadotrofinas. A insulina um agente que
combate o diabetes mellitus diminuindo o nvel de glicose no sangue (AMB e
INTERFARMA, 2013).
3.5.3.1 - Insulina
A insulina humana um hormnio proteico, constitudo por 51 aminocidos.
produzida nas clulas pancreticas e localizada nas Ilhotas de Langerhans,
considerada como principal regulador da homeostase metablica tem como funo a
reduo da glicemia (taxa de glicose no sangue). O processo se d atravs do
mecanismo de transduo de sinal que ativa os receptores de insulina presentes na
membrana plasmtica que estimula a expresso dos transportadores de glicose,
capazes de captar molculas para serem utilizadas como fonte de energia ou
estocadas como glicognio (DA CUNHA, 2008; BAESHEN, 2014). A insulina
utilizada no tratamento de um grupo de diferentes tipos de doenas do metabolismo
que levam ao aumento dos nveis de acar no sangue, como o diabetes mellitus
que caracterizado pela deficincia de secreo de insulina. A pr-insulina o
resultado da converso da pr-pr-insulina e diferente da insulina que composta
por dois peptdeos, a pr-insulina composta por trs peptdeos, a cadeia A, a
cadeia B e um peptdo C, alm da sequncia sinal para endereamento da protena
ao retculo endoplasmtico e posterior secreo (LOPES et al., 2012).
A pr-insulina foi expressa por Cunha (2012) em plantas transgnicas de soja. Este
autor construiu um vetor plasmidial com sequncias regulatrias que direcionassem
a pr-insulina heterloga para a semente da soja e que a mesma fosse armazenada
em vacolos no interior das clulas, impedindo a degradao da mesma por
proteases presentes no citoplasma. Para alcanar este objetivo o autor construiu um
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4. CONCLUSO
Nesta reviso foi possvel expor as caractersticas essenciais dos vetores e sistemas
de expresso utilizados em Engenharia Gentica, mostrando a importncia da
seleo destas molculas e clulas na produo de protenas recombinantes para
aplicao teraputica.
Os estudos de caso apresentados mostram que mesmo para biofrmacos j
consolidados no mercado ainda possvel buscar sistemas de expresso
alternativos que possam reduzir os custos de produo e tornar os mesmo mais
acessveis populao. Para isso, imperativo efetuar a construo do cassete de
expresso de modo aumentar os rendimentos de produo e selecionar o sistema
de expresso de modo a evitar perdas com a expresso de protenas sem funo
biolgica.
A determinao e caracterizao da estrutura de protenas comea a ganhar maior
ateno devido possibilidade de expresso e purificao em larga escala,
permitindo o lanamento de novas drogas e estratgias teraputicas. Alm do mais,
o mercado desses biofarmacos torna-se promissor frente busca contnua e
crescente por produes mais rentveis e otimizadas. Sendo necessrio um rgido
controle das etapas de processo, e purificao.
A tendncia de crescimento de
mercado das protenas, expostas neste trabalho, est relacionada aos excelentes
resultados obtidos em pesquisa e desenvolvimento. Assim, em um cenrio brasileiro
e mundial acredita-se que a indstria de biofrmacos continuar a ter um expansivo
crescimento.
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5. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ABDI & CGEE. Biotecnologia: iniciativa nacional de inovao estudo prospectivo de
inovao viso de futuro e agenda 2008-2025. Braslia: INI Biotecnologia, 2008. 265p.
ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. Biologia
molecular da clula. 5ed. Porto Alegre: Editora Artmed, 2009. 1396p.
AMB Associao Mdica Brasileira e INTERFARMA Associao da Indstria
Farmacutica de Pesquisa. Medicamentos Biolgicos na Prtica Mdica. So Paulo:
Interfarma, 2013. 442p.
BAESHEN, N. A.; BAESHEN, M. N.; SHEIKL, A.; BORA, R. S.; AHMED, M. M. M.;
RAMADAN, H. A. I.; SAINI, K. S.; REDWAN, E. M. Cell factories for insulin production.
Microbial Cell Factories, v.13, p.14, 2014.
BENAVIDE, V. G. Panorama sobre alguns entraves e desafios na produo nacional de
biofrmacos. 2013. 44f. Monografia (Ps-Graduao em Tecnologias Industriais
Farmacuticas) Instituto de Tecnologia em Frmacos Farmanguinhos, Rio de Janeiro.
2013.
BORGES, T. F. B. Construo de um vetor integrativo em mltiplas cpias para
Saccharomyces cerevisiae utilizando seqncias delta. 2009. 83f. Dissertao (Mestrado em
Biologia Molecular) - Universidade de Braslia, Braslia, 2009.
BROWN, T. A. Clonagem Gnica e Anlise de DNA. Porto Alegre: Editora Artmed, 2003.
CARDEAL, I. C. M. A.; Uso teraputico de chaperones em doenas conformacionais. 2013.
61f. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmecuticas) - Universidade Fernando Pessoa,
Porto, Portugal, 2013.
CARLOS, M. M. L.; FREITAS, P. D. F. S. Estudo da cascata de coagulao sangnea e
seus valores de referncia. Acta Veterinria Braslica, v.1, n.2, p.49-55, 2007.
CARUSO, C. S. Clonagem, expresso e caracterizao de protenas recombinantes de
Xylella fastidiosa. 2007. 187f. Tese (Doutorado em Cincias) - Universidade de So Paulo,
So Carlos, 2007.
CESCA, K. Estudo da produo de poli-hidroxialcanoatos escherichia coli recombinante a
partir de soro de queijo. 2011. 103f. Dissertao (Mestrado em Engenharia de Alimentos)
Universidade Federal de Santa Catarina, Florianpolis, SC, 2011.
CLARK, A. J. The mammary gland as a bioreactor: Expression processing and production of
recombinant proteins. Journal of Mammary Gland and Neoplasia, v.3, n. 3, 1998.
COSTA, M. A. F., COSTA, M. F. B. Biossegurana de OGM: uma viso integrada. Rio de
Janeiro: Publit, 2009. 384p.
CUNHA, N. B. Expresso recombinante e caracterizao molecular e funcional de prinsulina humana, do hormnio de crescimento humano e do fator IX de coagulao
sangunea em plantas transgnicas de soja [Glycine Max L. (Merril)]. 2012. 130f. Tese
(Doutorado em Biologia Molecular) Programa de Ps-Graduao em Biologia Molecular do
Departamento de Biologia Celular, Universidade de Braslia, Braslia.
45
Disponvel
Acesso
em:
em:
46
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48