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Isolamento e identificao de

microorganismos

Patrcia Albuquerque de Andrade

Diversidade Microbiana

Microorganismos esto presentes em


comunidades nos mais diversos
ambientes

Anlises de Comunidades
microbianas
Menos de 1% de todas as espcies
de microorganismos existentes so
cultivveis
Desenvolvimento de tcnicas de
isolamento e caracterizao
Tcnicas de enriquecimento
A caracterizao aprofundada de um
organismos depende do seu cultivo
em culturas puras.

Isolamento e Identificao de
microorganismos

Isolamento
Tcnicas de assepsia
Cultura pura
Tcnicas de
enriquecimento
Coleta, transporte e
armazenamento das
amostras
Tcnicas de
isolamento
Seleo do meio de
cultura

Identificao
Caractersticas de
cultivo
Morfologia
Caractersticas
antignicas
Caractersticas
patognicas
Caractersticas
bioqumicas
Caractersticas
genticas

Tcnicas de Esterilidade ou
Assepsia

Conjunto de medidas para prevenir


contaminao durante a manipulao de
culturas e meios de cultura estreis

Fonte: Brock Biology of Microorganisms

Tcnicas de Esterilidade ou
Assepsia

Estabelecer uma rea de


trabalho
Remover tudo o que no
for necessrio
Limpar a rea de trabalho
com um desinfetante antes
de comear a trabalhar
Pipetas e garrafas devem
estar estreis
Organizar tudo o que voc
precisa (frascos, pipetas,
pipetador, etc)
Lavar as mos
Usar luvas e troc-las com
frequncia.

Adaptado de At the Bench: a laboratory navigator, Kathy Baker, 2005

Cmara de biossegurana (fluxo


laminar)

Luz UV
Filtro HEPA
Fluxo laminar

Coleta e Processamento da
Amostra

O sucesso da identificao depende de como


a amostra coletada, manuseada e
armazenada
Evitar contaminao
Uso de recipientes estreis
Tcnica de amostragem
Ex. Coleta de amostras da garganta e nasofaringe
no devem tocar a bochecha, a lngua ou saliva

Aps a coleta a amostra deve ser rapidamente


levada ao laboratrio e armazenada
apropriadamente (ex. Refrigerada)
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Cultura Pura

Uma cultura contendo um nico


microorganismo.

http://www.temple.edu/dentistry/adm
issions/course_descriptions.html

Brock Biology of Microorganisms,

Isolamento de Culturas Puras


Por que isolar/identificar um
microorganismo ?
Que tipo de organismo voc pretende
isolar?

Definir a estratgia de isolamento


Definir que tipo de meio de cultura

Tcnicas de Isolamento

Plaqueamento de Culturas
Semeadura em superfcie

Semeadura em profundidade

Adaptado de Brock Biology of Microorganisms

Plaqueamento de Culturas

Semeadura por esgotamento:


obteno de colnias isoladas

Seleo do meio de cultura

Fatores que influenciam a escolha do meio


de cultura
A origem do material a ser analisado
A espcie que se imagina estar presente na
amostra
As necessidades nutricionais dos organismos

Identificao de uma populao mista:


Semeadura em diversos meios e condies para
obteno do crescimento da maior parte das
espcies contidas na amostra.

Meios Seletivos/Diferenciais
Staphylococcus. aureus
No inoculado

Salmonella

Staphylococcus epidermidis

Serratia marcescens

E. colic
E. coli
gar Verde Brilhate contendo lactose,
sacarose e indicador de pH

Meio MSA (Mannitol


Salt Agar)
Fermentao de
manitol

gar MacConkey
(fermentao de
lactose)

http://www.microbelibrary.org

Meios enriquecidos
gar chocolate: contm sangue
cozido. Usado para o
isolamento de N. gonorrhoeae.

Placa de gar sangue:


contendo bactrias da
garganta humana
Meio enriquecido/diferencial
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Meios Para Fungos


uma mistura simples contendo
glicose, uma fonte de nitrognio
inorgnico ou orgnico e alguns
minerais.
Em geral esses meios tm uma
concentrao maior de acar (4%) e
um pH menor (3,8 a 5,6)
Uso de antibiticos para inibir
crescimento bacteriano
Ex. Sabouraud, YPD

Meios para crescimento de Fungos

Meio gar sangue


Histoplasma capsulatum

Meio Sabouraud fungos ambientais

Meio YPD (yeast peptone dextrose)


Saccharomyces cerevisiae
(True and Lindquist, Nature 407, 477-483

Identificao de Microorganismos

Como identificar espcimes desconhecidos?


Por qu?
Principais mtodos :
Caractersticas de cultivo
Caractersticas morfolgicas
Caractersticas antignicas
Caractersticas patognicas
Caractersticas bioqumicas
Caractersticas genticas

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Identificao de Bactrias

Organimos so
identicados atravs
de chaves
dicotmicas
Anlise dos
resultados de vrios
testes
Normalmente feitos
simultaneamente

Caractersticas de Cultivo

Plaqueamento
Crescimento em meios enriquecidos,
seletivos, diferenciais, etc
Aerobiose, anaerobiose,
pH, temperatura
Crescimento rpido/lento
Floculao

Mtodos morfolgicos

Observao da morfologia da Colnia


Textura, forma, pigmentao, velocidade de
crescimento, crescimento em meio lquido.

Observao ao microscpio

Morfologia da clula,
Tamanho
colorao simples ou diferencial
Presena de determinadas estruturas
(grnulos de armazenamento, endosporos,
cpsula, flagelo, etc).
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Morfologia da colnia

Imagens da pgina
microbelibrary.org

Mtodos Microscpicos
Microscopia
Microscopia de luz
Microscopia eletrnica
De campo escuro
De contraste de fase
Fluorescncia
Confocal
Mtodos de colorao
Colorao simples;
Colorao diferencial
(Gram,
colorao lcool cido resistente)
Colorao especial (colorao
negativa, para esporos, ou para
flagelos)

Caractersticas Morfolgicas
Morfologia microscpica
Tamanho e forma
Rapidamente feita ao
microscpio (com ou sem
colorao)
Pode determinar se
amostra de procariotos,
fungos ou protozorios
Muitas vezes suficiente
para diagnstico clnico

Morfologia Microscpica
Agregados celulares
As clulas se aderem aps a diviso
binria formando arranjos especficos

Morfologia Microscpica
Colorao diferencial
Colorao de Gram
gram-positivas e gram
negativas
Limita a identidade de um
microorganismo
Insuficiente para
identificao
isoladamente
Ex. E. coli and Salmonella so
semelhantes aps a colorao

Colorao de Gram

Morfologia Microscpica

Corantes especiais
Nanquim para cpsula
Ex. Cryptococcus neoformans

Colorao cido rpida cidos


graxos
Ex. Mycobacterium

Testes Bioqumicos

Crescimento em meios diferencias: na presena


de um determinado substrato e testado para a
produo de um determinado produto
Fermentao de carboidratos, produo de cido
ou gs e hidrlise de gelatina, albumina ou amido
Em laboratrios de anlises clnicas comum o
uso de kits miniaturizados que podem detectar
mltiplas caractersticas

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Fermentao de
Carboidratos

fermentao observada
pela formao de cido
(mudana de cor do meio)
e produo de gs (bolha)

Tubo

de ensaio contendo
um tubo de Durham para
coletar as bolhas de gs

Amostras:

1. Controle no inoculado

2. Amostra positiva para


cido e gs
3. Amostra positiva para
crescimento, mas sem
formao de gs ou
cido.
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Testes Rpidos

positive
negative

ONPG ( galactosidase); ADH (arginine dihydrolase); LDC (lysine decarboxylase); ODC


(ornithine decarboxylase); CIT (citrate utilization); H2S (hydrogen disulphide production);
URE (urease); TDA ( tryptophan deaminase); IND (indole production);VP (Voges Proskauer
test for acetoin); GEL ( gelatin liquefaction); the fermentation of glucose (GLU), mannitol
(MAN), inositol (INO), sorbitol (SOR), rhamnose (RHA), sucrose (SAC); Melibiose (MEL),
amygdalin (AMY), and arabinose (ARA); and OXI (oxidase).

Diagnstico sem cultura?

Alguns patgenos
No podem ser isolados
Crescem muito devagar
Isolamento pode ser demorado ou
impossvel

Testes Imunolgicos
Interao de um antgeno microbiano com
um anticorpo
Testar a presena de um antgeno pode ser
mais fcil do que testar a presena do
microorganismo
Existem kits de laboratrio para a
identificao de diversos microorganismos
.

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Sorologia
Protenas e polisacardeos podem
funcionar como identificadores
Cpsula, glicoclice, flagelo, pili

Reao antgeno-anticorpos
Ex. Deteco rpida de Streptococcus pyogenes

Sorologia
Combina-se um
antisoro conhecido
com um
microorganismos
desconhecido
Exemplos:

Aglutinao em
lmina
ELISA

Uso: HIV, sfilis,


Chagas, sarampo,
hepatite

Mtodos Genotpicos
Anlises do material gntico de
microorganimos revolucionou a
identificao e classificao de
microorganismos
Incluem:

Amplificao de material gentico por PCR


(RT-PCR, RAPD-PCR),
Tcnicas de hibridao
Digesto com enzimas de restrio (RFLP)

Em alguns casos a nica maneira de


identificar-se um microorganismo
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Sumrio
O isolamento e identificao de
microorganismos requer o uso
sistemtico de diversas tcnicas
microbiolgicas, bioqumicas e
genticas
Importncia no estudo de
microorganismos ambientais, indstria
farmacutica, e de alimentos e no
tratamento de doenas infecciosas.