NORMAS DE SEGURANA PARA O TRABALHO NO LABORATRIO DE

MICROBIOLOGIA GERAL

1. No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente com a

desinfeco e esterilizao. O mesmo procedimento dever ser repetido se ocorrer
ferimentos ou cortes.
2. Considerar todos os micro-organismos como patognicos em potencial;
3. Cuidados com fogo (checar torneiras de gs);
4. Evitar respingos, gerao de aerossis e derramamentos (= trabalhar com calma);
5. Tomar cuidado ao transportar vidrarias; produtos qumicos; inculos microbianos;
6. Uso de equipamento de proteo (luva, culos, mscara), e locais de segurana (fluxo,
capela);
7. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a anlise.
8. Utilizar exclusivamente material estril para a anlise.
9. No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho.
10. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais os deixando sobre a
bancada.
11. Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso.
12. Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados, portanto no os colocar na estufa ou
despeja-los na pia.
13. Trabalhar sempre prximo ao fogo.
14. Manter a calma durante uma situao de risco;
15. No atender telefones ou abrir portas com luvas descartveis, tampouco se coar;
16. No cheirar ou provar qualquer produto qumico etiquetagem/rotulao;
17. No sobrecarregar a capacidade de uma tomada;
18. Evitar longos perodos com a chama acesa;
19. Ter noo de suas limitaes (peso que consegue carregar, carga de trabalho semanal,
evitar malabarismos circenses);
20. Cuidar dos colegas de trabalho;
21. Assumir os erros e alertar sobre consequncias.

NORMAS PARA A PREPARAO DOS RELATRIOS DAS AULAS PRTICAS

O relatrio deve ser composto da seguinte forma:

1. Capa (dados de identificao, ttulo da prtica e data de realizao).
2. Introduo (referencial bibliogrfico sobre o assunto abordado durante a aula).
3. Objetivos
4. Metodologia (descrio dos procedimentos realizados na aula prtica).
5. Resultados e Discusso (Apresentao dos resultados obtidos na prtica e discusso destes
pelo aluno, tendo como base o referencial bibliogrfico).
6. Questes
7. Concluso
8. Referncias bibliogrficas.
As margens adotadas devem ser de 2,5 cm e o espaamento de 1,5 cm para todo relatrio exceto
as referncias bibliogrfica (item 8) com espaamento simples. As fontes devem ser Arial
(tamanho 11) ou Times New Roman (tamanho 12).
Lembrando que na introduo todas as citaes devem ser explicitadas no texto e todos os
autores citados devem constar nas referncias.
Exemplos de citaes
SOBRENOME, Nome (s) do (s) autor (es). Ttulo do livro. Local de publicao: editora, ano.
Pginas utilizadas.
SOBRENOME, Nome (s) do (s) autor (es). Ttulo. Ano. Disponvel em: < link do site >. Acesso em:
(dia ms ano).
Em obras com mais de trs autores, cita-se apenas o sobrenome do primeiro autor que aparece
na obra, seguido da expresso et al.

01
Micro-organismos no Meio Ambiente
INTRODUO
Os micro-organismos podem ser encontrados tanto no meio ambiente como na superfcie
da pele e de algumas mucosas do homem e dos animais. A grande maioria deles exerce um
papel importante na manuteno de ecossistemas da natureza ou so utilizados em processos
industriais. Alguns deles, localizados na pele e mucosas, exercem papel importante impedindo a
colonizao de bactrias patognicas.
Uma pequena parcela deste mundo microbiano, entretanto, responsvel por importantes
enfermidades no homem e nos animais.
As bactrias so visualizadas apenas com o uso do microscpio. Entretanto, quando
semeadas em meios slidos, cada bactria, multiplicando-se sucessivamente, formar colnias.
Estas so populaes de centenas a milhares de bactrias provenientes do mesmo indivduo,
sendo geneticamente idnticas.
As caractersticas morfolgicas das colnias so importantes para a identificao das
bactrias

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever estar apto a:

a) Ter conhecimento das normas adotadas no laboratrio de Microbiologia;
b) Reconhecer a presena de micro-organismos no meio-ambiente.

Atividade

a) Dividir a placa no verso em 2 partes;

b) Tocar diferentes superfcies com o "swab" e semear no gar;
c) Colocar a placa na estufa ( 37C) para crescer, com a tampa para baixo.

02
Estudo Macroscpio de Colnias (Morfologia de
Colnias)
INTRODUO
Colnias so o resultado da reproduo de bactrias e/ou outros micro-organismos na
superfcie de um dado meio de cultura (ex.: gar + nutrientes).
O desenvolvimento de colnias til porque o tamanho e a aparncia das colnias
costumam estar fortemente associados espcie de bactria que as compe. Quando uma
populao mista cultivada adequadamente, pelo isolamento das colnias possvel identificar a
colnia desejada, baseando-se nas suas caractersticas macroscpicas.
Em uma dada colnia, as diferenas de crescimento bacteriano parecem estar ligadas ao
gradiente de O2, nutrientes e produtos txicos no seu interior. Na borda da colnia a
disponibilidade de O2 e nutrientes plena, o que est associado multiplicao mais rpida das
bactrias nesta regio. medida que se aproxima do centro da colnia, tem-se um crescimento
mais lento das bactrias. O centro da colnia naturalmente mais espesso que a borda. Como
resultado, nesta regio o O2 e os nutrientes so mais vagarosamente difundidos e h menor
eliminao dos metablitos txicos, ocorrendo reduo do crescimento da colnia (em algumas
pores mais antigas da colnia pode at estar ocorrendo autlise celular).

MORFOLOGIA COLONIAL

a) Forma: puntiforme; circular; irregular; filamentosa

b) Elevao: elevada; convexa; bosselada; papilada
c) Bordos: ondulado; fimbriado; inteiro; denticulado
d) Transparncia: transparente; opaco;translcido
e) Brilho: fosco; brilhante
f) Pigmentao: ausente; presente
g) Superfcie: rugosa; lisa
h) Consistncia: mucide; quebradia

Objetivos

Aps o trmino desta unidade o aluno dever estar apto a:

a) Reconhecer a diversidade da populao microbiana no meio ambiente.
b) Reconhecer que esta diversidade se reflete nas diferentes colnias formadas pelas bactrias
no meio de cultura.
c) Observar e descrever a morfologia colonial das bactrias.

Atividade

Observe a morfologia de quatro colnias diferentes que cresceram na sua placa e

classifique as quanto sua morfologia.

Questes

a) Discuta o porqu da existncia de colnias diferentes na amostra proveniente de um mesmo

local e de locais distintos.

03
Estudo Macroscpio das Bactrias
Coloraes: simples e diferencial
______________________________________________________________________________
____________
INTRODUO
Os micrbios no so facilmente visveis em seu estado natural, mas possuem uma
acentuada afinidade por substncias corantes e, uma vez submetidos a mtodos de colorao,
so facilmente identificveis ao microscpio.
Corantes so compostos orgnicos de estrutura complexa, capazes de transmitir ao objeto
de estudo a sua prpria cor. Existem corantes naturais (origem animal ou vegetal) e corantes
artificiais ou sintticos, derivados de benzeno.
Os corantes so classificados em cidos ou plasmticos (eosina, vermelho congo, fucsina
cida) e bsicos ou nucleares (cristal de violeta, azul de metileno, fucsina bsica). Quando sais
corantes so formados pela unio de grupos cidos e bsicos, ambos dotados de propriedades
corantes, resulta um composto classificado como corante neutro (ou salino), reunindo a
caracterstica plasmtica e nuclear (eosinato de azul de metileno).

Preparao do esfregao utilizando cultura de bactrias em gar inclinado:

a) Flambar a ala de platina ao rubro at incandescncia e, a seguir, deix-la esfriar conservandoa prxima chama;
b) Depositar uma gota de gua no centro da lmina ( pegar com a ala de platina uma gota de
gua na torneira );
c) Segurar o tubo de cultura contendo meio slido com a mo esquerda e, com o dedo mingo,
remover o tampo de algodo da boca do tubo;
d) Flambar a boca do tubo de cultura e com a ala de platina esterilizada retirar uma pequena
poro da cultura de bactria e deposit-la sobre a gota de gua na lmina;
e) Fazendo movimento circulares com a ala de platina, espalhar o material sobre a lmina;
f) Deixar evaporar o excesso de gua, segurando e movimentando a lmina sobre a chama, sem
encostar;
g) Fixar o esfregao movimentando a lmina sobre a chama por algumas vezes, a fim de que o
material fique bem aderido lmina;

h) Deixar a preparao esfriar ao ar.

Preparao do esfregao utilizando uma cultura lquida de bactrias

a) Segurar o tubo de cultura (caldo), remover o tampo de algodo da boca do tubo;

b) Flambar a boca do tubo de cultura e com a ala de platina previamente esterilizada, retirar 3
a 4 gotas de cultura de bactria depositando-as sobre a lmina;
c) Flambar novamente a boca do tubo e fech-lo;
d) Com movimentos de rotao da ala de platina (que vai se ampliando do centro para a
periferia), o material deve ser espalhado a fim de se obter um esfregao de forma oval, bem fino e
uniforme;
e) A fixao do material semelhante do esfregao de cultura em gar inclinado

COLORAO SIMPLES
a) Fazer um esfregao bem espalhado de uma suspeno bacteriana;
b) Fixar o material ao calor (sobre a chama trs vezes);
c) Cobrir o esfregao com algumas gotas de corante: soluo de azul de metileno, violeta de
genciana ou fucsina bsica;
d) Deixar o corante agir durante um minuto;
e) Escorrer e lavar em gua corrente;
g) Enxugar a preparao com papel filtro dobrado, apertando-o cuidadosamente para no
remover a preparao. Deixar a lmina secar ao ar completamente;
h) Colocar uma gota de leo de cedro sobre a preparao e examina-l com objetiva de
imerso.

RECOMENDAES TEIS
a) O aquecimento da lmina deve ser feito com o esfregao voltado para cima (no deve ter
contato com a chama). Observar com muita ateno a marca feita inicialmente com o lpis;
b) Verificar sempre que o esfregao esteja seco antes de ser fixado pelo calor para no haver
o risco de ferver com projeo de partculas, os aerossis, que so partculas em suspenso no
ar, que podem conter micro-organismos patognicos.

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever estar apto a:

a) Realizar esfregaos a partir de diferentes materiais.
b) Fixar os esfregaos de maneira correta.
c) Identificar os esfregaos de maneira correta.
d) Realizar uma colorao simples.
e) Diferenciar os tipos morfolgicas das bactrias.

Atividade

Fazer uma colorao simples de uma cultura em gar inclinado e de uma cultura em
caldo e observar as diferentes formas e arranjos bacterianos.

COLORAO DIFERENCIAL
MTODO DE GRAM

Incluem-se, na teoria das coloraes, outras noes de interesse prtico, tais como:

Mordente: qualquer substncia que forme compostos insolveis com os corantes, determinando
sua fixao s bactrias. O mordente participa intimamente na reao de colorao, sendo
exemplos a soluo de iodo iodetada (LUGOL), o cido tnico, os sais de alumnio, de ferro, de
zinco ou de cobre.

Acentuador: substncias que contribuem para intensificar a colorao de uma estrutura biolgica
no sendo, como os mordentes, indispensveis ao processo de colorao. (ex. cido fnico).

Agentes descorantes: descoram, seletivamente, estruturas previamente coradas. So

amplamente empregados nos processos diferenciais de colorao.
Ex: lcool, acetona, lcool-acetona, cido clordrico, lcool-cido clordrico.

O mtodo de colorao de GRAM baseia-se no fato da reteno do cristal de violeta aps o

tratamento pela mistura de lcool-acetona dividindo, desta maneira, as bactrias em duas
categorias:

gram-positivas e gram-negativas.

Vrias alteraes do mtodo original de GRAM j foram feitas. Entretanto, em todas elas quatro
reagentes bsicos so usados:

a) corante bsico(violeta de genciana)

b) mordente (soluo de iodo-iodetada de LUGOL)
c) agente descorante (lcool etlico, acetona ou lcool-acetona 1/3)
d) corante bsico de fundo: (fucsina bsica diluda ou safranina).

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Executar a tcnica de colorao de Gram a partir de culturas em meio slido e lquido.
b) Relacionar a composio qumica da parede celular da bactria com o seu comportamento na
colorao de Gram.
c) Classificar as bactrias de acordo com a colorao de Gram.
d) Classificar as bactrias de acordo com a sua forma e arranjo.

Atividade

a) Fazer o esfregao utilizando cultura slida ou lquida.

b) Cobrir o esfregao com violeta de genciana, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia,
lavando rapidamente a lmina para tirar o excesso de Violeta de Genciana.
c) Cobrir a lmina com Lugol, aguardar um minuto e desprezar o corante na pia.
d) Inclinar a lmina e gotejar a soluo de lcool-acetona at que no haja mais desprendimento
de corante. Lavar a lmina rapidamente em gua corrente.
e) Cobrir a lmina com Fucsina Bsica e aguardar 30 segundos. Lavar a lmina e secar em papel
filtro sem esfregar.
f) Observar no microscpio com objetiva de imerso.

Questes
a) Qual a razo das bactrias Gram positivas manterem a colorao violeta e as Gram negativas
a colorao rosa?
b) Cite exemplos de micro-organismos Gram positivos (cocos e bacilos) e Gram negativos (cocos
e bacilos)
c) Em uma colorao de Gram o tcnico de laboratrio esquece de colocar Lugol, o que
acontecer?

COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN

A parede bacteriana das micobactrias caracterizam-se por conter um alto teor de lipdeos,
principalmente cido miclico, que tornam as mesmas difceis de serem coradas por mtodos
convencionais. Uma vez sendo coradas, entretanto, estas bactrias resistem ao descoramento
at mesmo por solventes orgnicos fortes como o lcool cido. Por esta razo estas bactrias so
chamadas bacilos lcool-cido resistente (BAAR). Para a colorao inicial com a FUCSINA de
ZIEHL (carbolfucsina) necessrio um tratamento com calor para que o corante penetre atravs
da parede bacteriana.

Procedimento
a) Colocar a lmina na cuba contendo FUCSINA DE ZIEHL e deixar por 15 min.
b) Passar a lmina no frasco LAVAGEM 1 para retirar o excesso de corante.
c) Lavar em gua corrente.
d) Inserir e retirar a lmina, umas duas vezes, no lcool cido, para a retirada da fucsina.
e) Lavar em gua corrente.
f) Colocar a lmina na cuba contendo AZUL DE METILENO e deixar por 1 min.
g) Passar a lmina no frasco LAVAGEM 2 para retirar o excesso de corante.
h) Secar a lmina, colocar o leo de imerso e observar com objetiva X100.

Resultado

Bacilos cido-resistentes vermelhos; outras bactrias e ncleos celulares azuis.

COLORAO DE ENDSPORO

Endosporos so corpos ovais altamente resistentes, produzidos tipicamente por bactrias

Gram positivas dos gneros Bacillus e Clostridium.
Representam um perodo latente (repouso) da clula bacteriana. As bactrias capazes de
esporular podem crescer e se multiplicar por muitas geraes como clulas vegetativas.
As bactrias dos gneros Bacillus e Clostridium produzem um esporo por clula
vegetativa; a esporulao, portanto, no um processo de multiplicao embora haja outras
bactrias que formem mais de um esporo por clula.
O tamanho bem como a localizao dos esporos dentro das clulas, varia de espcie para
espcie. Os esporos, em relao s formas vegetativas, so muito mais resistentes aos agentes
qumicos e fsicos adversos, o que usualmente atribudo parede de complexo cido
dipicolnico-Ca2+.

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Executar a tcnica de colorao de Bartolomeu, para a evidenciao dos endosporos.
b) Reconhecer, na colorao, os endsporos e as formas bacterianas.

Atividade

Tcnica de colorao de endosporos

(Mtodo de Bartolomeu Mittwers):

a) Fazer um esfregao de uma cultura de Bacillus.

b) Cobrir a lmina com soluo saturada de Verde Malaquita, aquecer durante cinco minutos,
contados aps o desprendimento de vapores. No deixar ferver ou secar, se necessrio, adicionar
mais corante.
c) Lavar com gua abundante, at retirar bem o corante Verde Malaquita.
d) Corar por 30 segundos com soluo aquosa de safranina a 0,25%;
e) Lavar, escorrer e secar;
f) Examinar em objetiva de imerso.

Questes

a) Qual a colorao que os esporos adquirem?

b) Se voc fizer uma colorao de Gram neste material, o que poderia observar ? Justifique
sua resposta.

04
Meios de Cultura para Bactrias
INTRODUO
Na natureza muitas espcies de micro-organismos so encontrados juntos crescendo
em diferentes ambientes como: solo, gua, matria orgnica viva ou morta. Estes materiais
(ambientes) podem ser considerados meios de cultura naturais desses micro-organismos.
Os meios de cultivo, tambm chamados de meios de cultura, so complexos que se
destinam ao cultivo de micro-organismos no laboratrio. Para se cultivar bactrias ou qualquer
outro micro-organismo no laboratrio necessrio conhecer as necessidades nutricionais destes
Os meios de cultivo devem conter as substncias exigidas pelos micro-organismos para o
seu crescimento e multiplicao. Para que possam realizar a sntese de seus prprios
constituintes devem dispor de fontes de carbono (protenas e acares), fontes de nitrognio (
peptonas) e fontes de energia. So tambm necessrios alguns sais minerais, vitaminas e outras
substncias que favorecem o seu crescimento.
Alguns micro-organismos, como as bactrias causadoras de lepra, sfilis, no so capazes
de
crescer em meios de cultura de laboratrio. Elas somente crescem em culturas que contenham
clulas vivas oriundas de seres humanos ou outros animais.
Ainda, para que os micro-organismos sejam capazes de crescer e se multiplicar em meios
de
cultivo necessrio que as condies de presso osmtica, presso atmosfrica, pH, grau de
umidade, temperatura de incubao sejo adequadas.

CLASSIFICAO DOS MEIO DE CULTIVO

Quanto a consistncia:

a) Meio Lquido: aquele em que os nutrientes esto dissolvidos em uma soluo

aquosa. O crescimento microbiano nesse meio de cultura muda o seu aspecto causando a
turvao do mesmo.

b) Meio semi-slido: aquele que possui na sua composio, alm dos nutrientes, uma pequena

poro (0,5%) de um polissacardeo proveniente de algas marinhas chamado gar . Estes meio
normalmente so preparados em tubos de ensaio e a partir desse tipo de meio de cultivo capaz
de se observar a motilidade bacteriana.
c) Meio slido: aquele que possui os nutriente e uma poro maior de gar em torno de
1,5% (cerca de 15g/litro gua destilada). Podem ser dispostos em tubos de ensaio ou em placas
de Petri, dependendo da finalidade.

Quanto a funo:

a) Meio sinttico: so meios preparados em laboratrio a partir de materiais de composio

precisa ou razoavelmente bem definida.
b) Meio sinttico definido: aquele que contm tipos e quantidade de substncias qumicas
conhecidas e especficas ex: meio sinttico definido para o cultivo de Pseudomonas aeruginosa.
c) Meio complexo ou quimicamente no definido: aquele que contm materiais
razoavelmente conhecidos porm a composio qumica de alguns ingredientes pode variar de
partida para partida. Fazem parte da composio desses meios: extratos de carne, soja, peptonas
etc..
d) Meio Simples: possui os nutrientes essenciais para o crescimento dos micro-organismos
pouco exigentes. Ex: caldo simples
e) Meio Enriquecido:. Neste meio, alm das fontes nutricionais usuais so adicionados sangue,
soro, ovo extrato de levedura , extratos teciduais etc... Este meio de cultura permite o crescimento
de micro-organismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas no inibem o
crescimento de outros. ex. gar sangue
f) Meio Seletivo: meio que favorece o crescimento de determinados micro-organismos em
detrimento de outros, geralmente devido a adio de substncias. Ex. gar Mac Conkey: possui
sais biliares que inibem o crescimento de Gram positivos; gar Salmonella Shigella.; gar
Sabouraud
g) Meio Diferencial: este meio possui substncias que evidenciam uma caracterstica que
permite separar um grupo ou uma espcie de microrganimos.
Ex: gar Mac Conkey diferencia bactrias Gram negativas em lactose positiva ou lactose
negativa; gar sangue diferencia estafilococos e estreptococos alfa hemolticos e beta hemolticos
atravs do padro de hemlise das hemcias do meio.
h) Meios de manuteno: so aqueles destinados manter a viabilidade da cultura.
Os meios de cultura so preparados e armazenados seguindo um rgido controle de

qualidade pois devem ser mantidas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterelidade
dos mesmos at o momento do uso

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Conhecer os diferentes meios de cultura e algumas de suas propriedades.

Questes
Qual seria a sequncia de meios a serem utilizados para:
b) Diagnosticar bactrias Gram negativas de uma amostra de urina ?
b) Bactrias causadoras de uma infeco ocular?
c) Diagnosticar enterobactrias de uma amostra de fezes?
d) Caracterizar bactrias de uma amostra de gua?

05
Tcnicas de Semeadura
INTRODUO

As tcnicas de cultivo de micro-organismos variam de acordo com o meio e a finalidade do

cultivo. No entanto, algumas regras devem sempre ser seguidas:

a) A agulha e ala de nquel-cromo ( ala ou agulha de platina) devem ser esterilizadas por
flambagem antes e aps qualquer cultivo. Cuidar para sempre esfria-las antes de usar.
b) Os recepientes devem sempre ser abertos perto do bico de Bunsen.
c) A boca dos tubos de ensaio deve ser aquecida aps a retirada e antes da colocao da
tampa. A tampa nunca deve ser colocada sobre o balco, sendo retirada e mantida segura pelo
dedo mnimo durante a inoculao.

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever estar apto a:

a) Realizar a inoculao em meio de cultura lquido, slido e semi-slido.
b) Verificar a presena ou ausncia de crescimento bacteriano nos meios inoculados.
c) Observar os tipos de crescimento em meio slido, lquido e semi-slido das diferentes espcies
bacterianas.
d) Obter colnias isoladas em meio slido em placa.

Atividade

Realizar os diferentes tipos de semeadura a partir de uma cultura de bactrias em gar

inclinado.
Incubar a 37C.
Quando num determinado meio encontramos apenas um tipo de micro-organismo temos a
chamada cultura pura, caso contrrio tem uma cultura mista.

Para realizar a identificao de um micro-organismo precisamos sempre trabalhar com

culturas puras. O mtodo de esgotamento em meio slido em placa o mais utilizado para
obtermos esta cultura pura.
Por este mtodo as bactrias vo sendo espalhadas na superfcie do meio at que esteja
separada o bastante para, durante o crescimento, dar origem a uma colnia isolada da bactria
de origem.

Procediemento

Tcnica I: semeadura em meio lquido

Com a ala de platina coletar um pouco do crescimento bacteriano do gar inclinado e

suspender no meio lquido em tubo.

Tcnica II: semeadura em meio semisslido

Com a agulha de platina coletar um pouco do crescimento bacteriano do gar inclinado e

introduzir (injeo) a mesma no gar em coluna reta at a profundidade de 2/3 do meio. A
inoculao deve ser nica.

Tcnica III: semeadura em meio slido inclinado

Com a ala de platina coletar um pouco do crescimento bacteriano do gar inclinado e fazer
estrias na superfcie do gar-inclinado novo recebido.

Tcnica IV. Semeadura em meio slido em placa (tcnica do esgotamento)

A tcnica consiste em depor sobre um ponto da superfcie do meio uma alquota do material e
depois espalh-lo em dois ou trs setores, com o auxlio da ala de platina, flambando-a antes de
mudar de setor e sem recarreg-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores
do material. O sucesso da semeadura por esta tcnica est em:
a) grande nmero de estrias;
b) no perfurar o meio;
c) no voltar a tocar ala sobre a estria e
d) pegar pequena quantidade de material para semear.

So componentes importantes para o crescimento in vitro das bactrias: a temperatura, a

tenso de oxignio e os nutrientes do meio de cultura.

REGRA GERAL PARA AS TCNICAS DE SEMEADURA

a) Flambar o fio e a ala de platina, resfriando-os antes da coleta

b) Recipientes com meio de cultura abertos e prximos ao bico de Bunsen
c) Aquecer a boca do tubo de ensaio antes e depois da colocao do tampo de algodo
d) Tcnica de Semeadura em Meio Slido Inclinado - Semeadura em Estria
e) Tcnica de semeadura em Meio Semislido em Tubo (Semeadura em Picada):
f) Tcnica deSemeadura por Esgotamento (tcnica de isolamento bacteriano em Placa de
Petri):
- Depositar num ponto da superfcie de gar da placa, a amostra a ser cultivada.
- Espalhar, sem recarregar, o material sobre a superfcie do gar, em pelo menos trs setores,
com angulaes sucessivas de 90C. A cada mudana de setor flambar a ala de platina.

Questes
Uma vez feita a semeadura, verificar o crescimento das bactrias nos diferentes tipos de
meio e classific-las como descrito abaixo:

a) A quantidade de crescimento:
- Escassa
- Mdia
- Abundante

b) A distribuio de crescimento:
- Uniformemente distribudo
- Em pelcula
- Crescimento acumulado

c) Isolamento de colnia:
- Colnia nica
- Colnias agrupadas
- Massa de clulas bacterianas
- Sem diferenciao.

06
Provas Metablicas na Identificao de Bactrias
Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Ter conhecimento das diversas provas metablicas utilizadas na identificao de

micro-organismos, bem como a interpretao de seus resultados.
b) Analisar os testes capazes de classificar os micro-organismos quanto sua capacidade de
utilizao de substratos como fonte doadora de energia, bem como quanto ao tipo de mecanismo
utilizado para a sua obteno

MEIOS CARBONADOS

Entre os produtos formados da quebra de carboidratos pelos micro-organismos esto os

cidos orgnicos (cido actico, cido ltico, etc.) e gases (dixido de carbono e hidrognio). Os
tipos e propores dos produtos formados depende da espcie do micro-organismo, portanto, da
habilidade (ou falta de habilidade) de um organismo quebrar uma simples molcula de acar,
combinar diferentes molculas de acar ou vrias outras molculas de carboidratos em um meio,
provendo informao necessria para a classificao das espcies de bactrias. A fcil deteco
de cidos e gases produzidos pelas espcies de bactrias de importncia prtica.

Utilizao da glicose

A glicose utilizada por uma srie grande de micro-organismos, que produzem

quantidades
variadas de substncias orgnicas, dentre as quais se destacam cidos (que alteram o pH do
meio de cultura), e gases como o CO2, H2 e CH4.

Meio de cultura:
gua peptonada como indicador
Peptona...............................................10,0 g
Cloreto de sdio......................................5,0 g
Glicose.................................................10,0 g
Indicador de andrade..........................10,0 ml
gua destilada................................1000,0 ml
pH entre 7,2 e 7,4

Semeadura: A semeadura realizada com ala de platina.

Incubao: 18 24 horas 37 oC.

Leitura:
a) Meio de cultura inalterado com crescimento = glicose negativa.
b) Meio de cultura vermelho, com bolhas no tubo coletor (tubo de Durham) = glicose positiva com
gases.
c) Meio de cultura vermelho, sem bolhas no tubo coletor = glicose positiva sem gases.

Nota: A glicose pode ser substituda por outro carboidrato, como a lactose, o manitol, a sacarose,
etc., para a realizao de testes semelhantes a este.

Prova do vermelho de metila (VM)

A utilizao da glicose por certas bactrias leva formao de substncias cidas,

algumas das quais, como por exemplo, a Escherichia coli, produz maior quantidade de cidos do
que outras (Ex.: Klebsiella pneumoniae). Essa diferena quantitativa pode ser evidenciada quando
o teste realizado em meios de cultura que contenham tampes de pH, de tal maneira ajustados,
que pequenas quantidades de cidos formados, no alteram a concentrao hidrogeninica do
meio.

Meio de cultura: Meio de Clark-Lubs

Proteose-peptona..................................5,0 g
Glicose...................................................5,0 g
Fosfato dipotssico................................5,0 g
gua destilada................................1000,0 ml
pH entre 6,8 e 7,0

Semeadura: A semeadura realizada com ala de platina.

Incubao: A incubao de 48 horas, no mnimo, podendo a leitura ser realizada dentro do
perodo de at uma semana.

Reativo de VM: Vermelho de metila..0,1 ml

lcool etlico...........300,0 ml
gua destilada.......500,0 ml

Leitura: Aps a incubao, adicionam-se algumas gotas (3 a 5) do Reativo de VM em cada

tubo. A leitura feita imediatamente, anotando-se os resultados conforme descrio abaixo:

a) Colorao vermelha = positivo

b) Colorao amarela = negativo
c) Colorao intermediria = duvidoso

Nota: Aps a leitura guardar o tubo para a prova de Voges-Proskauer

Prova de Voges-Proskauer (VP)

Vimos, anteriormente, que a

Escherichia coli e a Klebsiella pneumoniae tm

comportamentos diferentes quando cultivadas em meio glicosado tamponado. A diferena entre

as duas de ordem no s quantitativa, mas tambm qualitativa, pois a Klebsiella pneumoniae
produz, alm de cidos, dois produtos - o acetilmetilcarbinol (acetona) e o 2-3 butilenoglicol - que
no so elaborados pela Escherichia coli.
O acetilmetilcarbinol em presena de hidrxido de potssio e do oxignio atmosfrico

oxidado formando diacetil que, com as peptonas ricas em arginina, desenvolve uma reao
avermelhada. Sabe-se que o constituinte responsvel pela reao corada o ncleo guanidina da
arginina, presente em grande nmero de peptonas.

Meio de cultura: igual ao da prova do Vermelho de Metila.

Semeadura: Idntica prova do Vermelho de Metila.

Reativo de Barritt
Soluo I: Alfa-naftol........................6,0 ml
lcool etlico 95%...... 100,0 ml
Soluo II: Hidrxido de potssio...16,0 ml
gua destilada...........100,0 ml

Leitura: Aps a incubao adicionar a cada tubo a soluo I do Reativo de Barritt em quantidade
correspondente metade do volume do meio de cultura. Agitar e acrescentar a soluo II do
Reativo de Barritt em quantidade igual da soluo I. Agitar vigorosamente e deixar em repouso
temperatura ambiente (mais ou menos 15 minutos).

a) Colorao vermelha (anel vermelho na superfcie) = positivo.

b) Ausncia de cor vermelha = negativo.

Oxidao X fermentao

Fundamento: Algumas bactrias utilizam a glicose somente por via oxidativa (em presena
de oxignio atmosfrico), outras o fazem somente por via fermentativa (na ausncia total de
oxignio) e um terceiro grupo usa a glicose tanto por uma via quanto por outra via.

Meio de cultura: Meio de Mossel e Martin

Peptona................................................10,0 g
Extrato de levedo...................................1,5 g
Cloreto de sdio......................................5,0 g
Glicose..................................................10,0 g
gar......................................................15,0 g
Prpura de bromocresol.....................0,015 g

gua destilada................................1000,0 ml

Semeadura: Semeia-se a bactria em picada, procurando alcanar a parte inferior do meio de

cultura.
Incubao: Incuba-se durante 24 horas, no mnimo, temperatura adequada ao desenvolvimento
da bactria testada.
Leitura:
a) Cor amarela na poro superior do meio = oxidao.
b) Cor amarela na poro inferior do meio = fermentao.
c) Cor amarela em todo o meio = oxidao e fermentao.
d) Cor inalterada do meio = no utilizao da glicose.

Utilizao do citrato de sdio

Algumas bactrias tm a capacidade de sintetizar compostos orgnicos complexos

(protenas) utilizando como nica fonte de carbono o citrato de sdio e como fonte de nitrognio
um sal inorgnico.

Meio de cultura: (Simmons, 1926)

Cloreto de sdio......................................5,0 g
Sulfato de magnsio...............................0,2 g
Fosfato dicido de amnio......................1,0 g
Fosfato monocido de potssio..............1,0 g
Citrato de sdio.......................................2,0 g
Azul de bromotimol (soluo a 0,2%)...40,0 ml
gar .....................................................20,0 g
gua destilada..................................1000,0 ml
pH igual a 6

Semeadura: Inocula-se com agulha de platina fazendo uma estria central sobre o bisel. A
agulha que leva o inculo (no usar ala) deve ter apenas tocado o material a ser semeado,
evitando-se inculos abundantes.

Incubao: Incubar a 37 oC e fazer a leitura de 24 em 24 horas at 4 dias.

Leitura:
a) Meio de cultura inalterado, sem crescimento = citrato negativo.
b) Meio de cultura azul, com crescimento =citrato positivo.

MEIOS NITROGENADOS
Produo de indol

O indol um composto voltil produzido pela ao de algumas bactrias sobre o triptofano,

razo porque os meios de cultura utilizados nesta prova devem conter tal aminocido.

Meio de cultura: S.I.M.

Extrato de carne......................................3,0 g
Peptona.................................................10,0 g
Tripticase ou proteose-peptona............10,0 g
Sulfato ferroso amoniacal.......................0,2 g
Tiossulfato de sdio................................0,2 g
Cloreto de sdio......................................5,0 g
gar........................................................4,0 g
gua destilada..................................1000,0 ml
pH entre 7,2 e 7,4

Semeadura: Inocula-se com agulha de platina em picada, de modo a no ultrapassar 2/3 da

altura da coluna. Colocar tiras de papel impregnadas com o reativo de Braun-Silverstein,
prendendo-as entre o tampo de algodo e a parede do tubo.
Reativo: Braun-Silverstein (1940)
Para-dimetilaminobenzaldedo....................5,0
lcool metlico......................................50,0 ml
cido orto-fosfrico...............................10,0 ml
Cortar tiras de papel filtro do tamanho aproximado de 5 X 80 mm e umedecer com o
reativo acima, deixando secar por 2 ou 3 dias ao abrigo da poeira, na estufa ou no ambiente.
Incubao: Incuba-se a 37oC durante 24 horas.
Leitura:
a) Extremidade distal do papel-reativo inalterado = indol negativo.

b) Extremidade distal do papel-reativo de cor vermelha = indol positivo.

Nota: Outro teste para a Produo do Indol O indol resultante da degradao do aminocido
triptofano pela enzima triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio de cultura SIM
contendo excesso de triptofano. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovacs ou o
reativo de Ehrlich (soluo aquosa ou alcolica de p-dimetil aminobenzaldedo, respectivamente)
atravs da parede interna do tubo. A prova positiva quando na poro superior, isto , na
interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um anel de cor rsea dentro de no mximo 5
minutos. Este resultado devido complexao do indol com o aldedo, em meio cido, formando
o composto colorido. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do meio
ou marrom)

Reao: triptofanase Triptofano 6 Indol + piruvato e amnia

Leitura: O indol reage com o reagente, formando um composto colorido rseo.

A cistina e a metionina so dois aminocidos que contm enxofre e so encontrados nas
protenas e nas peptonas usadas nos meios de cultura. Existem bactrias capazes de produzir
gs sulfdrico (H2S) a partir da cistina, reduzindo uma molcula de cistina a duas de cistena e
depois a H2S, que evidenciado, nas culturas bacterianas, pela propriedade de reagir com metais
pesados (Fe, Bi, Co, Ni, Pb), formando sulfetos (de colorao negra).
Meio de cultura: S.I.M. (ver prova anterior)
Semeadura: (ver prova anterior)
Incubao: (ver prova anterior)
Leitura:
a) Meio de cultura enegrecido = H2S positivo.
b) Meio de cultura inalterado = H2S negativo.
Nota: A produo de H2S tambm pode ser revelada, com maior sensibilidade, pelo uso de
papel embebido em soluo de acetato de chumbo e colocado entre a parede do tubo e o tampo
de algodo.

Prova da motilidade
A prova da motilidade indica indiretamente a produo de flagelos. No uma prova
bioqumica e sim fisiolgica, mas auxilia a identificar bactrias. A prova efetuada inoculando-se
em linha reta o meio de cultura semi-slido com auxlio de uma agulha de platina at 2/3 de
profundidade. A prova indica motilidade positiva quando os micro-organismos crescem
deslocando-se da linha de inoculao, turvando o meio. A prova negativa quando os microorganismos ficam restritos ao local da inoculao sem, contudo, turvar o meio.
Meio de cultura: S.I.M. (ver prova anterior)
Semeadura: (ver prova anterior)
Incubao: (ver prova anterior)

Leitura:
a) Crescimento deslocado da linha de inoculao e turvao do meio = motilidade positiva.
b) Crescimento restrito a linha de inoculao sem turvao do meio = motilidade negativa.

Prova da fenilanina desaminase

As bactrias produtoras de fenilalaninadesaminase so capazes de agir sobre a
fenilalanina, transformando-a em cido fenilpirvico.
Este, em presena de cloreto frrico, desenvolve uma colorao verde (garrafa) intensa
e fugaz.

Meio de cultura: gar Fenilalanina (Ewing et al., 1957)

Extrato de levedo....................................3,0 g
DL-fenilalanina........................................2,0 g
ou L-fenilalanina......................................1,0 g
Fosfato dissdico....................................1,0 g
Cloreto de sdio......................................5,0 g
gar......................................................12,0 g
gua destilada..................................1000,0 g
pH igual a 7,3
Semeadura: a partir de uma cultura recente da bactria em estudo, fazer a semeadura em
estria, no bisel.
Incubao: Incubar a 37 oC durante 18 a 24 horas. Reativo: Soluo aquosa de cloreto frrico a

10%.
Leitura: Aps a incubao, gotejar sobre o crescimento bacteriano 4 a 5 gotas do reativo.
a) Cor verde intensa = fenilalaninadesaminase positiva.
b) Cor inalterada = fenilalaninadesaminase negativa.

Produo de urase

A uria um composto nitrogenado que libera amnia, quando hidrolisada pela ao da

enzima urease bacteriana. A amnia liberada alcaliniza o meio de cultura, fato que demonstrado
por um indicador de pH presente no meio.

Meio de cultura: (Christensen, 1946):

Peptona.................................................1,0 g
Cloreto de sdio......................................5,0 g
Glicose....................................................1,0 g
KH2PO4....................................................2,0 g
Vermelho de fenol...............................0,012 g
Uria......................................................20,0 g
gua destilada..................................1000,0 ml
Semeadura: Usar inculo grande, com ala
de platina.
Incubao: Incuba-se 37C NCE\d3C, durante 4 dias.
Leitura: A leitura deve ser feita em intervalos de 24 horas, durante os 4 dias de incubao.
a) Meio vermelho = urease positiva.
b) Meio inalterado = urease negativa.

OUTROS TESTES
Catalase

A catalase capaz de decompor o perxido de hidrognio com formao de gua e oxignio

molecular. Ela atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%) desdobrando-a em
oxignio e gua. A prova feita colocando uma gota de soluo aquosa de perxido de
hidrognio a 3- 5% numa lmina e, em seguida, com uma ala de platina, coloca-se uma poro

do crescimento bacteriano sobre a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma

soluo a uma cultura em meio lquido ou em gar inclinado. A prova considerada positiva
quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A catalase
produzida

por muitos

micro-organismos e

usualmente empregada para diferenciar

Staphylococcus, que so catalase positivos de Streptococcus, catalase negativos, ou os b acilos

Gram-positivos catalase negativos, Lactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioriados
Corynebacterium catalase positivos.

Catalase
2H202 6 2H20 + O2
Perxido de gua Oxignio Livre
Hidrognio
Meio de cultura: Qualquer meio de cultura capaz de propiciar o crescimento da bactria em
estudo. No utilizar o agar sangue (falso positivo).
Semeadura: Semear em superfcie ou em profundidade, de acordo com a consistncia slida
ou lquida do meio de cultura.
Incubao: Incuba-se temperatura adequada bactria, durante o tempo necessrio
ao seu crescimento.
Leitura: Colocar algumas gotas de gua oxigenada (10 a 20 vol.) sobre o crescimento
bacteriano.
a) Desprendimento de bolhas gasosas (O2) = catalase positiva.
b) Ausncia de bolhas = catalase negativa.

Coagulase
As coagulases possuem a capacidade de coagular o plasma sanguneo atravs de um
mecanismo similar ao da coagulao normal. A atividade da coagulase utilizada para distinguir
espcies patognicas de Staphylococcus de espcies no patognicas, sendo um bom indicador
da patogenicidade do Staphylococcus aureus. Esta prova pode ser realizada de duas formas.
Pesquisa da coagulase ligada, realizada em lmina e a prova da coagulase livre realizada em
tubo de ensaio. Nas aulas prticas ser realizada a prova da coagulase em lmina.

Procedimento:

Coagulase em Lmina (Coagulase ligada)

Realizando-se a prova em lmina (coagulase ligada) pega-se uma lmina de vidro limpa.
Coloca-se uma gota de gua e em seguida, inocula-se a colnia a ser testada, usando para isso a
ala de platina (inoculada como explicado em experimento anterior). Se no ocorrer aglutinao,
significa que no h resultado falso positivo, podendo-secontinuar para o teste com o plasma. Se
aparecerem grnulos o controle demonstrou falha. No esperada a formao de aglutinao no
teste com gua.
Segue-se colocando na lmina uma gota deplasma de coelho inoculando-se a mesma
bactria sobre a gota de plasma. Homogeneizar e/ou realizar
movimentos circulares com auxlio da ala de platina e observar, ao fim de uns minutos, se ocorre
a formao de aglutinao. E em aparecendo grnulos (aglutinao +), constatamos que a
bactria coagulase (+). Se ocorrer formao de pequenos agregados resultantes do fato das
bactrias ficarem aprisionadas na rede de fibrina ento formada, a prova positiva.
Se por algum acaso o teste de coagulase ligada, acima descrito, der negativo, deve-se
partir ento para o teste de coagulase livre que feito em tubo.

Coagulase em Tubo (Coagulase livre)

A prova da coagulase em tubo (coagulase livre) consiste em juntar num tubo de ensaio
contendo plasma (obtido de sangue a que se juntou um anticoagulante, por exemplo, oxalato,
citrato, heparina) uma suspenso do micro-organismo a ser testado (caldo de cultura) ou colnias
provenientes de um meio slido e incubar a 37 C. A formao de cogulos s 2 h, s 6 h ou s
24 h de incubao interpretada como uma prova positiva. A ausncia de coagulao aps 24
horas de incubao uma prova negativa.

Leitura:
O que ficou evidenciado nos resultados obtidos para a coagulase :

07
Identificao de Bactrias Gram Negativas e Gram
Positivas
Objetivo
Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:
a) Ter conhecimento dos procedimentos de recebimento de amostras com culturas de bactrias
a serem identificadas pelos mtodos bioqumicos clssicos da microbiologia.
b) Conhecer as etapas requeridas na identificao de bactrias Gram-negativas e Gram-positivas
e a importncia dos micro-organismos identificados, para a sua rea de atuao.

IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM-NEGATIVAS

A famlia Enterobacteriaceae a maior e mais heterognea famlia de bactrias Gramnegativas de importncia mdica. Esta famlia formada por bacilos entricos de importncia no
controle das infeces intestinais pela preveno da contaminao de gua e alimentos.
Famlia Enterobacteriaceae: grupo de bactrias que pode ser encontrado no trato intestinal
de humanos e alguns mamferos.
Representantes: forma de bastonetes, gram-negativos e no formadores de esporos.

Patognicos: Salmonella e Shigella

Patgenos Ocasionais: Proteus e Klebsiella
Flora intestinal normal: Escherichia e Enterobacter

Caracterizao da famlia Enterobacteriaceae

So bacilos gram-negativos, no esporulados, com motilidade varivel, oxidase negativa e que

crescem em meios bsicos (caldo peptona), meios ricos (gar sangue, gar chocolate), meios
seletivos (gar mac conkey, EMB). So anaerbios facultativos (crescem em aerobiose e
anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem a produo de gs, so catalase positivos e
reduzem nitrato a nitrito.

So divididos atravs de diferentes provas em 11 principais gneros, tendo sido descritos

nos ltimos anos outros 16 gneros e algumas espcies, mas ainda considerados de pouca ou
nenhuma importncia clnica.

Importncia clnica

A maioria das enterobactrias encontrada no trato gastrointestinal de humanos, no reino

animal, na gua, solo e vegetais. Alguns tambm so considerados enteropatgenos por
causarem preferencialmente infeces gastrointestinais como Salmonella, Shigella, Yersinia e
vrios sorotipos de Escherichia coli, embora possam tambm causar infeces em outros locais.
As enterobactrias representam 80% ou mais de todos os Gram-negativos de importncia
clnica isolados na rotina microbiolgica. So responsveis por cerca de 70% das infeces
urinrias e 50% das septicemias.
Para a diferenciao dos principais grupos de Enterobacteriaceae so estudadas as
propriedades bioqumicas e as reaes enzimticas na presena de substratos especficos.

Procedimento I:
a) Recebimento de bactrias codificadas.
b) Realizar uma semeadura por esgotamento de uma amostra de material biolgico (das culturas
codificadas) em uma placa de gar MacConkey.
- Isolamento em gar Mac-Conkey
- Presena de cristal violeta (inibe Gram +)
- Presena de lactose (verificao da fermentao)
c) Isolar uma colnia bacteriana em gar inclinado.
d) Fazer uma colorao Gram desta cultura aps 24 horas de crescimento para classificao da
bactria quanto a esta colorao e sua morfologia.
e) Semear os tubos com os diversos testes bioqumicos (prestar ateno quanto maneira de
semeadura de cada teste bioqumico) tambm com material desta cultura.
Inoculao nos meios carbonados: Glicose, lactose, Citrato, VM-VP
Inoculao em meios nitrogenados: Fenilalanina, Caldo Uria, Meio SIM
f) Aps o perodo de incubao, fazer a leitura conforme explicado em cada teste e anotar no
quadro abaixo. Comparar os resultados com os da tabela para Identificao de Bactrias Gramnegativas, identificando ento, o micro-organismo estudado.

Devido a importncia da Famlia Enterobacteriacea, ocorre a sua pesquisa e estudo em

alimentos, uma vez que podem estar envolvidos em diversos casos de toxi-infeces
alimentares. Alguns gneros pertencentes nesta famlia so utilizados como indicadores
das condies higinico-sanitrias empregadas no processo de manufatura de alimentos.

Procedimento II:
a) Recebimento de amostra de alimentos (verduras, legumes e outros alimentos) j preparados
em gua peptonada 0,1%, diludos adequadamente.
b) Realizar uma semeadura por esgotamento da amostra do alimento j diludo em placas de gar
MacConkey.
- Isolamento em gar MacConkey:
- Presena de cristal violeta (inibe gram +)
- Presena de lactose (verificao da fermentao)
c) Interpretao do crescimento e anlise macroscpica da colnia. Isolar uma colnia bacteriana
em gar inclinado.
d) Fazer uma colorao Gram desta cultura aps 24 horas de crescimento para classificao da
bactria quanto a esta colorao e sua morfologia.
e) Semear os tubos com os diversos testes bioqumicos (prestar ateno quanto maneira de
semeadura de cada teste bioqumico) tambm com material desta cultura.
Inoculao nos meios carbonados: Glicose, lactose, Citrato, VM-VP
Inoculao em meios nitrogenados: Fenilalanina, Caldo Uria, Meio SIM
f) Aps o perodo de incubao, fazer a leitura conforme explicado em cada teste e anotar no
quadro abaixo. Comparar os resultados com os da tabela para Identificao de Bactrias Gramnegativas, identificando ento, o micro-organismo estudado.

OBS: Comparando seus resultados com os da tabela para Identificao de Bactrias Gramnegativas, voc ter condies de identificar as bactrias. Voc deve ter em mente que
trabalhamos com seres vivos, portanto, capazes de uma certa variao nos resultados.

IDENTIFICAO DE BACTRIAS GRAM-POSITIVAS

Identificao de bactrias do gnero Staphylococcus

As espcies pertencentes a este gnero so flora normal de animais e humanos, sendo

nestes a espcie Staphylococcus aureus a mais importante no aspecto clnico. Nos humanos,
30% da populao so considerados portadores de S.aureus nasal. Os estafilococos se
caracterizam por serem cocos Gram-positivos arranjados em grupos (cachos de uvas). So
bactrias no esporuladas que resistem bem no meio ambiente. Podem sobreviver por meses em
amostras clnicas secas, so relativamente resistentes ao calor e podem tolerar uma
concentrao aumentada de sal, o que as caracteriza como bactrias halfilas ou haloflicas.
No entanto, apesar dos antimicrobianos existentes, da melhora das condies sanitrias e
das medidas de controle de infeco hospitalar, este micro-organismo continua a ser um dos mais
importantes patgenos para o homem. Indivduos sadios so colonizados intermitentemente por
S.aureus desde a amamentao, e podem albergar o micro-organismo na nasofaringe,
ocasionalmente na pele e raramente na vagina. A partir deste stios, o S.aureus pode contaminar
peles e membranas mucosas do paciente, objetos inanimados ou outros pacientes por contato
direto ou por aerossol, ocasionando infeces letais por conta dos fatores de virulncia ou atravs
da resistncia aos antimicrobianos atualmente utilizados. Assim, h necessidade de uma
identificao rpida e eficiente de todos os casos em que estes micro-organismos se apresentam.
A mastite bovina a principal doena do gado leiteiro em todo o mundo devido aos
prejuzos econmicos que acarreta ao produtor e perda da qualidade do leite. Dentre os agentes
da mastite, Staphylococcus aureus o mais frequentemente isolado em diversos pases. No
Brasil, relatos de isolamento de S. aureus de mastite subclnica so conhecidos desde o incio da
dcada de 50. Alm de participar como patgeno primrio da mastite bovina, S. aureus pode estar
presente como agente de diversas condies patolgicas e como parte da flora endgena de
diferentes espcies animais, incluindo o homem. Logo, o estudo e a identificao deste patgeno
em amostras clnicas tornam-se importantes, a partir das quais medidas de preveno e controle
podero ser estabelecidas.

Procedimento I:

O estudo das bactrias Gram-Positivas ser realizado simulando-se o recebimento de uma

amostra clnica em um laboratrio de Microbiologia.

Objetivos
a) Isolamento de culturas para verificao de pureza
b) Preparo de material para identificao de bactrias
c) Importncia do isolamento de micro-organismos do ponto de vista clnico.

Material Necessrio

a) Tubos com caldo simples inoculados com bactrias gram-positivas.

b) 1 placa de gar sangue por aluno

OBS: Paralelamente ser feito o estudo e identificao de bactrias gram-negativas. Para isso,
o aluno deve buscar na apostila a parte referente identificao deste grupo, fazendo o uso do
meio de cultura adequado para esta identificao (gar macconkey).

Atividade

a) Recebimento das amostras com as culturas, com as bactrias gram-positivas.

b) Identificao da amostra recebida.
c) Isolamento do micro-organismo em gar sangue empregando a tcnica da semeadura por
esgotamento.
d) Incubao da placa na estufa 37/C.
e) Leitura e interpretao do crescimento das colnias.
f) Re-isolamento em gar simples inclinado ou placa de agar simples.
g) Avaliao da morfologia colonial, realizao da colorao de Gram, prova da catalase.
h) Semeadura das provas bioqumicas: meios carbonados e meios nitrogenados.
i) Leitura e interpretao dos resultados. Identificao da bactria.
j) Realizao do antibiograma.

Procedimento II:

A pesquisa de Staphylococcus (S.aureus) pode se dar de diferentes formas. A coleta

poder ser feita a partir da realizao de um swab nasal e/ou swab subungueal.

Objetivo

a) Coleta de material para isolamento de Staphylococcus.

b)Ter noo de coleta de material clnico.

Material Necessrio
a) Meio de Chapman-Stone (Agar Sal-Manitol)
b) 1 placa de Agar sal manitol por aluno e 1 para o professor
c) 1 swab pequeno estril por aluno

Agar Sal Manitol: meio de cultivo caracterizado como seletivo e diferencial para
estafilococos. Ele recomendado para isolamento de estafilococos patognicos a partir de
amostras clnicas, alimentos, produtos cosmticos e outros materiais. Trata-se de um meio
seletivo pela alta concentrao de sal (7,5%) o que seleciona as bactrias que toleram meios com
alta concentrao de NaCl (halfilas). Ainda, a presena do manitol mostra as bactrias que
fermentam este acar, sendo que dos estafilococos, o S.aureus o nico com esta capacidade o
que torna este meio diferencial. A evidenciao da fermentao do manitol d-se pelo
aparecimento da uma colorao amarelado no meio, ao redor da colnia do micro-organismo que
o fermenta.

Atividade

a) Os alunos devero coletar material da prpria cavidade nasal ou realizar um swab

subungueal, com auxlio de swab estril, e inocul-lo na placa de Agar Sal Manitol. Identificar o
material e incub-lo na estufa.
b) Avaliao do crescimento em meio Agar Sal-Manitol. Observar o crescimento das colnias e
suas caracteristicas, assim como, as reaes de fermentao ou no do manitol.
c) Selecionar uma colnia e avaliar a morfologia colonial.
d) Realizar uma colorao de Gram para confirmao.
e) Realizar testes de catalase e coagulase e a prova bioqumica em Agar Mossel.
f) Incubar os testes a 37/C.
g) Leitura dos resultados e identificao da bactria isolada de acordo com a tabela.

Identificao de bactrias do gnero Streptococcus

Os estreptococos foram os maiores causadores de infeco hospitalar na era

prantibitica, causando surtos de infeco e mortes.
Apesar de no serem atualmente uma importante causa de infeco hospitalar, provocam,
no entanto, doenas muito graves e muitas vezes letais, mesmo em pacientes imunocompetentes,
sendo importante o rpido diagnstico deste agente. Os estreptococcus so encontrados em
animais e humanos na microbiota normal da cavidade orofarngea. Os estreptococos so muito
exigentes. Para um bom desenvolvimento dos mesmos, so necessrios meios enriquecidos e,
por serem em sua maioria anaerbios aerotolerantes, seu crescimneto timo ocorre me
microaerofilia. Eles podem ser diferenciados de acordo com a sua aparncia em placas de agar
sangue aps incubao a 35C em presena de 5% de CO2, podendo apresentar hemlise total
(beta), hemlise parcial (alfa, de cor esverdeada) ou ausncia de hemlise (gama). A identificao
de espcie de estreptococos beta hemolticos feita atravs da aglutinao com soros
especficos contra os antgenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rpida,
porm no acessvel a todos os laboratrios em virtude do elevado custo.

Objetivo

a) Coletar material para isolamento de Streptococcus.

b) Ter noo de coleta de material clnico

Material Necessrio

a) 1 tubo de caldo azida por aluno

b) 1 swab de garganta estril
c) 1 placa de agar sangue (Sangue de Carneiro 5%).

Atividade

a) Os alunos devero realizar swabs de garganta e inocular em tubos com caldo azida. Este
procedimento empregado para pesquisa de bactrias pertencentes ao gnero Streptococcus.
Incubao dos tubos com o swab junto, 37C.
b) Observar uma certa turvao no meio de cultura caldo azida,
c) Retirar o swab e depositar o meio de cultura lquido em um quadrante de uma placa de meio de
cultura gar sangue. Fechar a placa e proceder uma semeadura por esgotamento, espalhando o
material depositado com o swab, utilizando a ala de platina.
d) Incubao das placas em uma condio de microaerofilia, que ser criada em aula (em uma
jarra especfica), para promover o crescimeto das bactrias do gnero Strepetococcus, as quais
so consideradas fastidiosas (necessitando de meio rico e condies de microaerofilia).
e) Incubao da jarra na estufa a 37C.
f) Leitura e interpretao do crescimento.
g) Avaliao dos perfis de hemlise observados.
h) Seleo de uma colnia em agar simples inclinado para posterior identificao.
i) Semadura em provas bioqumicas: meios com diferentes substratos a serem testados. Incuo
na estufa a 37C.
j) Leitura e interpretao dos resultados.

08
Mtodos para testar a Sensibilidade das Bactrias
aos Antibiticos (antibiograma)
INTRODUO

Os antibiticos so produtos naturais de fungos e bactrias do grupo Actinomyces, capazes

de impedir o crescimento ou destruir os micro-organismos. Alguns antibiticos so bactericidas
(matam as bactrias) enquanto outros apenas bacteriostticos (inibem o crescimento das
bactrias). Na prtica se define como resistente aquele organismo que no inibido ou destrudo
por um agente antibacteriano que, em concentraes padronizadas, eficaz para controlar
micro-organismos. Antibiograma um bioensaio aplicado para verificar a sensibilidade dos microorganismos a vrios antibiticos, a fim de avaliar sua sensibilidade ou resistncia a um
determinado antibitico. Sua aplicao bsica est em avaliar a provvel eficcia de uma
variedade de antibitico sobre uma determinada bactria.

MTODO DE DIFUSO COM

DISCOS DE KIRBY-BAUER

Neste mtodo, discos de papel impregnados com antibitico so colocados sobre a

superfcie do gar previamente semeado uniformemente com o micro-organismo a ser avaliado.
Aps a difuso do antibitico no meio de cultura ocorre a formao de um gradiente de
concentrao ao redor do disco.
Depois da incubao da placa, a presena do antibitico no meio pode ou no inibir o
crescimento bacteriano que observado como a formao ou no de um halo de inibio. A
correlao do halo de inibio com a sensibilidade ou resistncia do micro-organismo em questo
categorizando determinada a partir de uma tabela. Ento (a partir de respectivas escalas
padronizadas), o micro-organismo poder ser definido como sensvel, intermedirio ou resistente
quele antimicrobiano (Tabela 7).

Objetivo

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Realizar e interpretar corretamente um antibiograma.

Atividade
a) Saturar um swab de algodo com a suspenso bacteriana.
b) Semear a suspenso bacteriana uniformemente sobre a superfcie estril do meio de gar
Muller-Hinton com o swab de algodo, em 3 direes, a fim de obter um inculo uniforme.
c) Deixar a superfcie das placas secar por 15segundos.
d) Colocar os discos de antibiticos sobre a superfcie do gar inoculado, com auxlio de uma
pina estril, pressionar levemente cada disco para baixo para assegurar um contato uniforme.

Nota: os discos no devem ficar mais prximos do que 1-1,5 cm da borda da placa de Petri, bem
como devem estar suficientemente separados para evitar superposio de seus halos
de inibio.

e) Deixar a placa em incubao 37 C.

Leitura da placa

a) Medir e anotar o dimetro de cada halo (incluindo o dimetro do disco).

b) Caso haja o crescimento de colnias satlites (adjacentes), medir o halo de inibio a
partir destas colnias.
c) Colocar abaixo o resultado conforme a bactria escolhida.
Bactria utilizada:__________________________

Questes
a) O que deve ser observado na leitura de um antibiograma?
b) Explique o resultado do seu antibiograma.
c) Qual o principio do teste de sensibilidade realizado nesta aula?
d) Houve diferenas quando o mesmo antibitico era utilizado contra diferentes
bactrias? Justifique sua resposta.

09
Controle da Populao Bacteriana por Mtodos
Fsicos
CONCEITOS IMPORTANTES

Esterilizao: Processo que visa destruio total de todas as formas de vida de um material ou
ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos.
Desinfeco: eliminao parcial ou reduo do nmero de micro-organismos presentes num
material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local. A
desinfeco pode ser realizada de forma fsica (pasteurizao) ou qumica (agentes qumicos,
denominados desinfetantes).
Anti-sepsia: Semelhante desinfeco,porm este processo est relacionado com tecidos
vivos, como pele e mucosas.
Sanitizao: o tratamento empregado para diminuir a populao microbiana nos utenslios
alimentares e equipamentos de manipulao de alimentos at nveis seguros a sade pblica.
Limpeza: Remoo mecnica da sujeira ou sujidade retidas dos componentes. Este processo
indispensvel e antecede os procedimentos de desinfeco ou esterilizao.

Mtodos Fsicos:
a) Calor Seco: incinerao, flambagem, ar quente;
b) Calor mido: gua em ebulio, vapor d'gua sob presso (autoclave), pasteurizao,
Tyndalizao;
c) Radiaes: radiao no-ionizante e ionizante.

DEFINIO
Calor mido
O calor mido um agente esterilizante eficaz pelo seu alto poder de penetrao. Seu
mecanismo de ao ocorre termocoagulao das protenas bacterianas.

a) gua fervente e vapor efluente: a exposio de micro-organismos por 10 minutos a 1000C

suficiente para destruir clulas vegetativas, porm ineficiente na destruio de esporos.
b) Autoclave: a esterilizao pelo vapor d'gua processada na autoclave. Nesse aparelho
a presso faz aumentar a temperatura e a autoclavao se d 1200C, por 15 a 20 minutos,
juntamente com o vapor em estado de saturao. Portanto, calor e umidade constituem
elementos indispensveis para a destruio dos micro-organismos. A penetrao do vapor no
material garante maior nvel de destruio dos micro-organismos, e por este motivo mais rpido.
c) Pasteurizao: processo que consiste em aquecer o material a uma temperatura relativamente
baixa (63C) durante 30 min ou um aquecimento rpido (72C) por 15 seg e seguido de um
resfriamento rpido (10C).
d) Tyndallizao: tambm denominada de esterilizao fracionada, um processo no qual o
material a ser esterilizado aquecido a 100C por 30 minutos em 3 dias consecutivos, sendo
incubado a 37C nos intervalos de aquecimento. O primeiro aquecimento ir destruir os microorganismos presentes, com exceo dos esporos. Estes germinaro nos perodos de incubao a
37C e sero destrudos nos aquecimentos posteriores.

Calor seco

O processo de destruio da vida bacteriana pelo calor seco diferente do que ocorre pelo
calor mido. No calor seco as bactrias expostas ao ar quente carbonizam antes que a
temperatura seja suficiente para destru-las. Todavia o calor seco tem menos poder de
penetrao que o calor mido, sendo que necessita de temperaturas muito elevadas e maior
tempo de exposio. Como mtodos de esterilizao por calor seco podemos citar:

a) Incinerao: mtodo onde os micro-organismos so destrudos juntamente com o material que

se leva ao fogo. Em hospitais utilizado para destruir o material infectado, como por exemplo:
material proveniente de curativos, seringas, agulhas, "swabs".
b) Flambagem: mtodo eficiente somente quando o material se torna incandescente. Em
laboratrios de anlise usado para esterilizar ala de platina, no preparo de lminas e na
inoculao dos micro-organismos no meio de cultura.
c) Ar Quente: Forno de Pasteur (estufa de esterilizao) Este tipo de esterilizao realizado a
temperaturas de 160C a 180C, com tempo de exposio de 120 a 60 min. em estufas eltricas
equipadas com termostatos, respectivamente. O calor seco ou ar quente em temperatura
suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos

micro-organismos. Podem ser esterilizados na estufa: vidros em geral, instrumentos metlicos,

talco, vaselina e leos em geral.

Radiaes

As radiaes consistem num mtodo eficaz para reduzir ou eliminar os micro-organismos.

Como mtodos de esterilizao por radiao podemos citar:
a) Radiao no-ionizante: A radiao no ionizante tem sua atividade microbicida na faixa de
comprimento de onda de 240-280 nm, sendo o comprimento de 260 nm o mais eficaz para
eliminar os micro-organismos. Bactrias ou fungos contidos no ar so facilmente atingidos pelos
raios e conseqentemente destrudos. Os raios ultravioletas (UV) so os componentes da luz
solar que exercem ao bactericida, a luz UV absorvida por muitos componentes intracelulares,
mas o DNA que sofre o mais dano. Aps o DNA ter sido exposto a luz UV, ocorre a formao de
dmeros de timina, que impede a ao da DNA polimerase. Para exercer sua funo letal sobre
qualquer micro-organismo devem atingi-los diretamente, pois possuem baixo poder de
penetrao. Se os micro-organismos estiverem complexados com matria orgnica, isto , fora de
alcance direto dos raios (atrs de uma partcula de poeira, superfcie com reentrncias e dobras),
estes permanecem vivos. Por no terem alto poder de penetrao, as vestimentas e alimentos s
estaro esterilizados, na superfcie expostas radiao. A gua perfeitamente lmpida
permevel aos raios e o vidro comum impenetrvel aos raios.
O grau de exposio aos raios ultravioletas, necessrios para exercer ao microbicida,
depende dos fatores tempo e intensidade, que variam para os diferentes micro-organismos.

b) Radiao inonizante: as radiaes so denominadas de ionizantes quando produzem ons,

radicais e eltrons livres na matria que sofreu a interao. A ionizao se deve ao fato das
radiaes possurem energia alta, o suficiente para rompem as estruturas celulares. um
excelente agente de esterilizao, porque possui um alto poder de penetrao. As radiaes
eletromagnticas do tipo X e gama so as mais penetrantes utilizada para esterilizar
antibiticos, hormnios e plsticos descartveis.

Objetivos

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Ter conhecimento do controle de populaes bacterianas atravs do uso de agentes fsicos.

Atividade

Calor mido
a) Com a caneta de retroprojetor, fazer 4 divises iguais na parte de inferior da placa, seguindo o
esquema abaixo.
b) A partir de uma cultura em gar inclinado, ser feita uma suspenso da bactria em gua
destilada estril. Esta suspenso ser fervida em banho-maria. Aps 5, 10 e 15 minutos uma
alquota da suspenso ser semeada na placa de Petri demarcada. Colocar a placa semeada na
estufa 37C (Figura XX)

Radiao no-ionizante
a) Com a caneta de retroprojetor, fazer 2 divises iguais na parte de inferior da placa, seguindo o
esquema abaixo.
b) Com auxlio da ala de platina ou cotonete de algodo, semear a cultura bacteriana de forma
estufa 37C.

Questes
a) O que pode ser observado com a utilizao do calor mido? Interprete os resultados.
b) Interprete o resultado observado na placa que foi colocada sob raios UV.

10
Controle da Populao Bacteriana por Mtodos
Qumicos
INTRODUO

Os desinfetantes e anti-spticos so agentes qumicos utilizados na desinfeco e antisepsia de superfcies inanimadas e tecidos vivos, respectivamente. A eficcia destes agentes
dependente de vrios fatores, como: tipos de micro-organismos potencialmente presentes,
concentrao e procedncia do desinfetante a ser usado, e tempo de permanncia de efeito.
Superfcies sujas devem estar limpas antes do uso do desinfetante ou anti-sptico. O uso
adequado de agentes qumicos essencial segurana laboratorial. Alm do uso como
desinfetantes ou antispticos, os agentes qumicos podem ser usados para evitar crescimento
bacteriano em alimentos (ex: nitritos em salsichas e outros tipos de carne).

TIPOS DE DESINFETANTES E ANTISPTICOS

Agentes alquilantes: glutaraldedo, formaldedo, xido de etileno.

Fenis: fenis
lcoois: etlicos e isoproplicos
Biguanidas: clorexidina
Halognios: compostos clorados e iodo
Compostos de Amnio Quaternrio: cloreto de benzalcnico
Peroxignios: perxido de hidrognio, cido peractico, oznio
Corantes: violeta de genciana

Objetivos

Aps o trmino desta unidade o aluno dever ser capaz de:

a) Ter conhecimento dos agentes qumicos utilizados para o controle de populaes bacterianas.

Atividade

O experimento que ser realizado tem por objetivo verificar a ao de anti-spticos sobre a
microbiota das mos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas:

a) Com a caneta de retroprojetor, fazer 4 divises iguais na parte de inferior da placa,

seguindo o esquema abaixo.
b) Identificar cada quadrante com os respectivos ttulos: Controle (C), Mo Suja (MS),
anti-sptico 1 (AS1), anti-sptico 2 (AS2).
c) No quadrante identificado como MS o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no gar
por 1 minuto.
d) A seguir o aluno deve lavar as mos com um anti-sptico, sec-las levemente e encostar o
mesmo dedo no quadrante do gar identificado como AS1 por 1 minuto.
e) O aluno ento deve lavar as mos com um outro anti-sptico, sec-las e encostar o mesmo
dedo no quadrante do gar identificado como AS2 por 1 minuto.
f) A placa deve ser levada para incubao.
OBS: Cuidado para no encostar no quadrante identificado como Controle.

Questes

a) Foi observada alguma diferena quanto sensibilidade das bactrias Gram positivas e Gram
negativas aos anti-sptico? Discuta seus resultados.
b) Por que o lcool 70% mais eficaz que o lcool a 100%?

11
Enzimas Extracelulares produzidas por Bactrias
INTRODUO

A habilidade dos micro-organismos em produzir e secretar uma variedade de enzimas de

grande importncia para a adaptabilidade do micro-organismo ao ambiente no qual ele sobrevive.
Esta caracterstica contribui tambm na produo de novas enzimas que possam auxiliar
na indstria, possam ser utilizadas no controle biolgico e na degradao de compostos poluentes
no meio ambiente. Nesta aula prtica as bactrias sero testadas quanto produo das enzimas
abaixo relacionadas.

GELATINASE

A protena gelatina obtida pela hidrlise do colgeno e um bom substrato para testar
bactrias produtoras de enzimas proteolticas (proteinases).
Estas enzimas proteolticas so importantes fatores de virulncia de alguns microorganismos. Ao ser hidrolisada pela gelatinase, a gelatina perde suas caractersticas de
gelificao, tornando o meio de cultura lquido.

Meio de cultura: tubos gar em coluna de gelatina nutriente

Extrato de carne ..........................3,0 g
Peptona bacteriolgica ................5,0 g
Gelatina (12%)...........................120,0 g
gua destilada ........................1000 mL
Semeadura : Semear os tubos por picada at metade do tubo, pelo menos 3 vezes
Incubao : 37C por aproximadamente 24 horas
Leitura : Aps incubao, colocar em um banho de gelo por 30 minutos. No agitar os tubos
enquanto seu contedo for lquido. Se o meio ficar slido ser gelatinase negativo, se ficar lquido
ser gelatinase positivo.
A hidrlise de protenas bem mais lenta quando comparada a quebra dos carboidratos,
portanto a deteco visual deve ser feita cuidadosamente e se necessrio com incubaes mais
longas.

AMILASE

Como a molcula do amido muito complexa, sua assimilao pelas bactrias deve ser
precedida por uma decomposio, que efetuada pelas amilases bacterianas. O amido, assim,
pode ser hidrolisado totalmente at glicose ou, parcialmente, com a formao de dextrinas.

Meio de cultura: gar simples adicionado de 0,2% de amido, distribudo em placas de Petri.
Semeadura: semear a bactria em pontos eqidistantes ou em pequenas estrias.
Incubao: incubar temperatura de 37C, durante 24 a 48 horas.
Leitura: aps a incubao cobre-se a superfcie do meio com soluo diluda de Lugol.
a) Colorao azul do gar (amido no hidrolisado) = amilase negativa.
b) Zona clara ao redor do crescimento (hidrlise total do amido) = amilase positiva.
c) Zona vermelha ao redor do crescimento (hidrlise parcial do amido) = amilase positiva.

CASEINASE

A casena a principal protena do leite e responsvel pela sua brancura opaca. Muitas
bactrias produzem enzimas que hidrolisam a casena em derivados mais solveis e
transparentes.

Meio de cultura: Placas de gar casena

Triptona............................ 5,0 g
Extrato de levedura........... 2,5 g
Glucose.............................1,0 g
Leite desnatado................. 20 mL
gar................................... 15,0 g
gua destilada................... 980 mL

Semeadura: semear a bactria em pontos eqidistantes ou em pequenas estrias.

Incubao: incubar temperatura de 37 C, durante 24 a 48 horas.
Leitura:
a) colorao opaca do gar ao redor do crescimento bacteriano - sem produo da enzima
b) zonas claras ao redor do crescimento bacteriano produo da enzima

Atividade
a) Preencha o quadro abaixo, em relao a produo ou no das enzimas extracelulares,
utilizando tambm os dados de seus colegas.
b) Se voc tiver bactrias Gram positivas e Gram negativas, discuta seus dados.

12
Cultivo e Identificao de Fungos Filamentosos
INTRODUO
Os meios de cultura mais comuns utilizados no cultivo de fungos so o agar batata
dextrose (BDA ou PDA) e o agar Sabouraud, ambos ricos em acares e ligeiramente cidos.
Caso seja necessria a preparao de um meio de cultura mais seletivo para fungos, devese adicionar um antibitico de amplo espectro de ao, como o cloranfenicol, e acidificar ainda
mais o meio de cultura (pH 4,0), j que a maioria das bactrias no cresce bem em pH cido. A
temperatura tima de crescimento dos fungos varia entre 22 e 28C, dependendo da espcie.
Outra caracterstica importante no cultivo de fungos filamentosos a necessidade de
umidade elevada, o que pode ser obtido atravs da incubao das placas de Petri com as tampas
voltadas para cima.
A identificao dos fungos filamentosos feita aps a observao de caractersticas
morfolgicas coloniais e da micromorfologia, principalmente atravs da observao das estruturas
reprodutivas.
Em relao colnia, so observadas a cor (frente e reverso), aspecto (cotonoso /
algodonoso ou feltroso), produo de pigmentos difusveis e de exsudatos, entre outras. Para a
observao correta da micromorfologia, realizada a tcnica de microcultivo (cultivo em lmina).
As principais caractersticas micromorfolgicas a serem observadas so: tipo de hifa
(cenoctica ou septada), cor da hifa (hialina ou escura), tipo de estrutura reprodutiva (sexuada
e/ou assexuada; esporngios / conidiforos), tamanho e forma dos esporos.

Objetivos

Ao trmino desta unidade, o aluno dever ser capaz de:

a) Reconhecer uma colnia de fungo filamentoso e saber diferenci-la de colnias de
microorganismos unicelulares (bactrias e leveduras).
b) Diferenciar as condies apropriadas para cultivo de fungos das utilizadas para cultivo de
bactrias.
c) Saber as caractersticas morfolgicas coloniais utilizadas na identificao de fungos
filamentosos.
d) Saber as caractersticas micromorfolgicas utilizadas na identificao de fungos filamentosos.
e) Realizar a tcnica de microcultivo (cultivo em lmina) para a identificao de fungos
filamentosos.

Atividade

a) Inocular com a ala bacterilogica uma suspenso de esporos de um fungo filamentoso no

centro de uma placa de Petri contendo BDA ou gar Sabouraud. Incubar a 25 28o C por 1
semana, mantendo a tampa da placa de Petri voltada para cima.
b) Aps a incubao, observar as caractersticas morfolgicas da colnia e a micromorfologia.
c) Realizar o microcultivo do fungo e incub-lo nas mesmas condies mencionadas
anteriormente.
d) Aps a incubao, retirar a lamnula do microcultivo e montar em uma nova lmina, usando

lugol como lquido de montagem. Observar a micromorfologia ao microscpio.

e) Comparar a micromorfologia do fungo estudado com lminas prontas de fungos comuns na
natureza (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, etc).

Morfologia da colnia de um fungo filamentoso

Aspecto da colnia: cotonosos (algodo); velutina ou aveludada; membranosa ou coricea;

lanosa
Presena de pigmento: verso ou reverso
Contorno: circular; oval; eliptico; irregular; amebide;
Bordos: ondulados; inteiros; denteados; ciliados; lobulares
Topografia: dobras; sulcos;elevaes; franjas; pregas

13
Cultivo e Identificao de Leveduras
INTRODUO

As

leveduras

so

fungos

predominantemente

unicelulares,

que

se

reproduzem

assexuadamente por brotamento (gemulao) ou fisso. As condies para cultivo de leveduras

so as mesmas mencionadas para fungos filamentosos, com exceo de que elas no requerem
tanta umidade para o crescimento, portanto, as placas de Petri so incubadas com a tampa
voltada para baixo. Como as leveduras so unicelulares, a identificao feita atravs de
caractersticas morfolgicas (coloniais e celulares) e testes fisiolgicos / bioqumicos. Todas
as leveduras se coram como Gram positivas pela colorao de Gram.

Caractersticas coloniais: cor da colnia; consistncia (cremosa, mucide, seca), superfcie

(lisa ou rugosa), bordas (regulares ou irregulares), brilho (brilhosa ou opaca), elevao (plana,
convexa, umbonada, forma de vulco).
Caractersticas celulares: tamanho e forma das clulas, tipo de reproduo assexuada
(brotamento ou fisso), reproduo sexuada (principalmente presena de ascosporos), presena
de pseudomiclio.

Testes fisiolgicos / bioqumicos: fermentao de acares, assimilao de diferentes

fontes de carbono e de nitrognio, crescimento em diferentes temperaturas e diferentes
concentraes de NaCl, etc.

Objetivos

Ao trmino desta unidade, o aluno dever ser capaz de:

a) Diferenciar colnias de bactrias, leveduras e fungos filamentosos.
b) Diferenciar as clulas de bactrias das de leveduras (forma, tamanho, etc).
c) Saber as caractersticas morfolgicas coloniais utilizadas na identifica o de leveduras.
d) Interpretar os testes fisiolgicos / bioqumicos utilizados na identifica o de leveduras.

Atividade

a) Escolher uma levedura a ser identificada e trazer para a bancada de trabalho todas as placas
de Petri e tubos inoculados com a levedura escolhida.
b) Observar a morfologia colonial da levedura escolhida.
c) Fazer colorao simples da levedura (cristal de violeta) e observar a morfologia celular ao
microscpio.
d) Observar a morfologia de todas as leveduras a serem identificadas pela turma.
e) Interpretar os testes fisiolgicos / bioqumicos da levedura escolhida.

FERMENTAO: Nem toda levedura fermentadora. As capazes de fermentar acares

produzem gs dentro dos tubos de Durham.

ASSIMILAO: A assimilao de fontes de carbono e de nitrognio interpretada atravs da

turvao do meio de cultura, causada pelo crescimento da levedura. Para evitar resultados
falso-positivos, a levedura deve ser previamente inoculada em gua destilada estril (esgotar
reservas nutritivas endgenas) antes da inoculao nos meios de cultura respectivos. O grau de
turvao visto com auxlio do carto de Wickerham. Turvaes de grau 2 ou 3 so interpretadas
como assimilao positiva.
f) Identificar a levedura escolhida utilizando uma chave de identificao.