Seminrio Teste Elisa

1. Definio
Os mtodos imunolgicos desenvolvidos para quantificar a concentrao de
antgenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e
especificidade, tornaram-se tcnicas padronizadas para pesquisa e
aplicaes clnicas. Entre esses mtodos, um dos mais usados o ELISA,
do ingls Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio de Imunoabsoro
Ligado a Enzima).
O Elisa se baseia na identificao de anticorpos e ou antgenos, por
anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age
sobre um substrato e a reao faz com que o cromgeno (microrganismo
que produz colorao no meio onde se encontra) mude de cor. O produto
da reao, alm de colorido, insolvel para no difundir do local da
formao. Foi inicialmente desenvolvido por Engvall & Perlman e por van
Weeman & Schuurs e, posteriormente, muito utilizado como teste
diagnstico em varias doenas.
2. O teste
Quando o sistema imunolgico do corpo encontra um antgeno
especfico (por exemplo, uma protena caracterstica na superfcie de um
vrus ou bactria), os anticorpos que so especficos para o antgeno
interceptam-no com uma ligao fsica a ele em uma "chave e
fechadura", neutralizando assim o antgeno. O ELISA uma tcnica
fundamental para avaliaes imunolgicas e bioqumicas, utilizada para
detectar o antgeno ou anticorpo em uma amostra, com base em
interaes anticorpo-antgeno. Se um antgeno (ou da mesma forma, um
anticorpo) detectada, um sinal produzido na forma de uma mudana
mensurvel.
Para avaliar a presena de um antgeno especfico, em uma amostra,
um "teste de ELISA" pode ser realizado da seguinte maneira: Uma
soluo de anticorpo, que especfico (isto , tem reconhecimento
exclusivo) ao antgeno putativo, imobilizado em uma superfcie slida
em um poo de uma placa de microtitulao. aplicado em seguida
amostra a ser analisada condies que permitam o antgeno ligar-se aos
anticorpos imobilizados especficos. O material no ligado lavado, e o
antgeno ligado reconhecida mais uma vez em condies de ligao
com a adio de uma soluo de um segundo anticorpo especfico para
o mesmo antgeno, que desta vez acoplado ou ligados a uma enzima
que catalisa a converso de seu substrato a uma forma detectveis e
possivelmente quantificvel.
Esses anticorpos ligados a uma enzima que esto vinculados ao
complexo antgeno-anticorpo imobilizado so resistentes a ciclos de
lavagem e, finalmente, o substrato adicionado e incubado de modo
que a enzima pode catalisar a converso do substrato para o sinal de
deteco do antgeno especfico . ELISAs costumam empregar qualquer
um substrato cromognico ou um fluorognico, que produz uma cor ou

fluorescncia, respectivamente, aps a converso pela enzima ligada ao

segundo anticorpo.
Converso do substrato convenientemente observada ou quantificada
em um leitor de placas, por medidas de densidade ptica ou intensidade
de fluorescncia.
Em resumo, mudar a cor ou a fluorescncia sinaliza a atividade da
enzima, que sinaliza a presena do segundo anticorpo, que sinaliza a
presena do antgeno procurado.
3. Interpretao
A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato proporcional a
quantidade de anticorpos (especficos para o antgeno) presente no
soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotmetro
(Leitores de Elisa), permitindo uma anlise quantitativa.
4. Equipamentos
a) Placa de Elisa
Onde a reao desenvolvida. So microplacas contendo vrios
poos (wells) onde so depositados os reagentes.
b) Pipetas Automticas
Depositar os reagentes
c) Leitor de Elisa
Permite uma anlise quantitativa precisa dos resultados
(espectrofotmetro)
d) Lavador Automtico de Placas
5. Enzimas
So elas que convertem um substrato sem cor em um produto de cor. A
enzima mais comumente utilizada neste teste a peroxidase, que
catalisa a reao de desdobramento da gua oxigenada (H2O2) em
H2O mais O2.
6. Tipos de Elisa

Indireto

O mtodo indireto utilizado para deteco de anticorpos. Neste caso o

antgeno fica aderido aos poos da microplaca. Em seguida coloca-se o soro
problema e em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage
com o substrato fazendo com que o cromgeno mude de cor. A presena de
cor nos poos indica a presena do anticorpo, e os poos que no mudarem
de cor indica a ausncia do anticorpo em questo.

Existem vrios modelos de testes de ELISA; em sua forma mais

simples,chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido
(placa de ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em
teste ( ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno. Se
houver anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao
antgeno-anticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um
segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se
busca detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada
peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado
enzima
denomina-se
conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto ,
H2O2 dissolvida em uma substancia qumica que d uma reao colorida
quando H2O2 desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a reao
antgeno-anticorpo apresentam uma colorao (varivel dependendo do
substrato).

Direto ou sanduche
O mtodo de sanduche, ou captura, indicado para identificao de
antgenos, e este antgeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo
primrio especfico ao antgeno adsorvido no poo da microplaca. Em
seguida o antgeno na soluo problema adicionado. Depois o segundo
anticorpo especfico ao antgeno marcado com uma enzima adicionado.
Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromgeno mude
de cor. A presena de cor nos poos indica a presena do antgeno, e os poos
que no mudarem de cor indica a ausncia do antgeno em questo.
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUCHE. Nesse
mtodo, o anticorpo de um antgeno particular , inicialmente, adsorvido no
well. Depois, o antgeno (soro, urina ou outra soluo contendo o antgeno)
adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente
anticorpo ligado enzima adicionado. Nesse caso, a intensidade da reao
proporcional quantidade de antgeno presente. Logo, permite mensurar at
pequenas quantidades de antgeno.

Competitivo
O mtodo competitivo mais usado para identificao de antgenos, mas pode
tambm ser empregado para a deteco de anticorpos. Neste mtodo primeiro
se adsorve o anticorpo no poo da micro placa. Aps a adsoro do anticorpo,
uma soluo que possivelmente contm o antgeno adicionada sobre os
anticorpos adsorvidos. O prximo passo adicionar o antgeno marcado com
uma enzima. Os poos que no possuem o antgeno primrio (da soluo
problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto que os poos que
possuem antgenos aderidos aos anticorpos no mudam de cor.

7. Curva Padro
Em geral, faz-se uma CURVA PADRO, preenchendo 8 poos de uma fileira
com concentraes crescentes e conhecidas de antgeno. A curva serve como
padro de comparao para deduzir as quantidades de antgenos nas
solues-testes. O grfico fornecido por um programa prprio para a leitura
de ELISA.

8. Diagnstico por ELISA

Dermatoses bolhosas autoimunes so doenas cuja manifestao cutnea
primria e fundamental consiste em vesculas e bolhas. Classificam-se
conforme a localizao da bolha, em intraepidrmica e subepidrmica. Os
pacientes produzem autoanticorpos contra estruturas especficas da pele
detectveis por tcnicas de imunofluorescncia, immunobloting e Elisa. Os
recentes avanos da biologia molecular e celular tm permitido conhecer
esses autoantgenos, contra os quais os pacientes se sensibilizam e que
esto localizadosna epiderme ou na juno dermoepidrmica. So doenas
de baixa incidncia, porm de elevada morbidade e por vezes letais. O
objetivo deste trabalho revisar e descrever os progressos nos
conhecimentos de quatro doenas vsico-bolhosas autoimunes: pnfigo
foliceo endmico (fogo selvagem), pnfigo vulgar, penfigide bolhoso e
dermatite herpetiforme.

Fogo Selvagem
FS uma doena autoimune de causa desconhecida, provocada por autoanticorpos patognicos antiepiteliais e responsveis pelo fenmeno da acantlise.
Os auto-anticorpos so do tipo imunoglobulina G (IgG), predominando o subtipo
IgG4. Os auto-antgenos contra o qual os anticorpos antiepiteliais reagem e a
desmogleina 1 (Dsg1), molcula, da famlia das caderinas, que compe os
desmossomos, glicoproteina transmembranica com uma parte intracelular
(endodominio) e vrios domnios extracelulares (ectodominio EC). Demonstrouse que os auto-anticorpos do FS em pacientes com doena em atividade reagem
contra os ectodominios EC1 e EC2, que so os dominios extracelulares da Dsg1
mais afastados da membrana celular.

Elisa - Na atualidade, para o teste de Elisa, existem preparaes comerciais de

desmogleinas a ser testadas com os soros dos doentes.

Pnfigo vulgar (PV)

Doena bolhosa intra-epidrmicas que afeta pele e mucosas, potencialmente fatal.

Elisa - Os anticorpos circulantes IgG no PV podem ser detectados no teste de Elisa,

usando Dsg1 e Dsg3 recombinantes.

Penfigide bolhoso (PB)

Doena autoimune,crnica, limitada, com formao de bolhas, principalmente em
indivduos idosos, de todas as raas. Alguns casos tm sido descritos na infncia. Os
casos ocorrem esporadicamente, e no h evidnciasde que exista um componente
gentico no desencadeamento da doena. Autoanticorpos da classe IgG so
identificados e dirigem-se contra antgenos designados como BP 230 Ag1 e BP 180
Ag2 . O BP 230 localiza-se na placa hemidesmossmica intracelular, e o BP 180
glicoprotena transmembrnica, cujo domnio extracelular ultrapassa a lmina lcida da
zona de membrana basal.

Elisa: Na atualidade j se dispe comercialmente do teste de Elisa para detectar os

anticorpos circulantes do PB, contra os antgenos BP180 e BP230. Trata-se de teste
prtico e de fcil execuo, podendo ser til para prever recidivas da doena aps
interrupo da terapia.

Dermatite herpetiforme
Dermatite herpetiforme (DH) doena clinicamente caracterizada por leses
urticariformes e bolhas associada enteropatia sensvel ao glten (doena celaca).
Nessa doena, h presena de IgA de forma granular, grumosa, pontilhada ou fibrilar
ao longo da zona da membrana basal (ZMB).

Elisa: Anticorpos IgA contra transglutaminase tecidua atualmente so considerados

diagnstico sorolgico marcador de DH e doena celaca. A transglutaminase
epidrmica considerada o autoantgeno das leses cutneas na DH, e ocorrem
reaes cruzadas entre os anticorpos que reconhecem as transglutaminases
epidrmica e intestinal.