Nombre y apellido:

Turno de seminarios:
L.U. N:
Introduccin a la Biologa Molecular y Celular 2015. Primer parcial 23/05/13
P1:
/5

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/6

P3:
/10

P4:
/5

P5:
/15

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/15

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/4

Total
/60

Problema 1 (60 puntos).

El gen TFX de mamferos tiene 3 exones y codifica un factor de transcripcin del mismo nombre. El
factor TFX es una protena dimrica donde las dos subunidades estn unidas por uniones dbiles. La
transcripcin del gen TFX de ratn est regulada por un enhancer que es reconocido por otro factor de
transcripcin que se expresa en todos los tejidos del animal.
Los dominios de unin al DNA y de dimerizacin de la protena TFX estn codificados por secuencias
localizadas en el exn 1 de su gen. El exn 2 codifica el dominio de transactivacin. El exn 2 sufre
splicing alternativo y se incluye en el 50% de los mRNAs maduros de TFX fabricados en todos los
tejidos, excepto en pncreas donde su inclusin es nula.
Con el fin de expresar el factor de transcripcin TFX activo en pncreas se generaron ratones
transgnicos con una construccin del gen TFX de rata en la cual se le reemplaz su propio promotor y
enhancer por el promotor y enhancer del gen de la insulina, protena que se expresa slo en pncreas. El
gen TFX de rata tiene 4 exones en lugar de 3. En realidad, los exones 2, 3, 4 y sus intrones del gen de
rata tienen longitud idntica a la de los exones 1, 2, 3 y sus intrones, respectivamente, del gen de ratn.
Las porciones codificantes de protenas tienen secuencias idnticas. La nica diferencia en las regiones
homlogas de ambos genes es que el gen de rata tiene 2 bases cambiadas en el sitio aceptor de splicing
de su exn 3, que hace que su inclusin sea constitutiva (100%).
Cuando se analiz uno de los ratones transgnicos obtenidos se descubri que, por mera casualidad, el
transgn de rata se haba insertado en el mismo cromosoma, ro abajo del gen endgeno de ratn, pero
de manera invertida, tal cual se muestra en la Figura 1. Las molculas de RNA polimerasa II que parten
de cada promotor de la Figura 1 avanzan en sentido opuesto y terminan de transcribir en algn lugar
entre el gen endgeno y el transgn.
Se realizaron experimentos de Southern, Northern y Western con muestras de distintos rganos de
ratones normales (no transgnicos) y transgnicos. Para el Southern y para el Northern se us como
sonda una mezcla del exn 1 del gen de TFX de ratn (endgeno) y del exn 1 del gen TFX de rata
(transgn). Para el Western se us un anticuerpo contra la porcin proteica codificada por el exn 1 del
gen TFX de ratn, que como se explic ms arriba, es idntica a la codificada por el exn 2 del gen TFX
de rata.
Preguntas
1. (5 puntos) Ubique en los Southern, Northern y Western de la Figura 2 los polos positivo y negativo
de cada electroforesis, diga en no ms de 5 renglones, a qu polo migran las distintas macromolculas
de cada experimento y por qu razn migran a ese polo.
2. (6 puntos) El esquema de la Figura 1 corresponde a un segmento de DNA doble cadena del ratn
transgnico. Los expertos en bioinformtica llaman Watson a la hebra de arriba y Crick a la de
abajo. Sabiendo que la hebra Watson est orientada en el dibujo de 5 a 3, de izquierda a derecha,
identifique para el gen endgeno y para el transgn cul de los dos hebras (Watson o Crick) es la
que funciona como molde de la RNA polimerasa II. Justifique su respuesta.
3. (10 puntos) Teniendo en cuenta los sitios de insercin del transgn (marcados por flechas verticales
en la Figura 1), ubique las bandas y especifique la longitud del DNA en pares de bases que observara
en las 2 calles del Southern de la Figura 2. Justifique su respuesta y muestre los clculos.
4. (5 puntos) Por qu bast hacer el Southern con DNA genmico de hgado y no fue necesario hacerlo
tambin con DNA de otros tejidos?
5. (15 puntos) Sabiendo que en cerebro se expresa un micro RNA que se aparea con una secuencia
localizada en la regin 3 no codificante (3UTR) del mRNA de TFX y que dicho RNA inhibe totalmente
la traduccin del mRNA de TFX, pero no lo degrada, ubique las bandas y especifique la longitud del
RNA en bases que observara en las 6 calles del Northern de la Figura 2. Justifique su respuesta para
cada banda dibujada o ausencia de banda. Muestre los clculos.
6. (15 puntos) Teniendo en cuenta la accin del micro RNA mencionado y los datos al pie de la Figura 1,
ubique las bandas y especifique los pesos moleculares en kDa que observara en las 6 calles del
Western de la Figura 2. Justifique su respuesta para cada banda dibujada o ausencia de banda.
Justifique su respuesta y muestre los clculos.
7. (4 puntos) Si se inhibe la expresin de la ribonucleasa Xrn2 (torpedo), que degrada de 5 a 3 RNA
simple cadena carente de cap, las molculas de RNA polimerasa II que parten de cada promotor
chocan en el medio del segmento que separa a los dos genes. Por qu? Justifique.

1!

FIGURA 1
TRANSGN TFX DE RATA CON EL
ENHANCER DEL GEN DE LA INSULINA

GEN TFX DE RATN CON SU PROPIO

ENHANCER
Eco R1

Eco R1

Eco R1
Sitio de insercin
del transgn

990

700

E2

I2

E3

I1

TGA AATAAA
I

1500 480

!
3800

2500

700

990

480

E4

I3

E3

enhancer

1500 470 1100 140 200

I2

I1

E2

1900

!
400

E1

Longitudes del DNA expresadas en pares de bases (pb)!

Considere PM promedio de un aminocido = 100 Daltons!
No tenga en cuenta la cola de poli A en sus clculos!
Longitud 5 UTR del gen TFX de ratn: 150 pb!
Longitud 3UTR del gen TFX de ratn: 600 pb!

Western
(SDS, sin
mercaptoetanol)

Transgnico

Transgnico

Ce

origen de
siembra

Ce
re
H b r o
ga
d
P o
nc
re
a

Normal

Ce
re
H b r o
ga
d
P o
nc
re
a

origen de
siembra

re
H b r o
ga
d
P o
nc
re
as

Normal

re
H b r o
ga
d
P o
nc
re
as

Northern

Ce

No

origen de
siembra

rm
Tr al
an
sg
n
i co

Southern DNA
genmico de
hgado cortado
con EcoR1

FIGURA 2

! !

ATG

E1
Datos:
-

470

! !

560

promotor

promotor

TGA
I

enhancer

E3 AATAAA

I2

E2

ATG I1

E1

Sitio de insercin
del transgn

2!

Nombre y apellido:
Turno de seminarios:
L.U. N:
Introduccin a la Biologa Molecular y Celular 2015. Primer parcial 23/05/13
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/40

Problema 2 (40 puntos)

La DNA Polimerasa I (DNA Pol I) de Escherichia coli pertenece a una familia de DNA polimerasas que
incluye a las de los procariotas termfilos Thermus aquaticus y Pyrococcus furiosus. Se trata de enzimas
proteicas monomricas que comparten un tipo de organizacin que consiste en tres dominios
estructurales/funcionales:
Dominio NH2-terminal, con actividad de exonucleasa 5 3

Dominio medio, usualmente pero no siempre, con actividad exonucleasa 3 5

Dominio COOH-terminal, con actividad de polimerasa propiamente dicha
En un experimento in vitro, se usaron la DNA Pol I purificadas de E. coli, la de Thermus aquaticus (Taq) y
la de Pyrococcus furiosus (Pfu). La de E. coli tiene una actividad mxima a 37C y se despliega a
temperaturas mayores, alterndose mucho su estructura tridimensional. En cambio, las otras dos poseen
una estructura ms rgida que les confiere nula actividad a 37 C, resistencia a altas temperaturas y
actividad mxima a 72C.
Tambin se us una versin de DNA Pol I de E. coli, truncada en su porcin amino-terminal, conocida
como fragmento Klenow.
El siguiente esquema muestra las enzimas utilizadas con sus dominios funcionales:
DNA!Polimerasa!I!de!E.#coli

NH2

5*3
!
!exonucleasa

NH2

Fragmento!Klenow

3*5!
!
exonucleasa

polimerasa
!

COOH

3*5!
!
exonucleasa

polimerasa
!

COOH

Taq!DNA!Polimerasa

NH2

5*3!
!
exonucleasa

ninguna!
!
actividad

polimerasa
!

COOH

Pfu!DNA!Polimerasa

NH2

5*3!
!
exonucleasa

3*5!
!
exonucleasa

polimerasa

COOH

Estas enzimas fueron incubadas por separado y a dos temperaturas diferentes, en presencia de los
complejos de DNA que se muestran en la Figura 2, los cuatro dNTPs precursores (N = A, T, C o G) en
2+
un buffer con Mg

CASO%A
100!nt
3
3
5
20!nt

CASO%B
5

100!nt
3
5
20!nt 3

CASO%C
5

El!nucletido!en!posicin!
3!se!encuentra!
desapareado

3
5
10!nt

100!nt

5
3

!
nick

3!

Preguntas
1. (20 puntos) Sabiendo
- que la actividad exonucleasa 5 3 reconoce nicks y, ayudada por la actividad polimerasa, los
traslada (nick translation) reemplazando una hebra de DNA por otra, pero que es incapaz de degradar
hebras de DNA desde un extremo 5 que no forme parte de un nick;
- que la actividad polimerasa no puede iniciar la copia si el extremo OH 3 del primer se encuentra
desapareado del molde;
- que la exonucleasa 3 5 elimina un nucletido terminal con OH 3 libre desapareado del molde;
deduzca si habr o no sntesis de nuevo DNA en las siguientes situaciones:
Tipo de DNA
polimerasa
E. coli
Fragmento Klenow
Taq
Pfu

37C
CASO A

CASO B

72C
CASO C

CASO A

CASO B

CASO C

*
*
*

Llene los casilleros de la tabla con S o NO. En los casos que responda S, agregue adems la longitud en
nucletidos de la porcin de hebra sintetizada (el tramo nuevo, sin contar los nucletidos del primer).
Justifique en lugar aparte explicando con palabras y/o esquemas solamente para los 4 casilleros
marcados con asterisco (para todas las dems, con llenar la tabla es suficiente).
2. (4 puntos) Si se reemplazara el molde del caso A, por ejemplo, por una molcula de RNA, no habra
sntesis de DNA. Explique por qu y diga qu otro cambio debera usted realizar en el experimento para
que s haya sntesis de DNA.
3. (4 puntos) Ud esperara en algn caso sntesis de fragmentos de RNA complementarios al molde a 37
C si slo se reemplazara en la mezcla de incubacin la DNA polimerasa usada, por una RNA
polimerasa-DNA dependiente de E. coli? Por qu?
4. (5 puntos) Se fabricara DNA Pol I en una Escherichia coli en la que el gen de esta enzima tenga una
una delecin (eliminacin) de la porcin que va desde el nt +1 hasta el nt inmediatamente anterior (5) al
primer codn ATG?
5. (5 puntos) La Taq DNA Polimerasa no tiene ningn aminocido cisteina (Cys) mientras que la Pfu
DNA Polimerasa tiene 4. Sabiendo que ambas son monomricas y tienen el mismo peso molecular, a
qu se podr deber que la segunda sea ms compacta, y que por lo tanto corra ligeramente ms rpido
que la primera en una electroforesis en poliacrilamida con SDS? A qu pre-tratamiento sometera Ud. a
ambas en una nueva corrida para confirmar su hiptesis?
6. (2 puntos)Qu utilidad tienen en el laboratorio las DNA polimerasas Taq y Pfu?

4!