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Gel
4 40 kDa
12 45 kDa
20%
10 70 kDa
12%
15 100 kDa
25 200 kDa
10%
15%
8%
PREPARO DO GEL
Verta o butanol;
Pipete o gel de entrada sobre o gel polimerizado e coloque o pente (15 poos);
Aguarde polimerizar;
SOLUES
(2)
Acrilamida ....................... 30 g
H2O destilada q.s.p.
Manter em geladeira (2-8C)
(3)
GEL DE ENTRADA
1 gel
2 gis
4 gis
470 l
940 l
1,88 ml
Acrilamida 30%
Bis-Acrilamida 1,6%
795 l
140 l
1,59 ml
280 l
3,18 ml
560 l
H2O destilada
APS 10%
TEMED
985 l
6,25 l
1,9 l
1,97 ml
12,5 l
3,75 l
3,94 ml
25 l
7,5 l
Obs.: Pipetar o APS e o Temed apenas na hora que for colocar o gel na placa, para que o gel
no polimerize antes do tempo.
SOLUES
TBS (2litros)
T-TBS
Diluir:
TBS 1 litro
Tween 500l
Manter em geladeira (2-8C)
(4)
GEL DE SEPARAO
1 gel
6%
8%
10%
12%
15%
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
2,0 ml
Acrilamida 30%
1,60 ml
2,12 ml
2,65 ml
3,18 ml
3,98 ml
Bis-Acrilamida 1,6%
0,78 ml
1,06 ml
1,33 ml
1,59 ml
1,99 ml
H2O destilada
3,62 ml
2,82 ml
2,03 ml
1,23 ml
30 l
APS 10%
50 l
50 l
50 l
50 l
50 l
TEMED
5 l
5 l
5 l
5 l
5 l
2 gis
6%
8%
10%
12%
15%
4,0 ml
4,0 ml
4,0 ml
4,0 ml
4,0 ml
Acrilamida 30%
3,2 ml
4,24 ml
5,30 ml
6,36 ml
7,96 ml
Bis-Acrilamida 1,6%
1,56 ml
2,12 ml
2,66 ml
3,18 ml
3,98 ml
H2O destilada
7,24 ml
5,64 ml
4,06 ml
2,46 ml
60 l
APS 10%
100 l
100 l
100 l
100 l
100 l
TEMED
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
4 gis
6%
8%
10%
12%
15%
8,0 ml
8,0 ml
8,0 ml
8,0 ml
8,0 ml
Acrilamida 30%
6,4 ml
8,48 ml
10,6 ml
12,72 ml
15,92 ml
Bis-Acrilamida 1,6%
3,12 ml
4,24 ml
5,32 ml
6,36 ml
7,96 ml
H2O destilada
14,48 ml
11,28 ml
8,12 ml
4,92 ml
120 l
APS 10%
200 l
200 l
200 l
200 l
200 l
TEMED
20 l
20 l
20 l
20 l
20 l
(5)
SOLUES
(6)
Corrida e Transferncia
CORRIDA
Obs.: Preste ateno na faixa azul da corrida. Quando ela chegar prxima base do gel, pare a
corrida!
TRANSFERNCIA
Membrana:
Gel:
8,5 cm x 6 cm;
direito;
Monte o sanduche.
da corrida.
Montagem do Sanduche:
Monte o sanduche:
Esponja - Blot paper (novo) gel membrana Blot paper (velho) - Esponja
Obs.: Ao mesmo tempo, pode ser feito a transferncia de protenas de 2 gis (1 de cada lado).
Ajuste os parmetros da transferncia:
2 gis: 75V 200 mA - 2 horas
(7)
Bloqueio e Anticorpo
ETAPAS
Dia seguinte
(8)
No seque a membrana!
Obs: Logo aps a revelao, a membrana pode ser estripada com kit para stripping com
sucesso para incubao com novo anticorpo.
Stripping
Assim que terminar a revelao:
Obs.: Aps o stripping, reiniciar o WB a partir do bloqueio com leite. Ou, guardar a
membrana em T-TBS na geladeira at o prximo dia.