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5, 780-786, 2011
Artigo
OPTIMIZATION AND VALIDATION OF A METHOD USING MODIFIED QuEChERS AND LC-ESI-MS/MS FOR THE
DETERMINATION OF PESTICIDES IN ONION. An evaluation of the pesticides extraction from onion using a modern sample
preparation method (QuEChERS) and determination by liquid chromatography tandem mass spectrometry was carried out. All the
calibration curves showed r>0.99. The recoveries ranged between 61.8 and 120.0% with relative standard deviation lower than 20%
for all compounds. Due to the occurrence of matrix effect, the quantification was performed using matrix-matched calibration. The
limits of quantification of the method were between 0.0005 and 0.05 mg kg-1. The method shows the advantages of not require the
clean-up step and consume low volume of organic solvents, decreasing time, costs and residues.
Keywords: pesticides; QuEChERS; LC-ESI-MS/MS.
INTRODUO
A cebola (Allium cepa L) est entre os alimentos mais consumidos
no mundo. Devido s propriedades antioxidantes e anticancergenas,
considerada um alimento funcional, por consequncia da presena
de compostos bioativos, como as antocianinas e a quercetina em sua
composio.1-3
O maior produtor de cebola do mundo a China, responsvel por
cerca de 30% da produo mundial. Nessa mesma escala, o Brasil
est em 9 lugar, como o maior produtor da Amrica do Sul.4
No Brasil, a cebola ocupa a terceira posio em importncia
econmica, com plantio que se estende desde a regio Sul at a
regio Nordeste. No estado do Rio Grande do Sul, o municpio do
Rio Grande destaca-se com relao produo.5
A cultura da cebola, contudo, passvel de ser atacada por vrias
doenas de origem fngica, bacteriana, viral e nematolgica, as
quais podem ocorrer no campo, na ps-colheita, no transporte, no
armazenamento e na comercializao. Como consequncia dessa
vulnerabilidade, a produtividade da cebola decresce drasticamente,
podendo atingir at 100% de perda na produo de bulbos comercializveis.6,7
Embora o uso de agrotxicos seja necessrio para garantir bons
resultados de produtividade, o aumento da aplicao dos mesmos na
cultura de cebola8 fez com que, em 2008, fosse includa no Programa de Anlise de Resduos de Agrotxicos em Alimentos (PARA),
iniciado em 2001, pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
(ANVISA), com vistas a avaliar continuamente os nveis de resduos de agrotxicos presentes nos alimentos in natura que chegam
mesa do consumidor. Das 103 amostras de cebola analisadas, 2,91%
(3 amostras) foram consideradas insatisfatrias, em decorrncia,
exclusivamente, do uso de acefato, agrotxico no autorizado para
a cultura em estudo.9
Entre as dificuldades que envolvem as anlises de agrotxicos
*e-mail: eprimelfurg@gmail.com
PARTE EXPERIMENTAL
Escolha dos agrotxicos
Os agrotxicos foram selecionados a partir de entrevistas com
produtores de cebola dos municpios de So Jos do Norte e Rio
Grande, no estado do Rio Grande do Sul. Foram feitas perguntas a
respeito dos agrotxicos mais empregados na cultura de cebola, poca
de aplicao e a existncia de orientao para aplicao dos mesmos.
A partir dos dados obtidos, foi realizada uma pesquisa nas pginas
eletrnicas da ANVISA e do Ministrio da Agricultura, Pecuria e
Abastecimento (MAPA)33,34 a fim de identificar quais das substncias
mais empregadas so permitidas para a cultura de cebola e quais
poderiam ser determinadas no laboratrio. Os agrotxicos selecionados para o trabalho foram dimetoato, metalaxil-M, tebuconazol,
azoxistrobina e difenoconazol. A Figura 1S, material suplementar,
apresenta as estruturas qumicas dos agrotxicos estudados. A classe,
o grupo qumico, os limites mximos de resduos (LMR) e o intervalo
de segurana para agrotxicos aplicados no cultivo da cebola, na
regio de Rio Grande, assim como as propriedades fsico-qumicas
de cada substncia so apresentados nas Tabelas 1S e 2S, material
suplementar. O agrotxico dimetoato, apesar de no ter LMR estabelecido para a cultura de cebola pela ANVISA, foi escolhido por ter
o uso constantemente relatado nas entrevistas com os agricultores e,
tambm, por sua elevada toxicidade.
Instrumentao
Foi utilizado um cromatgrafo a lquido Alliance Separations
modelo 2695 Waters (Milford, MA, USA) equipado com amostrador
automtico, bomba quaternria, sistema de desgaseificao e coluna
analtica Waters XTerra MS C18 144 (50 3 mm, 3,5 m - Milford,
MA, USA), acoplado ao espectrmetro de massas Micromass Quatro
Micro API Waters, com fonte API, utilizando o modo de ionizao
por eletronebulizao e sistema de aquisio de dados via software
Masslynx 4.0 Waters.
Para o preparo das amostras de cebola, foi empregado um processador de alimentos, modelo Mega Master Plus RI 3170; Vrtex
modelo Certomat MV-B Braun (Bioteck Internacional, Alemmar Comercial e Industrial S.A.) e centrfuga de tubos microprocessada
modelo Quimis Q222T (Quimis Aparelhos Cientficos).
Reagentes
Os padres analticos dos agrotxicos dimetoato (pureza
99,4%), metalaxil-M (pureza 99,0%), tebuconazol (pureza
99,6%), azoxistrobina (pureza 97%), difenoconazol (pureza
99%) foram obtidos da Sigma-Aldrich (So Paulo, Brasil). O cido
frmico grau analtico (pureza 98%) foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha).
Acetonitrila, grau cromatogrfico, foi fornecida pela J.T. Baker
(Mallinckrodt, Phillisburg, NJ, USA) e a gua foi purificada em sistema Direct-Q UV3 (resistividade 18,2 M cm, Millipore, USA).
Sulfato de magnsio anidro e cloreto de sdio foram adquiridos da
J.T. Baker; bondesil-PSA (40 m) foi obtido da Varian (Palo Alto, CA,
USA).
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Rodrigues et al.
Quim. Nova
RESULTADOS E DISCUSSO
Validao do mtodo
O mtodo foi validado, avaliando-se os seguintes itens: curva
analtica, linearidade, limite de deteco (limit of detection, LOD),
limite de quantificao (limit of quantification, LOQ), exatido
(recuperao) e preciso (repetibilidade e preciso intermediria),
parmetros sugeridos pelo Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial (INMETRO) e pela ANVISA.36,37
Curva analtica e linearidade
A linearidade do instrumento e do mtodo foi avaliada pelas
curvas analticas atravs de padronizao externa no solvente e por
superposio da matriz com solues analticas nas concentraes
de 0,0005; 0,005; 0,05; 0,5 e 1,0 mg L-1.
Para padronizao externa por superposio da matriz, foram
preparadas solues analticas atravs de diluies da soluo padro de trabalho com o extrato da matriz. Os procedimentos foram
realizados com a matriz isenta de agrotxicos e a padronizao
externa no solvente foi estabelecida por diluies da soluo padro
de trabalho com metanol.
Cada soluo foi injetada trs vezes e os dados de regresso linear
foram obtidos com auxlio do software do equipamento.
Limites de deteco e quantificao
Os limites de deteco (LODm) e quantificao (LOQm) do mtodo foram obtidos pela injeo de solues analticas de diferentes
concentraes, preparadas atravs de diluies da soluo padro de
trabalho no extrato da matriz. O LODm e o LOQm para cada agrotxico foram estimados a partir da relao sinal/rudo, calculada pelo
software do equipamento, considerando, no mnimo, 3 e 10 vezes a
razo do sinal pela linha de base (rudo), respectivamente.
Exatido
A exatido do mtodo foi avaliada em funo dos ensaios de
recuperao, de acordo com as determinaes da ANVISA e do
International Conference Harmonisation.38 Amostras de cebola
(isentas de agrotxicos) foram fortificadas nos nveis de 0,0005;
0,005; 0,05 e 1,0 mg kg-1, a partir da adio de um volume conhecido de soluo padro de trabalho com a mistura dos agrotxicos
a 10,0 g de amostra.
Preciso
A preciso instrumental foi avaliada a partir de injees sucessivas
de soluo analtica padro, com a mistura dos agrotxicos (n=7),
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tR (min)
Dimetoato
230>125
230>199
Quantificao
Qualificao
20
10
16
20
1,00
Metalaxil-M
280>220
280>192
Quantificao
Qualificao
17
17
16
16
1,49
Tebuconazol
308>70
308>125
Quantificao
Qualificao
20
22
40
28
2,85
Azoxistrobina
404>372
404>329
Quantificao
Qualificao
20
30
20
15
2,56
Difenoconazol
406>251
406>337
Quantificao
Qualificao
31
20
31
32
5,20
Procedimento de extrao
Avaliao da influncia da etapa de purificao na exatido do
mtodo
De acordo com os resultados de recuperao (R%) apresentados
na Figura 2, possvel verificar que os valores de recuperao foram
similares para a maioria dos agrotxicos estudados com e sem a etapa
de purificao. Para o primeiro caso, recuperaes na faixa de 86,7
e 108,9% foram obtidas e, no segundo, as recuperaes ficaram na
faixa de 85,4 e 107,1%. Considerando que as possveis interferncias
da matriz so compensadas pelo emprego de padronizao externa
por superposio da mesma, neste trabalho foi estabelecido o desenvolvimento do processo sem a etapa de purificao, a fim de tornar
o procedimento de preparo da amostra ainda mais rpido e diminuir
o consumo de reagentes.
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Rodrigues et al.
Quim. Nova
QuEChERS
Amostra
Acetonitrila
Agitao
MgSO4
NaCl
Citrato de sdio
Hidrogenocitrato de sdio
Agitao
Padro interno
Agitao
Centrifugao
Alquota do extrato
PSA
MgSO4
Centrifugao
Determinao
Figura 4. Comparao entre as recuperaes dos agrotxicos por QuEChERS, nvel de fortificao 1,0 mg kg-1, empregando diferentes formas de
quantificao e efeito matriz para todos os agrotxicos. As barras de erro
significam CV(%) (n=9)
Original24
10,0 g
10,0 mL
60 s
4,0 g
1,0 g
_
_
60 s
tirfenilfosfato
30 s
5 min
5000 rpm
1,0 mL
25,0 mg
150,0 mg
1 min
6000 rpm
GC/MS
Exatido
Os processos mais utilizados para avaliar a exatido de um
mtodo analtico so: materiais de referncia, comparao de mtodos, ensaios de recuperao e adio de padro. Neste trabalho a
exatido foi avaliada por ensaios de recuperao.38 Para os ensaios
de recuperao, diferentes nveis de concentrao do analito foram
empregados, visto que a eficincia do mtodo pode variar em funo
da quantidade da substncia adicionada.
A literatura sobre validao de mtodos cromatogrficos indica
que os intervalos de recuperao aceitveis para a determinao de resduos devem estar entre 70 e 120%, com preciso de at 20%.38,40,43
Os valores de recuperao e de CV(%) so apresentados na Tabela
4. Os valores de recuperao variaram de 65,2 a 120,0%, com CV
variando entre 3,3 e 20,0% para a repetibilidade e de 61,8 a 116,7%,
com CV variando entre 2,0 e 20,0% para preciso intermediria em
todos os nveis de fortificao.
Validao do mtodo
Curva analtica e linearidade
Atravs dos dados obtidos para a construo das curvas analticas e anlise das equaes das retas no LC-ESI-MS/MS, possvel
concluir que o modelo de regresso linear adequado para as determinaes analticas em estudo. De acordo com a Tabela 3, os coeficientes de correlao (r) foram maiores que 0,99, estando de acordo
com as orientaes da ANVISA e do INMETRO, que recomendam,
respectivamente, r 0,99 e r 0,90. 36,37
Limites de deteco e de quantificao
Os LODm e LOQm dos mtodos foram de 0,016 e 0,05 mg kg-1
para o dimetoato; de 0,0016 e 0,005 mg kg-1 para o metalaxil-M e
de 0,00016 e 0,0005 mg kg-1 para difenoconazol, azoxistrobina e
tebuconazol.
Preciso
A preciso instrumental foi avaliada a partir de injees
sucessivas de soluo analtica padro na concentrao de
0,05mgL-1 (n=7). Os valores de CV(%) das reas de todas as
Dimetoato
y= 29306,7 x + 12,247
0,998
y= 7951,9 x + 3,59037
0,997
Metalaxil-M
y= 106839 x + 49,0445
0,993
y= 43794,5 x - 9,50831
0,998
Tebuconazol
y= 174947 x + 68,5335
0,999
y= 159082 x + 409,68
0,996
Azoxistrobina
y= 218045 x + 223,502
0,991
y= 124042 x + 19,2466
0,999
Difenoconazol
y= 130623 x + 17,9105
0,999
y= 124487 x + 183,681
0,997
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Tabela 4. Recuperao, CVr e CVpi para os agrotxicos em amostras de cebola fortificadas em diferentes nveis
Agrotxico
Dimetoato
Metalaxil-M
Tebuconazol
Azoxistrobina
Difenoconazol
Nvel de fortificao
(mg kg-1)
0,0005
0,005
0,05
1,0
0,0005
0,005
0,05
1,0
0,0005
0,005
0,05
1,0
0,0005
0,005
0,05
1,0
0,0005
0,005
0,05
1,0
Recuperao
(%)
92,3
85,3
97,6
81,4
107,1
107,0
86,1
98,7
100,1
65,2
109,8
87,4
91,8
115,2
120,0
104,1
105,3
CVr
(%)
6,9
7,3
19,4
6,4
9,7
7,2
9,0
3,6
7,9
20,0
10,4
9,0
11,0
12,7
11,1
3,3
9,8
Recuperao
(%)
116,7
111,3
93,8
96,3
93,0
96,8
61,8
103,8
110,3
86,7
83,3
90,7
89,6
108,2
75,4
108,5
114,1
CVpi
(%)
7,7
4,2
16,4
7,3
4,0
8,5
14,3
2,7
2,0
20,0
6,3
3,8
3,7
17,6
11,4
4,1
3,7
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Rodrigues et al.
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Material Suplementar
Tabela 1S. Classe, grupo qumico, limites mximos de resduos (LMR) e intervalo de segurana para agrotxicos aplicados no cultivo da cebola, na regio de
Rio Grande
Agrotxico
Classe
Grupo qumico
LMR
(mg kg-1) CODEX
LMR
(mg kg-1) ANVISA
Intervalo de segurana
(dias)
azoxistrobina
fungicida
estrobilurina
0,05
bentazona
herbicida
benzotiadiazinona
captana
fungicida
diocarboximida
10,0
deltametrina
inseticida/formicida
piretroide
0,03
dimetoato
inseticida
organofosforado
difenoconazol
fungicida
triazol
0,1
glifosato
herbicida
glicina substituda
iprodiona
fungicida
dicarboximida
0,2
1,0
14
linurom
herbicida
ureia
0,2
60
mancozebe
fungicida/acaricida
ditiocarbamato
0,2
metalaxil-M
fungicida
fenilamida
0,5
pendimetalina
herbicida
dinitroanilina
0,1
propinebe
fungicida
ditiocarbamato
0,5
1,0
tebuconazol
fungicida
triazol
0,1
14
trifluralina
herbicida
dinitroanilina
0,05
2,4-D
herbicida
cido fenoxiactico
*e-mail: eprimelfurg@gmail.com
S2
Rodrigues et al.
Quim. Nova
pka
log Kow
dimetoato
2,0
0,7
23,3
0,25 (25 C)
metalaxil-m
1,4
1,7
26,0
tebuconazol
3,7
0,036
3,3 (25 C)
-3
1,7 10 (20 C)
azoxistrobina
-0,67
2,5
0,06
-7
1,1 10 (20 C)
difenoconazol
3,0
1,1
0,015
3,3 10 (25 C)
-5
1. Tomlin, C. D. S.; The e-Pesticide Manual, 13 ed. Verso 3.0. Londres. 2003-2004. 2. Montes, R.; Rodrguez, I.; Ramil, M.; Rub, E.; Cela, L.; J. Chromatogr., A 2009, 1216, 5459.
th
S
CH3NHCOCH2S
OH3C
P(OCH3)2
CH3OCH2C
H2 OH
C C
C(CH3)
C
H2 H2C
Cl
DIMETOATO
TEBUCONAZOL N
CHCO2CH3
H3C
CH3
METALAXIL-M
N
N
O
CN
O
CH3O
AZOXISTROBINA
Cl
Cl
H2C
CO2CH3
DIFENOCONAZOL
N
N
CH3