OPERACIONES UNITARIAS

Objetivo final
El proceso bsico a utilizar en este caso es obtener un explante (es un tejido
vivo separado de su rgano propio y transferirlo a un medio artificial de
crecimiento) de el pin y ponerlo en un medio de cultivo rompiendo las
uniones intercelulares del tejido del explante donde obtendremos clulas
individuales, as podremos cultivar estas clulas y multiplicarlas para extraer el
aceite de las mismas
Materia prima
Para la produccin industrial del aceite de pin, inicialmente necesitamos las
semillas previamente secadas y despus de haber pasado por un proceso de
despulpado (retiro mecnico de la pulpa del fruto).
Podemos dividir el tratamiento de las semillas hasta la extraccin del aceite en
6 pasos:

1. DESINFECCION
Las semillas se someten a una desinfeccin inicial usado etanol, (alcohol
etlico, C2H5OH) este es un agente contra las formas vegetativas de las
bacterias, los hongos y los virus con envoltura lipdica, pero no contra las
esporas. Su accin sobre los virus sin envoltura lipdica es variable. Para
conseguir la mxima eficacia deben utilizarse en concentraciones acuosas de
aproximadamente un 70% (v/v): las concentraciones ms altas o ms bajas
pueden no tener tanto poder germicida. Una de las grandes ventajas de las
soluciones acuosas de etanol es que no dejan residuo alguno en las semillas
tratadas.
Una vez se realiza la desinfeccin
inicial las semillas deben ser
hidratadas a travs de un proceso
muy simple y econmico que
consiste en envolver las semillas en
papel mojado con agua destilada
(de preferencia un papel con una
alta capacidad absorbente) es
importante dejar las semillas en el
papel hasta que ste este seco por
lo que el tiempo oscilara entre 6 y
48 horas como mximo (teniendo
en cuenta las variables climticas el
tiempo podra ser mayor o menor
pero despus de 48 horas no es

recomendable
que
la
semilla
contine envuelta en el papel)
Una vez se termina el proceso de hidratacin la semilla debe ser sometida a
una desinfeccin ms profunda y para esto usamos hipoclorito de sodio al 3 %
El hipoclorito de sodio (NaOCl) es un compuesto oxidante de rpida accin
utilizado a gran escala para la desinfeccin de superficies, es letal para varios
microorganismos, virus y bacterias vegetativas Entre sus muchas propiedades
incluyen su amplia y rpida actividad antimicrobiana, relativa estabilidad, fcil
uso y bajo costo. Es muy importante que el reactor en donde se realice la
desinfeccin con hipoclorito sea de un material antioxidante pues el hipoclorito
es un potente oxidante y puede deteriorar con facilidad los equipos metlicos
sensibles a la oxidacin

2. EXTRACCION DE COTILEDON

Una vez tengamos la semilla

previamente desinfectada, con un
bistur retiramos las capas externas
de la semilla (tegumento) y luego la
piel hasta dejar expuesto el
cotiledn (este es un trabajo manual
relativamente complejo y requerir
de mano de obra calificada)

Del cotiledn cortaremos lminas de 1 x 2 milmetros estas sern el explante

para el cultivo, estas laminas deben ser tratadas con extremo cuidado y en
condiciones ptimas de asepsia adems para cada 100 ml de medio de cultivo
debemos tener entre 1 y 7 gramos de explante

3. MEDIO DE CULTIVO Y CONDICIONES DE LOS EQUIPOS

i.

Medio de cultivo

El medio de cultivo debe contener al menos NH4NH3, CaNO3, CuSO4, MnSO4,

ZnSO4, H3BO3, KH2PO4, Na2MoO4, EDTA, FeSO4, CaCl2, CaCO3, NaC6H7O7 (citrato de
sodio), MgSO4, K2SO4, tiamina, glicina, inositol, acido nicotnico, piridoxina,
biotina, glutamina, cido naftalenactico, zeatina y una fuente de carbono que
puede ser sacarosa, fructosa o glucosa.

Adems se puede seleccionar una hormona entre cido indoloactico,

naftalenactico o indolbutrico y otra entre kinesina, benciladenina, zeatina,
gibrelina.
Celulasa, pectinasa y hemicelulasa se aaden al medio de cultivo para que
rompan las uniones intercelulares del tejido de los explantes.
El pH del medio de cultivo debe estar entre 4.8 y 6.5.

Tabla tomada de Method for celular tissue multiplication from

Jatropha curcas

ii.

Condiciones de los equipos

Biorreactor

El medio de cultivo es incubado bajo

agitacin constante, a temperatura
ambiente y en la oscuridad durante
15 das.

Posteriormente se re-inocula a las

mismas condiciones durante otros
10 das.
Las condiciones ambientales de un
biorreactor
(flujo
de
gases,
temperatura, pH, oxgeno disuelto y

velocidad de agitacin), deben ser

controladas cuidadosamente.

La agitacin es importante debido a que facilita la transferencia de oxgeno, un

factor difcilmente alcanzable a condiciones ptimas, ya que este se disuelve
poco en agua y no es suficientemente abundante en el aire (20,8 %).
Adicionalmente, la agitacin es til a la hora de mezclar los nutrientes para as
mantener un medio homogneo. Sin embargo, uno de los principales
problemas en este tipo de procesos es el estrs de cizalla ocasionado por la
agitacin. Las clulas vegetales a diferencia de las clulas bacterianas son muy
sensibles a la tensin de cizallamiento ya que tienen gran volumen. Para
proporcionar un ambiente de cizallamiento suave se usan reactores con
sistemas de agitado por aire tipo airlift o columnas de burbujas, lo que a la vez
hace que haya un aumento de biomasa y del dimetro de las clulas.
La propagacin celular dentro del biorreactor puede afectar la esterilidad y
eficiencia del equipo. Para evitarlo, este debe ser fcil de limpiar, por esto los
bordes son redondeados

Sonificador

La mezcla entre el solvente y el

medio de cultivo se somete a la
sonicacin durante 90 minutos.

Centrifuga

La mezcla es centrifugada a 2500

rpm por 30 minutos.

Evaporador

4. PERIODO DE INCUBACION

Luego de pasar por la

centrfuga, resultan dos fases.
La fase superior, se separa y
se
transfiere
a
un
rotaevaporador a 70 C y a
180 rpm y posteriormente se
pone en una estufa durante 1
hora a 75C.

ptimas del entorno deben

ser bajo constante agitacin,
esto nos asegura que las
clulas no se depositaran en
el fondo de los reactores ya
que si estas se posan en el
fondo las condiciones de
anaerobiosis
pueden
ser
perjudiciales
para
el
crecimiento
celular.
La
temperatura ideal es
la
temperatura
ambiente
(aproximadamente entre 22 y
26 C) deben estar en
ausencia de luz, aunque la
incubacin tambin pueda
darse en condiciones de luz
con determinada longitud de
onda, como por ejemplo bajo
luz
infrarroja
que
ha
demostrado
acelerar
el
proceso
de
multiplicacin
celular.

Corte transversal de un
cotiledn a 48 horas de la
hidratacin

El periodo de incubacin debe

ser entre mnimo 3 das y
mximo 14, las condiciones

5. RE-INOCULACION

Una vez las uniones intercelulares del explante de pin se han roto
despus de por lo menos 3 das de incubacin en el medio de cultivo,
usamos esta fuente de clulas para re-inocularlas en un nuevo medio de
cultivo. Debemos repetir este proceso lo ms que nos sea posible para
posibilitar la multiplicacin de clulas individuales.

La cantidad ideal de clulas

individuales para iniciar la reinoculacin en un medio de
cultivo fresco es de 2x105
clulas
por
milmetro,
despus de esto debemos
incubar hasta que las clulas
entren en una fase de
multiplicacin
estacionaria,
Durante la fase estacionaria,
la
tasa
de
crecimiento
disminuye
como
consecuencia
del
agotamiento de nutrientes y

la acumulacin de productos
txicos. Esta fase se alcanza
cuando las clulas empiezan
a agotar los recursos que
estn disponibles para ellas.
Esta fase se caracteriza por

un
valor
constante
del
nmero de clulas a medida
que la tasa de crecimiento de
las clulas se iguala con la
tasa de muerte celular.

6. EXTRACCIN DEL ACEITE

Una vez se tenga una poblacin significativa de clulas incubadas se

aade hexano que es un solvente orgnico, (tambin pueden ser usados
el isopropanol y el etanol, su uso depende de la variedad en los costos
pues los 3 son aptos para el uso que se les va a dar) este rompe las
paredes celulares liberando el aceite. Despus de esto se somete a
sonicacin, (es el acto de aplicacin de la energa del sonido
-generalmente ultrasonidos- para agitar las partculas de una muestra) lo
que ayuda a la separacin de las clulas y el aceite.
Despus de esto se lleva a centrifugacin, de esta forma se hacen
visibles dos fases una superior y otra inferior, la superior contiene el
solvente y el aceite obtenido, y la inferior el restos de las clulas
cultivadas. Estos restos pueden ser reutilizados como abono orgnico
despus separamos las fases a travs de un filtrado simple.

Despus de esto pasamos la mezcla de solvente y aceite de pin al

evaporador y as los separamos por lo que podemos reutilizar el solvente
en futuras separaciones.
As llevamos el aceite a una zona de empacado y embarque para su
posterior distribucin.