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Prctica 1

Determinacin del efecto de la concentracin de sal en la


fermentacin lctica de hortalizas encurtidas

Introduccin
El procedimiento de encurtir los vegetales con sal tiene como objetivo principal
la conservacin de la calidad nutritiva del producto. Los alimentos pierden agua
al establecerse un equilibrio osmtico con la salmuera. Simultneamente, penetra
la sal a los tejidos celulares y salen carbohidratos, compuestos nitrogenados,
minerales y otras sustancias que son utilizadas durante la fermentacin (Prescott
y Dunn,1959). En la salmuera se desarrolla una flora microbiana mixta,
predominando las bacterias lcticas. stas acidifican el medio y bajan el pH lo
suficiente para prevenir el desarrollo de microorganismos patgenos y de los que
deterioran al vegetal. El tratamiento se completa sustituyendo la salmuera de
fermentacin con la de cobertura, a la cual se le aaden vinagre y condimentos
(Escamilla et al., 1987; Fuselli et al., 1992; Pederson, 1979; Prescott y
Dunn,1959). Durante el proceso hay cambios de sabor, textura y color en la
hortaliza, modificando ligeramente sus propiedades nutritivas (Belatsouras et al.,
1983; Ruz y Jimnez, 1994, Weinberg et al., 1993).
Existen tres grupos microbianos que pueden aparecer en el proceso fermentativo
(Carr, 1975; Fernndez et al., 1993; Pederson y Albury, 1969; Prescott y
Dunn,1959):
Bacterias lcticas. Generalmente prevalecen desde el inicio sobre otros
grupos microbianos. Este grupo puede fortalecerse con una apropiada
inoculacin.
Enterobacterias. Estas provienen de la tierra y del agua. Se observan en
baja concentracin al inicio de la fermentacin.
Levaduras. En la ltima etapa del proceso aparecen bajas concentraciones
de levaduras fermentativas. Las levaduras aerobias son indeseables porque

forman pelculas en la superficie, disminuyen la acidez y deterioran el producto.


Se evita su desarrollo cubriendo la superficie de la salmuera con plstico.
Para preparar los encurtidos vegetales se aade sal directamente a las hortalizas
foliares (col, brcoli, etc.) en una concentracin entre 2.5 -3%, y se espera a que
se libere agua de ellas para formar una salmuera. Si las hortalizas son frutos,
races o tallos, stas se sumergen en una salmuera preparada con antelacin, en
un rango de concentracin de NaCl que flucta entre 7 - 16%, y considerando
generalmente una relacin en peso entre NaCl/hortaliza de 9:100. Para expresar
la concentracin de NaCl en la salmuera se usan los GRADOS SALINOS,
considerando la siguiente equivalencia (Carr, 1975; Prescott y Dunn, 1959):
1o S = 0.265 % de NaCl, a 20o C
Las hortalizas duras pueden ser sometidas a un pre-tratamiento con cal para
ablandar los tejidos. Cuando el vegetal no aporte el nivel apropiado de
carbohidratos a la fermentacin puede aadirse azcar a la salmuera. En
ocasiones se aade un poco de cido actico al inicio del proceso para disminuir
el pH y favorecer el desarrollo de las bacterias lcticas (Carr, 1975; Pederson,
1979; Prescott y Dunn,1959; Ruz y Jimnez, 1994).

Objetivo
Determinar el nivel apropiado de concentracin de sal en la salmuera que
favorezcan la fermentacin lctica y la conservacin de las hortalizas.

Materiales y reactivos (por equipo)


1 asa bacteriolgica
1 barra de agitacin magntica
1 charola profunda
2 esptulas pequeas de acero inoxidable
4 frasco de 120 ml de capacidad nominal con tapa de rosca
1 frasco de vidrio de 3.5 l (1 galn), con tapn de rosca.
1 mechero fisher con manguera
1 mechero bunsen con manguera

1 piceta
1 pinzas para crisol
2 pipetas graduadas de 1 ml
5 pipetas graduadas de 10 ml
1 probeta de 250 ml
1 probeta de 2000 ml
1 recipiente metlico de 15-20 cm de altitud y 18-22 cm de dimetro
1 salmetro
4 tubos de cultivo medianos con tapn roscado
1 tubo en T de vidrio con manguera
2 vasos de precipitados de 50 ml
1 vaso de precipitados de 2000 ml
Algodn, bata, cerillos o encendedor, cinta adhesiva tipo masking, cuaderno de
registros, cubrebocas, detergente, papel aluminio, papel sanitario, papel estraza,
plstico (pelcula de polietileno), pluma, plumn marcador negro, reloj, tela paalina o
gasa, tijeras, toallita para las manos y trapo de franela.
Reactivos:
cido actico concentrado
H2O destilada o desionizada
Glucosa
NaCl
Soluciones amortiguadoras de referencia, pH 4.0 y 7.0
Solucin de fenol al 1 % *
Solucin de fenol al 5 % *
Solucin de H2SO4 al 10 % *
Solucin de NaOH al 10 % *
Un tubo con cultivo axnico de 48 h de una cepa de Lactobacillus plantarum, en
medio complejo slido.
Hortalizas
(*) Preparadas previamente segn el ANEXO A.

Para anlisis:
Se deben considerar los materiales, reactivos y equipo necesarios para realizar
los anlisis, segn las indicaciones de los ANEXOS A, B y C.

Equipo (para el grupo):


Autoclave, balanza granataria digital, balanza con capacidad para 2 Kg, campana
de flujo laminar, parrillas de agitacin y calentamiento electrorregulables,
potencimetro, refrigerador, salmetro.

Diseo de la prctica
Se evaluarn dos niveles de concentracin de sal en la fermentacin lctica
dentro del rango normal que se utilice en la industria de elaboracin de hortalizas
encurtidas. Cada equipo de alumnos preparar su salmuera, sus vegetales y el
inculo. Despus, llevar a cabo una fermentacin de 3 4 semanas,
muestreando y realizando los anlisis semanalmente. Despus realizar los
clculos, se compararn los resultados de dos equipos, cada uno con la misma
hortaliza y con un nivel diferente de concentracin de salmuera. Cada equipo
presentar un informe con los resultados de ambos equipos y su discusin. Los
resultados se discutirn en una sesin global.
Se proponen dos niveles para evaluar el efecto de la concentracin de sal en esta
fermentacin lctica con Lactobacillus plantarum, de acuerdo al Cuadro 2.1. Los
parmetros evaluados sern los cambios en la concentracin de cido lctico y
pH. Adems, se observar cules grupos microbianos predominan en las
diferentes etapas del cultivo.
CUADRO 2.1 Niveles de concentracin de sal para la
fermentacin lctica de hortalizas encurtidas
_____________________________________________________________________________________

No. Fermentador

Conc. inicial de sal*


(oS )

Conc. final de sal*


(oS )

_____________________________________________________________________________________

15

30

30

60

_____________________________________________________________________________________

* 1 grado salino (S) = 0.265 % NaCl

La concentracin de sal en la salmuera se incrementa a 1.5 veces la


concentracin inicial a la primera semana, para favorecer la actividad de

Lactobacillus plantarum durante la ltima semana. Una semana antes del


trmino de la fermentacin, la concentracin ser el doble del valor inicial.
Durante el reposo de 2 semanas, la salmuera se diluye porque la hortaliza libera
agua. Cada semana debe medirse la concentracin salina y ajustarla al nivel
deseado.

Cultivo del inculo

Preparacin de
materiales de muestreo

L. plantarum en caldo MRS,


cultivo a 30C, 48 h, 200 rpm.

Pipetas, frascos de muestreo y


frasco fermentador.

Preparacin de la
salmuera

Ajustar sal en base al Cuadro 2.1 (15


o 30S) y ajustar a pH 5.

Preparacin de
hortalizas

Lavar, cortar pednculo o pelar o


hervir.

Fermentacin

Acomodar de hortalizas, inocular con


30 ml del inculo de 48 h e incubar a
temperatura ambiente
por 2
semanas.

Muestreo

Se muestrea en el t = 0 das y cada


semana, tomando 15 ml.
Adicin de sal en la primera semana.

Ajuste de sal
Anlisis de la
fermentacin
Informe de resultados

Morfologa microbiana, pH y acidez.

Clculos, grficas, tablas y dibujos;


discusin y conclusin.

Figura 2.1 Diagrama de actividades para el desarrollo de la prctica. Determinacin


del efecto de la concentracin de sal en la fermentacin lctica de hortalizas
encurtidas.

1a Actividad: Cultivo del inculo


Estructura
Se verifica la pureza de la cepa de Lactobacillus plantarum que se ha
desarrollado previamente en un tubo con agar inclinado, realizando un frotis
teido con la tcnica de Gram (ANEXOS A y C). El caldo de M.R.S. se inocula
con una asada de la bacteria en condiciones aspticas y se incuba durante 48 h, a
30oC, con agitacin.

2a Actividad: Preparacin de materiales de muestreo


Estructura
Estas actividades se realiza antes de la fermentacin principal.
Se envuelven con papel estraza 4 pipetas graduadas de 10 ml. Se prepara en un
matraz erlenmeyer caldo M.R.S., siguiendo el procedimiento indicado en el
ANEXO B, y se esterilizan en autoclave a 121oC, durante 15 min.
En casa se hierven en bao mara los frascos de muestreo (120 ml), durante 30
min. Despus se retiran del agua con precaucin, se escurren, se cierran y se
dejan enfriar lentamente. En el laboratorio se lava cuidadosamente un frasco de
vidrio de 3.5 L con su tapa, dando un ltimo enjuague con agua destilada, se deja
secar y se cierra.

3a Actividad: Preparacin de la salmuera


Estructura
La base de clculo para todos los componentes de la salmuera indicados en el
Cuadro 2.2 ser un volumen de 1500 ml. Se vierten aproximadamente 1200 ml
de agua destilada en un vaso de precipitados de 2 L. Se aaden la sal de mesa y
la glucosa, calculadas para 1500 ml. Las soluciones se mezclan con un agitador
magntico sobre una parrilla elctrica. El pH de la salmuera se ajusta a 5.0 con
soluciones de H2SO4 o NaOH al 10%, con ayuda de un potencimetro, calibrado
previamente. Se mide el volumen de la salmuera con una probeta, se ajusta con

agua destilada a un volumen de 1470 ml y se regresa al vaso. Esta salmuera debe


prepararse el mismo da de la fermentacin.
Cuadro 2.2 Componentes de la salmuera para la
fermentacin lctica de hortalizas encurtidas
Ajuste de concentracin
Componentes
Concentracin inicial
a la 1 semana
NaCl (S)
15 30
22.5 45
Glucosa (%)
0.5
Inculo (%)
2.0

4a Actividad: Preparacin de las hortalizas


Estructura
Se utiliza un solo tipo de hortaliza para dos equipos. De un peso inicial de 1.5 Kg
se seleccionan los mejores ejemplares maduros y frescos. Pueden emplearse
chiles jalapeos, calabacitas, cebollas de cambray, etc. Las hortalizas se preparan
dependiendo de lo que requieran. A los chiles, calabacitas y cebollas se les cortan
los pednculos con un cuchillo; los nopales se hierven. Despus se lavan las
hortalizas en un escurridor de plstico. Para cada fermentador se utilizan 1.2 Kg
de hortalizas preparadas.

5a Actividad: Fermentacin y muestreo


Estructura
Se verifica la pureza del inculo de Lactobacillus plantarum por medio de la
observacin al microscopio de un frotis teido con la tcnica de Gram
(ANEXOS A y C), se adiciona el inculo (2% de 1500 ml) a la salmuera que est
en el vaso en una zona estril, utilizando una pipeta estril, se mezcla con un
agitador magntico. Las hortalizas (1.2 Kg) se acomodan en el interior del frasco
sin salmuera, se adicionan los 1500 ml de salmuera inoculada al frasco
fermentador sobre las hortalizas. Inmediatamente despus se toma una alcuota
de 15 ml con otra pipeta estril, en condiciones aspticas, la cual se van a
analizar el mismo da. Se debe anotar la fecha y hora del inicio de la
fermentacin.

Se corta un crculo de una pelcula de polietileno, cuyo permetro exceda


aproximadamente 10 cm al permetro del frasco. Con l se cubre la superficie del
lquido, tocndola y sin dejar burbujas de aire. Sobre el plstico se colocan de 8 a
10 canicas de vidrio, a fin de garantizar que sta no se levante con el gas que se
formar posteriormente. La superficie del lquido nunca debe quedar expuesta al
aire porque ah se formarn natas. Despus se tapa el frasco con la tapa de rosca,
sin apretar. Los fermentadores se mantienen a temperatura ambiente durante un
perodo de 2 semanas.
Se toma una muestra cada semana para lo cual se transporta el fermentador con
cuidado a una zona limpia; ah se abre el frasco, se retira la pelcula plstica y se
lava. Si se observa una nata superficial, sta se retira con una esptula limpia y se
realiza un frotis. Despus, se vaca la salmuera en una probeta de 2 litros para
medir el volumen y se regresa al vaso de 2 L. Se retira una alcuota de 15 ml con
una pipeta estril, para realizar los anlisis el mismo da. Posteriormente, se
vierten 250 ml de salmuera a una probeta de vidrio de esa capacidad, se
introduce un salmetro y se sigue el procedimiento indicado en el ANEXO C
para la medicin del grado salino. El contenido de esa probeta se regresa luego al
vaso de precipitados que contiene el resto de la salmuera.
Se aade la cantidad de sal calculada para incrementar el grado salino al valor
que le corresponda. La sal se mezcla con un agitador magntico y una parrilla
elctrica. Despus se regresa la salmuera al fermentador, y se colocan la pelcula
plstica limpia y las canicas recin lavadas en la superficie. Finalmente, se tapa
el frasco y se deja en reposo.

6a Actividad: Anlisis de la fermentacin


Estructura
Los siguientes anlisis se realizan en las muestras de 15 ml de salmuera el
mismo da de cada muestreo: observacin de la morfologa de los diversos
grupos microbianos con tincin de Gram de frotis elaborados de la salmuera y de
la nata superficial (si se form), medicin de pH y determinacin de acidez
titulable con NaOH 0.05N. Los anlisis se realizan de acuerdo a las tcnicas que
se presentan en el ANEXO C, pero considerando la acidez como cido lctico.

7a Actividad: Informe de resultados


Estructura
El informe debe constar de una cartula con los datos de la prctica y del equipo.
En la segunda pgina se escribe el objetivo de la prctica y la seccin de
Mtodos, en donde se indican las concentraciones de sal asignadas a cada equipo
que se reporta as como el vegetal que se someti. Tambin debe incluirse en esta
seccin cualquier actividad que haya sido realizada de manera diferente a lo
indicado en el protocolo. Despus vienen las secciones de Resultados, Discusin
y Conclusiones, los cuales se detallan ms adelante. Para terminar se incluye la
Bibliografa.
Cuadros de resultados
En cada cuadro se escribir el ttulo con el nmero correspondiente, los
parmetros que se presentan, el factor que se estudia, el microorganismo y el tipo
de medio. Cada fila y columna quedarn bien identificadas y con unidades.
Cuadros de resultados No. 1 y 2. Se cuentan los vegetales de cada
condicin de cultivo (S) que est reportando. Cada lote se clasifica en 3
categoras: buenos, regulares y malos, anotando el porcentaje correspondiente de
cada categora, con respecto al total del lote. Posteriormente se describe la
apariencia de los mismos (cambio de color, firmeza, etc.).
Cuadros de resultados No. 3 y 4. Anotar la morfologa microscpica de los
diversos grupos microbianos observados en las muestras de salmuera y las de
nata de cada fermentador. Tambin se mencionar en otra columna el orden de
abundancia de cada grupo microbiano. Presentar dibujos.
Cuadros de resultados No. 5 y 6. Para cada fermentador se presentan los
resultados de los anlisis fsicos y qumicos directos del fermentador: volmenes
medidos de salmuera; grado salino medido y grado salino ajustado (despus de
aadir la sal); alcuotas y gastos de la determinacin de acidez titulable en cada
muestra. Es importante no anotar en este cuadro ningn dato calculado.
Cuadro de resultados No. 7 y 8. Anotar los datos calculados para cada
muestra de los dos fermentadores con diferente nivel de sal: pH y acidez titulable
en dos tipos de unidades: a) concentracin de cido lctico en la salmuera, en %
(p/v), y b) acidez, en gAc.Lac./Kghort. Este valor se calcula considerando el peso del

cido lctico (g) que hay en el volumen total de la salmuera en el fermentador de


cada semana, dividiendo entre el peso inicial de las hortalizas (1.2 Kg).
Cuadro de resultados No.9. Anotar los resultados de la degustacin de sus
vegetales encurtidos en comparacin con productos comerciales.
Grficas
Utilizando los datos calculados de los Cuadros de resultados No. 7 y 8 se
realizarn las grficas indicadas en los siguientes incisos, con ayuda del
programa de computacin Excel, para graficar los datos. El formato ser de
dispersin x y, con puntos y lneas suavizadas, una grfica por pgina.
En cada figura se escribir el titulo con el nmero correspondiente, los
parmetros que se presentan, el factor que se estudia (S), el microorganismo y el
tipo de medio. Cada curva y coordenada quedar bien identificado y con
unidades.
Grficas por fermentador: En las Figuras 1 y 2 se presentan las grficas
de cada fermentacin. En la abcisas se indica el tiempo en das; y en las
ordenadas, el volumen de la salmuera, el pH y la relacin entre c. Lc./ Peso
Hort., en g/Kg.
Grfica de cido lctico: En la Figura 3 se presentan las curvas de la
relacin entre c. Lc./ Peso Hort., en g/Kg de los dos fermentadores, contra el
tiempo, en das.
Grficas de pH: De manera similar, en la Figura No. 4, se grafican los
datos de pH contra el tiempo de los dos fermentadores.
Parmetros de velocidad del proceso
Con los datos que corresponden a la acidez de la tropofase de cada cultivo,
Grfica 3 y los Cuadros de resultados No. 7 y 8, se calculan los valores de
productividad mxima y productividad total de cido lctico. Los datos
utilizados en los clculos, y los parmetros resultantes se escribirn en el Cuadro
No. 10 (Pc.Lac. = gc.Lac./KgHort.*h).
Discusin

De acuerdo a los resultados obtenidos en los Cuadros 1 y 2 se puede analizar


cual es el mejor S para ese vegetal, considerando sus caractersticas deseables
as como su porcentaje de conservacin.
Se analizan los resultados de los Cuadros No. 7 y 8 y de las Figs. 1 y 2 para
diferenciar las diferentes etapas en la fermentacin, identificando en qu fase se
presentan las mayores actividades de la fermentacin lctica y la deshidratacin
de las hortalizas.
Analizando las Figuras 3 y 4 y los parmetros cinticos del Cuadro ) se puede
determinar el efecto de la concentracin de sal en la velocidad y rendimiento del
cido lctico y en el cambio de pH. Al comparar estos datos con las
observaciones de los grupos microbianos predominantes (Cuadros 3 y 4), se
deber deducir y explicar la contribucin de cada uno de ellos en las distintas
etapas de la fermentacin, reforzando estos conceptos con la informacin de la
bibliografa.
Adems, se comparan todos los resultados experimentales con los de la
bibliografa.
Conclusin
Declare brevemente si se cumplieron los objetivos planteados al inicio de este
protocolo y los aspectos ms importantes aprendidos en esta prctica.

Bibliografa
Belatsouras, G.; Tsibri, A.; Dalles, T. y Doutsias, G. 1993. Effect of fermentation and its
control on the sensory characteristics of conservolea variety green olives. Appl. Environm.
Microbiol. 46 (1): 68-74.
Bergeret, G. 1970. Conservas vegetales. Frutas y hortalizas. 2a ed. Ed. Instituto del libro.
Montevideo, Uruguay. Capt. XI.
Carr, J.G. 1975. Lactic acid bacteria in beverages and food. Academic Press. London, England.
Chin, H.W. y Lindsay, R.C. 1993. Volatile sulfur compounds formed in disrupted tissues of
different cabbages cultivars. 58 (4): 835-841.

Escamilla-Hurtado, M.L.; Reyes-Dorantes, A. y Varela-Gutierrez, V. 1977. Proyecto para la


industrializacin de la tuna. Tesis de licenciatura. Fac. Qumica. UNAM. Mxico, D.F. pp. 93136.
Fernndez-Gonzlez, M.J.; Garca-Garca, P.; Garrido-Fernndez, A. y Durn-Quintana, M.C.
1993. Microflora of the aerobic preservation of directly brined green olives from hojiblanca
cultivar. 75: 226-233.
Fusselli, S.R.; Echeverria, M.C.; Casales, M.R.; Fritz, R.; Yeannes, M.N.; Gadaleta, L.B.;
Parin, M.A. y Zugarramurdi, A. 1992. Seleccin del proceso ptimo en la elaboracin de aj
(Capsicum annun) en vinagre. Alimentaria. 232: 57-61.
Hurts, A. y Collins-Thompson, D.L. 1979. Food as bacterial habitat. En Adv. of Microbial
Ecology. 3: 79-134.
Muller, G. 1981. Microbiologa de los alimentos vegetales. Ed. Acribia. Zaragoza, Espaa. pp.
75-89.
Pederson, C.S. 1979. Microbiology of food fermentations. 2nd. ed. AVI Pub. Co. Inc.,
Westport, Conn., USA. pp. 153-209.
Pederson, C.S. y Albury, M.N. 1969. The sauerkraut fermentation. Bulletin 824. New York
State Agricultural Experiment Station. Genova. Cornell Univ. N.Y., U.S.A.
Ruz-Barba, J.L. y Jimnez-Daz, R. 1994. Vitamin and aminoacid requirements of
Lactobacillus plantarum strains isolated from green olive fermentations. J. Appl. Bacteriol. 76:
350-355.
Weingberg, Z.G.; Ashbell, G.; Hen, Y. y Azieli, A. 1993. The effect of applaying lactic acid
bacteria at ensiling on the aerobic stability of silage. J. Appl. Bacteriol. 75: 512-518.

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