UNIVERSIDAD ARTURO PRAT

MICROBIOLOGIA

"MEDIOS DE CULTIVO, MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO".

MEDIOS DE CULTIVO.
La introduccin y posterior perfeccionamiento de los medios de cultivo en
Bacteriologa corresponden a uno de los hechos fundamentales en la microbiologa, pues
permite el aislamiento, anlisis y tipificacin de las bacterias.
Un medio de cultivo se define como todo substrato estril que contiene elementos
nutritivos necesarios para la multiplicacin bacteriana, ajustado a una presin osmtica y un
pH determinado, adecuado para el tipo de bacteria que se desea estudiar.
En general, los medios de cultivo, desde el punto de vista fsico pueden clasificarse en
dos: Lquidos y Slidos. El crecimiento bacteriano en los medios de cultivos lquidos se
manifiesta generalmente por el aumento en la turbidez del medio. En tanto que en los medios
slidos se manifiesta por la formacin de colonias macroscpicas, las cuales son el resultado
de la multiplicacin de una sola clula bacteriana.
Existen diferentes medios de cultivos de acuerdo al empleo que se les d en
laboratorio, dentro de los cuales se puede mencionar los siguientes:
Medio de cultivo "base": Se caracterizan por ser mnimos en material nutritivo, de manera
que como tal su uso es muy restringido, sin embargo, constituyen la base para la preparacin
de otros medios. Por ejemplo: Caldo peptonado y el Agar-Agar corriente.
Medio de cultivo mejorado: En general, son los mismos medios de cultivo bsico a los cuales
se les agrega una sustancia enriquecedora, tal como sangre, suero. El uso de estos medios es
universal y est orientado especialmente a obtener el buen desarrollo de cualquier tipo de
bacteria, con ciertas excepciones de especies que requieren de medios de cultivos y/o
ambientes muy especiales. Por esta razn se utiliza frecuentemente en el aislamiento
bacteriano, ya sea a partir de otros tipos de cultivos o de productos patolgicos. Los ms
usados son: Agar tripticasa, Agar tripticasa Sangre, Caldo Tripticasa, Agar Chocolate, Medio
de cultivo de Mueller-Hilton, Medio Lquido de Todd-Hewitt, etc.
Medio selectivo: Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento
de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. Estos medios tienen
aplicacin en el diagnstico bacteriolgico, donde el problema corriente consiste en aislar un
germen de un producto que contiene numerosas otras especies bacterianas, a menudo sin
importancia etiolgica y que en medios mejorados creceran en forma tal que impediran el
aislamiento del agente causal, lo que es uno de los objetivos principales del diagnstico
bacteriolgico. Se incluyen en este grupo: Agar cristal-violeta, para el aislamiento de bacterias
Gram (-). El agar Telurito de Potasio para el aislamiento de bacterias Gram (+).
Medio de cultivo diferenciales: Se emplea para demostrar algunas propiedades bioqumicas
de la bacteria como: degradacin de hidratos de carbono, protenas, hidrlisis de urea, etc.,
propiedades que facilitan la identificacin de ellas. Como se trata de fenmenos metablicos
que tienden a la identificacin de las especies, el estudio en estos medios debe realizarse
empleando cepas bacterianas puras. Medios de este tipo son numerosos, de uso preferencial
MICROBIOLOGA: PRACTICO 2.

UNIVERSIDAD ARTURO PRAT

MICROBIOLOGIA

en la identificacin de bacilos Gram negativos, ya que, ellos no tienen caractersticas muy

distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso ms frecuente se encuentran:
-

Agar Fierro triple - Azcar (Agar TSI): empleado en el estudio de la fermentacin de la

glucosa, lactosa, sacarosa y adems de la produccin de SH2.

Agar SIM: empleado en el estudio de la produccin de SH 2, del indol y movilidad

bacteriana.

Caldo Glucosa Fosfatado: empleado para la identificacin del acetil-metil-carbinol, en la

prueba de Voges/Proskauer o el rojo de metilo respectivamente.

Agar Citrato de Sodio o Medio Simmons: empleado para el estudio de la utilizacin del
citrato de sodio como nica fuente de carbono.

Agar Fenilalanina: estudio de la desaminacin oxidativa de este aminocido a

pentadiamina.

Caldo Urea: investigacin de la hidrlisis de la urea.

Medio selectivo diferencial: Son medios selectivos a los cuales se les ha adicionado un
substrato, generalmente un azcar. Esto es para demostrar la actividad fermentativa de la
bacteria sobre esta sustancia, esta se revela por el cambio de color de un individuo que lleva
incorporado el medio. Existe una gran cantidad de medios de este tipo. Entre los ms
comunes se encuentran:
-

Agar Levine, Agar MacConkey: selectivos para el aislamiento de grmenes Gram

negativos intestinales.

Agar SS: selectivo para el aislamiento de especies intestinales de los Gneros Salmonella
y Shigella principalmente.

Medios especiales: Son medios formulados especialmente para el fcil aislamiento de

bacterias especficas. Por ejemplo: para el aislamiento de Staphylococcus medio Agar Manita
de Cloruro de Sodio (Chapman).
Medios para grmenes anaerobios: Pueden utilizarse los mismos medios para los grmenes
aerbicos, pero adicionndoles una sustancia reductora para mantener el ambiente anaerbico,
glutamato, cistena y principalmente tioglicolato de sodio, o tambin encubando los medios
en ambiente libre de oxgeno.
MTODOS DE SIEMBRA.
La mayora de las bacterias, debido a su rpida multiplicacin, deben ser transferidas
constantemente de un medio de cultivo a otro, con el fin de mantener su viabilidad y vitalidad.
La modalidad de siembra ms frecuente en la prctica es la siembra en superficies de placas
petri, existiendo diferentes mtodos para su realizacin.

MICROBIOLOGA: PRACTICO 2.

UNIVERSIDAD ARTURO PRAT

MICROBIOLOGIA

Un procedimiento consiste en depositar un inoculo sobre el agar, en la placa y con una

pipeta Pasteur acodada diseminarla en trazos por toda la superficie del medio de cultivo con el
objeto de agotar el inoculo en el instrumento de siembra y obtener as colonias bacterianas
perfectamente aisladas. Este procedimiento se emplea generalmente cuando se siembran
productos multi-microbianos. El mismo resultado se puede conseguir utilizando la
diseminacin con una asa de platino.
AISLAMIENTO BACTERIANO.
Se entiende por aislamiento bacteriano la separacin de cultivos puros de la mezcla de
bacterias que se encuentran en substratos a estudiar: aguas, tejidos, alimentos. Constituye por
lo tanto una etapa fundamental en el aislamiento de las cuales los usados son:
-

Aislamiento por diseminacin de superficie: se realiza empleando un medio de cultivo

adecuado y haciendo uso de la tcnica de siembra antes descrita.

Aislamiento por dilucin en placas: Esta tcnica consiste en depositar en una placa petri
estril un volumen y una dilucin determinada del producto en estudio y luego agregar a
la placa el contenido de un tubo de agar nutritivo fundido y enfriado a 45C.
Homogeneizar por rotacin suave y dejar solidificar. El aislamiento se lograr a nivel de
la superficie del medio de cultivo; Si se quiere efectuar un recuento de colonias, entonces
habr que contar las desarrolladas en superficie y las desarrolladas en profundidad.

Aunque se logra la separacin de bacterias en mezcla por medio de esta tcnica, su

uso est ms bien destinada a contar el nmero de microorganismos presentes en un material
determinado (e. g.: agua, leche) utilizando diluciones apropiadas del material que contiene las
bacterias en suspensin.
OBJETIVOS:
-

Demostracin de las tcnicas de siembra y caractersticas de algunas colonias bacterianas.

Siembra por aislamiento de microorganismos en mezcla.

Por diseminacin en superficie.
En medios selectivos.

Siembra en medios diferenciales para el estudio de las propiedades bioqumicas.

ACTIVIDADES
1. El instructor demostrar las diferentes tcnicas de siembra en el laboratorio para el
aislamiento e identificacin bacteriana. Adems mostrar las caractersticas principales de
algunas colonias bacterianas, con relacin a su forma, tamao, aspecto superficial,
pigmentacin, etc.
2. Siembra y Aislamiento de algunos Microorganismos en Mezcla.

MICROBIOLOGA: PRACTICO 2.

UNIVERSIDAD ARTURO PRAT

MICROBIOLOGIA

Cada grupo de alumnos recibirn un tubo conteniendo una mezcla de dos especies de
bacterias (una cepa de Gram positiva y otra de Gram negativa). A partir de esta muestra, se
proceder a sembrar una pequea cantidad en un asa o una gota con pipeta Pasteur en una
placa con agar MacConkey, con el objeto de aislar y estudiar las caractersticas de la colonia
de las especies Gram negativas en este medio de cultivo selectivo. Adems, se har lo mismo
pero en placas con medio de cultivo Chapman (agar de manita de cloruro de sodio), con el
propsito de aislar la especie Gram positiva. Encubar estas placas a 37 C. durante 24 horas.

MICROBIOLOGA: PRACTICO 2.