Professional Documents
Culture Documents
GURUPI-TO
OUTUBRO/2014
_______________________________
1
SUMRIO
LISTA DE TABELAS ..................................................................................................... 3
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... 4
1 INTRODUO ............................................................................................................. 5
2 OBJETIVOS .................................................................................................................. 7
2.1 Objetivo geral ......................................................................................................... 7
2.2 Objetivos especficos .............................................................................................. 7
3
METODOLOGIA ..................................................................................................... 7
3.1 Obteno de extrato proteico .................................................................................. 7
3.1.1 Preparo do cultivo da fermentao em estado slido ....................................... 7
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.2
3.4
3.5
Dilise .............................................................................................................. 11
3.6
3.7
CONCLUSO ........................................................................................................ 21
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Volume do
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Curva de calibrao do pnitrofenol palmitato a partir dos valores obtidos pela
leitura de densidade ptica, com comprimento de onda de 405 m.
Figura 2- Curva de calibrao obtida pela relao entre as concentraes de
soroalbumina bovina e os valores de absorbncia lidos.
Figura 3 Cromatograma de interao hidrofbica, Absorbncia 280 nm(), Atividade
enzimtica (U/ml) (-), gradiente Triton X-100 (%)(-)
1 INTRODUO
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Produzir e purificar a enzima lipase atravs de mtodos tradicionais de
purificao de protenas.
2.2 Objetivos especficos
Obter o extrato protico da cultura de Candida viswanathii a partir da
fermentao em meio slido (farelo de trigo, bagao de cevada, azeite de oliva e meio
de Vogel) e liquido.
Construir a curva padro de protenas totais a partir do mtodo de Bradford,
plotando absorbncia versus concentrao da soluo da soroalbumina bovina
(1mg/mL), e atravs da regresso linear, determinar a equao da curva e o coeficiente
de correlao.
Construir a curva padro de
concentrao da soluo de
3 METODOLOGIA
3.1 Obteno de extrato proteico
3.1.1 Preparo do cultivo da fermentao em estado slido
colocou-se em uma proveta para medir o volume (21 ml), e depois distribuiu-se a
amostra em epperndorffs. Estes foram levados centrfuga em uma rotao de 8000 g
por 10 minutos a 4C, E por fim o sobrenadante foi recolhido e colocado em frascos
devidamente identificados, e levados para o congelador.
Tetraborato de Sdio saturado para cessar a reao. Analogamente aos outros tubos
foram analisados com a adio de 100L das amostras de cada tubo. No tubo B no
houve a adio da enzima. Realizou-se leitura da absorbncia a 410nm e espectrmetro.
Assim foi possvel calcular o coeficiente de absorbncia molar do pNPP a partir de:
= a*b*c Eq. (1)
Dessa maneira foram usadas as ABS para calcular a atividade enzimtica a partir
da equao abaixo:
Eq. (2)
3.5 Dilise
soluo de citrato de sdio 0,5 M e pH 5,5 e foi colocada em um Becker de 1000 mL.
As amostras devidamente numeradas com suas fraes especficas foram colocadas
dentro da membrana de dilise e logo aps foram mantida em um Becker contendo a
soluo tampo. Agitou-se lentamente por um determinado perodo, ocorrendo trocas da
soluo tampo a cada 3 horas. As membranas foram abertas de maneira extremamente
cuidadosa e o material dialisado foi coletado e seus devidos volumes registrados. O
material foi conservado em geladeira a temperatura em torno de 4C, at a determinao
da atividade enzimtica e quantificao de protenas.
O rendimento foi determinado pela razo entre a atividade enzimtica obtida aps
o mtodo de purificao e a atividade enzimtica da protena hipottica no extrato puro
ou da etapa anterior de purificao, a depender da quantidade de etapas que foram
realizadas.
Eq. (3)
12
Em que:
Eq. (4)
Eq. (5)
4 RESULTADO E DISCUSSO
4.1
13
-NPP (C1).
volume final da soluo (2000 L). Logo, pela frmula dada anteriormente, obtm-se os
valores das concentraes de -NPP apresentados na Tabela 1, assim como o os valores
das absorbncias e suas respectivas mdias, medidas em espectrofotmetro, com
comprimento de onda de 405 m.
14
Tubo
nitrofenol
Tampo
Tetraborato de sdio
p nitrofenol
Absorbncia
(mL)
(mL)
(mL)
(mg/mL)
(405 m)
0,000
1,000
1,000
0,001
0,181
0,020
0,980
1,000
0,0025
0,415
0,040
0,960
1,000
0,004
0,677
0,060
0,940
1,000
0,005
0,863
0,080
0,920
1,000
0,0065
1,118
0,100
0,900
1,000
0,008
1,365
0,120
0,880
1,000
0,010
1,692
0,140
0,860
1,000
0,0115
1,95
0,160
0,840
1,000
0,013
2,116
10
0,180
0,820
1,000
0,015
2,386
R2 = 0,9973
b = 0,0464
y = 160,77x + 0,0464
R = 0,9973
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,005
0,01
0,015
0,02
pNP (mg/ml)
Figura 1- Curva de calibrao do pnitrofenol palmitato a partir dos valores obtidos pela leitura de
densidade ptica, com comprimento de onda de 405 m.
15
Eq. (1)
Em que:
M-1 cm-1.
16
Tabela 2 Concentraes de soroalbumina bovina utilizadas e valores das respectivas leituras de absorbncia .
Reagente
Tubos
Soroalbumina
gua
de
[Protena]
Absorbncia
bovina (mL)
(mL)
Bradford
( g/mL)
(595 m)
(mL)
0,000
0,750
0,750
0,000
0,010
0,740
0,750
1,67
0,130
0,020
0,730
0,750
3,33
0,202
0,030
0,720
0,750
5,00
0,293
0,040
0,710
0,750
6,67
0,395
0,050
0,700
0,750
8,33
0,449
0,060
0,690
0,750
10,00
0,535
R2 = 0,9842
b=0
Abs 595 nm
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
12
SAB (ug/mL)
Figura 2- Curva de calibrao obtida pela relao entre as concentraes de soroalbumina bovina e os
valores de absorbncia lidos.
17
Eq. (7)
1,00
2,5
14
12
10
1,5
8
1,0
0,50
0,25
0,75
Atividade lipase (U/mL)
2,0
0,5
2
0,0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
0
50
0,00
Fraes (2 mL)
Figura 3 Cromatograma de interao hidrofbica, Absorbncia 280 nm(), Atividade enzimtica (U/ml)
(-), gradiente Triton X-100 (%)(-)
18
Dessa forma observou-se que a enzima estava depositada na frao 23-27 e 2934, e para confirmar foram feitas os teste de atividade enzimtica, o qual foi calculado
pela Equao (2), podendo ser observado na Tabela 3:
Tabela 3 Atividade enzimtica das fraes parciais aps a CIH
Absorbncia
Frao
(280nm)
Diluio
Atividade
Enzimtica (U/ml)
23
0,106
50
4,818182
24
0,164
50
7,454545
25
0,164
50
7,454545
26
0,087
50
3,954545
27
0,052
50
2,363636
29
0,046
50
2,090909
30
0,118
50
5,363636
31
0,299
50
13,59091
32
0,122
50
5,545455
33
0,497
20
9,036364
34
0,19
20
3,454545
Atividade
Protena
Atividade
Fator de
Rendimento
Amostra
total (U)
(mg)
especfica (U/mg)
purificao
(%)
Incio
355,932
6,184
57,559
1,00
100,0
Precipitado
113,222
4,211
26,888
0,47
31,8
Sobrenadante
39,215
5,095
7,696
0,13
11,0
57,666
2,246
25,678
0,45
50,9
64,839
2,807
23,097
0,40
57,3
Cromatografia
(24-27)
Cromatografia
(29-34)
19
Atividade
Protena
Atividade
Fator de
Rendimento
total (U)
(mg)
especfica (U/mg)
purificao
(%)
Incio
200,486
0,228
878,459
1,000
100
Precipitado
68,416
0,042
1640,571
1,868
17,48
Sobrenadante
322,925
0,155
2089,701
2,379
82,52
Amostra
Observou-se pela anlise dos rendimentos obtidos, que a fermentao solida teve
um bom rendimento, aps passar pelo processo cromatogrfico de interao
hidrofbica, sendo que a frao 24-27 teve um rendimento de 50,9% e a frao de 29-34
teve um rendimento de 57,3%. Com relao ao sobrenadante e o precipitado, tiverem
um baixo rendimento, cerca de 30 e 11%, respectivamente, o qual esses valores foram
obtidos antes da cromatografia. J o extrato lquido, precipitado e sobrenadante, obtido
pela fermentao submersa no passou pelo processo cromatogrfico e viu-se que o
rendimento foi muito alto, podendo afirmar que essa amostra ainda possui biomolculas
contaminantes.
20
5 CONCLUSO
Com base nos resultados obtidos e discutidos, pode-se concluir que os mesmos
se enquadram nos padres, em que a precipitao de lipase obtida a partir da
fermentao em estado slido e liquido alcana os melhores resultados de quantidade de
protena precipitada com fracionamento de 80% com atividade enzimtica de 57,666 U
para fraes 24-27, com rendimento de 50,9%, e de 64,839 U para as fraes de 29-34
com rendimento de 57,3%. Em geral, obteve-se essa baixa atividade e baixo
rendimento, devido erros experimentais e condies inadequadas de boas praticas de
produo de enzimas, a qual deve ser minuciosa, ter alto controle sobre os parmetros
de produo, como temperatura e pH, alm do baixo fluxo de tcnicos e pessoas
disponveis no recinto. O fator de purificao obtido reafirmam os problemas na
produo da enzima e a sua baixa atividade, sendo que eles ficaram em torno de 0,40.
Apesar desses resultados, obteve-se um alto aproveitamento com relao as
saberes das tcnicas de purificao, alm de se ter uma amplitude do funcionamento de
uma cromatografia e seus parmetros diante de sua utilizao em escala laboratorial e
posteriormente em escala industrial.
21
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
22
23