Inmovilizacin de enzimas

Guachambala V.; Ramos K.; Unapanta A.*

BIOTECNOLOGA AGROINDUSTRIAL II
Grupo: 2
*Escuela Politcnica Nacional, Facultad de Ingeniera Qumica y Agroindustria
Quito, Ecuador
e-mail: vernica.guachambala@epn.edu.ec, karol.ramos@epn.edu.ec alexander.unapanta@epn.edu.ec

Resumen: La inmovilizacin de enzimas permite obtener enzimas en forma insoluble que retienen su actividad cataltica y pueden
ser reutilizadas repetitivamente, lo que brinda a la industria procesos econmicamente rentables. La prctica tuvo como objetivo
la inmovilizacin de papana, mediante cromatografa de intercambio inico, para la cual se utiliz gel de Sepharosa, tampn
Fosfato y BApNA como sustrato. Se realizaron medidas de absorbancia a 280 y 400 nm, con el fin de evidenciar la actividad
cataltica que presenta la papana inmovilizada. Con los datos obtenido, se realiz un cromatograma de absorbancia versus
tiempo, a partir de ello se evidenci la inmovilizacin y la retencin de la actividad enzimtica rferebte a la papana. Por lo
tanto, esta tcnica evidenci una alta eficiencia de inmovilizacin a pesar de ciertos inconvenientes ocurridos a lo largo de la
prctica.
Palabras clave: Inmovilizacin, enzimas, papana, cromatografa, absorbancia.
Abstract: The enzyme immobilization allows for obtain enzyme in insoluble form which retain their catalytic activity and can be
reused repeatedly, providing cost-effective processes to industry. This practice had as objective immobilization of Papain, by
using ion exchange chromatography, for which Sepharose gel, phosphate buffer and BApNa was used as substrate. Absorbance
measurements at 280 and 400 nm were conducted, to demonstrate that the immobilized papain has catalytic activity. With the data
obtained was drawn a chromatogram of absorbance versus time, representing that if Papain immobilization was obtained, and
this retained its activity. Indeed, this technique despite some inconveniences occurred along practice showed a high efficiency of
immobilization.
Keywords: Immobilization, enzymes, Papain, chromatography, absorbance..

1. MATERIALES Y METODOLOGA
La preparacin de la columna cromatogrfica, la preparacin
de la muestra y la alimentacin de la muestra fueron los
principales procesos que se desarrollaron para la
inmovilizacin enzimtica.
Inicialmente se realiz la preparacin de la columna
cromatogrfica, para ello se tom 100 mL de DEAE Sepharosa
CL-6B y elimin la solucin de etanol presente, con ayuda de
un FRITA y una bomba de vaco. Caso seguido, se suspendi
el gel en agua destilada y agit por un lapso de tiempo de diez
minutos. Una vez realizado el paso anterior, se coloc el gel
en el FRITA con el fin de realizar tres lavados consecutivos de
con agua destilada y solucin tampn, cabe mencionar que se
utiliz solucin tampn fosfato a pH de 7.5 y concentracin
de 50 mM. Posteriormente, se suspendi el gel en la solucin
tampn y empac la suspensin prepara a 5 cm del extremo
superior en la columna, se coloc el segundo pistn. Al final
de esta etapa, se lav cuidadosamente durante 30 minutos el
sistema con la solucin tampn para evitar el agrietamiento en
la Sepharosa que se pueda producir.
La preparacin de la muestra es considerada como la siguiente
etapa del proceso de inmovilizacin enzimtica. Durante esta
etapa se determin, con ayuda de un conductmetro, la
conductividad del tampn utilizado para equilibrar la columna.

Luego, se diluy el extracto con agua ionizada con el fin de

alcanzar la conductividad de la solucin tampn.
Como ltima instancia se procedi a la alimentacin de la
muestra. Con ayuda de una bomba peristltica y a velocidad
constante se aliment a la columna 50 mL de muestra con
conductividad previamente corregida. Una vez finalizada la
alimentacin de la muestra, se lav la columna con solucin
tampn hasta conseguir la ausencia de protena a la salida de
la misma, cabe mensionar que la cuantificacin de protena se
realiz mediante espectrofotometra. Finalmente, se aadi a
la columna en relacin de 1:20 la solucin de sustrato BApNA
de 15mg/mL y se recolect en tubos de ensayo 30 fracciones
de producto cada 3 minutos. Mediante espectrofotometra se
determin la absorbancia presente en cada tubo a una longitud
de onda de 400 nm.

2. TABLAS DE DATOS Y DIAGRAMAS

3. CLCULOS
3.2. Clculo del tiempo
3

= # 1

[Ec. 1]

Dnde:
t : Tiempo en (min)
# fraccin: nmero de tubos que se han tomado en la muestra
3

= 17 = 51
1

4.1. Resultados
1,2
1

Absorbancia

Tabla 1. Valores de la absorbancia de las fracciones

proteicas recolectadas
Tiempo
Numero de fraccin
Absorbancia
(min)
Absorbancia a 280 nm
3
0,032
1
6
0,022
2
9
0,019
3
12
0,019
4
15
0,09
5
18
0,551
6
21
0,82
7
24
0,959
8
27
1,096
9
30
0,571
10
33
0,085
11
36
0,055
12
39
0,029
13
42
0,018
14
45
0,02
15
Absorbancia a 400 nm (dilucin 1/10)
48
0,955
16
51
0,032
17

4. RESULTADOS Y DISCUSIN

0,8
0,6
0,4
0,2

0
-0,2 0

20
40
Tiempo (min)

60

Figura 1. Cromatograma de las fracciones proteicas

recolectadas
4.2. Discusin de resultados
En la Figura 1. se observa el cromatograma resultante de las
fracciones proteicas recolectadas en el proceso de
inmovilizacin de enzimas, el cual cuenta de dos zonas
especficas las cuales representan el comportamiento de las
partculas proteicas en la columna cromatogrfica.
La primera zona corresponde a la zona de carga y lavado,
comprendido entre el minuto 0 hasta 12, en este rango de
tiempo no observa un cambio representativo de la absorbancia,
esto se da debido a que inicialmente se coloc nicamente el
tampn fosfato en la columna cromatogrfica con el fin de
equilibrarla y humedecer el gel de Sepharosa por lo que sta
an no contena la enzima inmovilizada, mientras que desde
los 12 hasta 45 minutos se ve un incremento y luego un
descenso en la absorbancia, en este rango de tiempo se observa
la formacin de un pico, el cual indica que existi la
inmovilizacin de la enzima, pues este pico indica que se dio
una interaccin entre el sustrato y la sepharosa, la sepharosa
son molculas semejantes a esferas porosas las cuales atraen a
las molculas cargadas negativamente, produciendo una
interaccin y retardando su descenso, mientras las molculas
con carga positiva son repelidas provocndoles un descenso a
mayor velocidad.
La segunda zona que va desde el 45 hasta el 51 minutos, esta
zona corresponde a la zona de elucin, donde se tiene la
enzima y el sustrato en la columna cromatogrfica con gel
suspendido en el tampn para que al pasar por la columna con
el gel de la Sepharosa reaccione con la enzima y se forme el
producto, pues la Sepharosa est compuesta por agarosa que
es un polmero lineal que forma geles debido a la multiplicidad
de puentes hidrgeno y es un excelente medio por su
biocompatibilidad, la capacidad de elucin es mnima, pues la
capacidad es mayor cuanto ms sustituida est la matriz, la
interaccin con la macromolcula sea mayor y el tamao del
poro de la matriz sea mayor (FBIOYF, 2011, p. 2), por lo que
en el cromatograma se tienen como resultado que la mayora

de las protenas se aadi a la matriz, lo cual se evidencia por

la presencia de un pico alto en el cromatograma, cabe resaltar
que se hubieran obtenido mejores resultados si no hubiera
existido una ruptura de la columna del cromatograma por falta
de alimentacin del extracto acuoso de la papina, un aspecto
importante en la inmovilizacin de enzimas es que durante el
avance de la reaccin la sepharosa va tomando un color
amarillento al estar en contacto con el sustrato BApNA, esta
coloracin es debido a la hidrolisis del enlace peptdico, esta
hidrolisis tambin genera -nitroanilina entre otros productos.
(Sinche, 2009, p.29)
La inmovilizacin de enzimas permite una mejora
significativa de su estabilidad, lo que hace posible su empleo
en la produccin industrial. Las aplicaciones ms importantes
de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en
aplicaciones analticas (biosensores), aplicaciones mdicas
(tratamientos con enzimas inmovilizadas), aplicaciones
industriales (en la industria qumica, farmacutica, alimentaria
y de tratamiento de residuos) (Romero, Meja, Snchez,
Balagurusamy y Luvanos, 2014, pp. 4-5).
5. CONCLUSIONES
La cromatografa de intercambi inico es un mtodo efectivo
para la inmovilizacin de enzimas, debido a la elevada catlisis
enzimtica que present la papana. La representacin grfica
del cromatograma permiti verificar la inmovilizacin y
actividad cataltica de la papana. El uso del sustrato permiti
verificar que la papana se adhiri en la columna, debido a que
esta se torn de color amarillento, por la hidrolisis del BApNA
en la columna con la formacin de p-nitroanilina que le da el
color amarillo. Las enzimas inmovilizadas presentan un gran
uso industrial, por lo que la aplicacin de esta tcnica atrae
grandes beneficios para los procesos biotecnolgicos.
6. RECOMENDACIONES
La prctica present ciertos inconvenientes debido a que por
descuidos en la alimentacin de la muestra la columna se sec
y se agriet, por lo que se debe prestar atencin a todos los
detalles y no dejar que ingrese aire a la columna para as poder
tener una eficiencia mayor en la inmovilizacin de la enzima.
7. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
FBIOYF. (2011). Separacin de biomolculas. Bioqumica.
Cromatografa.
Recuperado
de
http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/6799/
mod_resource/content/0/Separacion_de_biomoleculas.pdf.
(p.2) (Junio, 2015).
Romero L, Meja C, Snchez A, Balagurusamy N y Luvanos
M. (2014). Aplicaciones de enzimas inmovilizadas.
Recuperado
de
http://www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx/AQM/No.%
2011/1.pdf (pp.4-5) (Junio, 2015).

Sinche M. (2009). Aislamiento, purificacin parcial y

caracterizacin cintica de las proteasas presentes en el
ltex de los frutos de una planta del gnero Vasconcella.
Recuperado
de
http://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/1661/1/CD2218.pdf (p.29) (Junio, 2015).