Introduccin

Desde hace muchos aos se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias qumicas; al
reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiacin se puede estudiar la absorcin de sustancias,
no solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina
espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un sistema qumico en
funcin de la longitud de onda de la radiacin, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. La
teora ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es un flujo de cuantos de energa
llamados fotones; la luz de una cierta longitud de onda est asociada con los fotones, cada uno de los
cuales posee una cantidad definida de energa.
El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas para absorber radiaciones,
entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que
una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atmica y
de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha
tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas.

ESPECTOFOTOMETRO
Transmitancia: (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la cantidad de luz transmitida que
llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz que incidi sobre ella, Io. La
transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad incidente y transmitida al pasar por la
muestra. La relacin entre %T y la concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica
inversa.
b
Io

Solucin absorbente de concentracin C

Absorbancia Io/I

Transmitancia I/Io

La figura muestra un haz de radiacin paralela antes y despus de que ha pasado a travs de una capa
de solucin que tiene un espesor de b cm y una concentracin c de una especie absorbente.

Como consecuencia de interacciones entre los fotones y las partculas absorbentes, la potencia del haz
es atenuada. La transmitancia T de la solucin es entonces la fraccin de la radiacin incidente
transmitida por la solucin:
T I/Io
La transmitancia se expresa a menudo como porcentaje:
%T= (I/ Io) 100
Absorbancia: (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de
luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia:
La absorbancia A de una solucin se define mediante la ecuacin:
A = log T = log Io/I
La mayor parte de los trabajos analticos se realizan con soluciones de manera que vamos a desarrollar la
relacin que existe entre la concentracin de la solucin y su capacidad de absorber radiacin.
ELEMENTOS DE ESPECTROSCOPIA: LEYES DE LOS PROCESOS DE ABSORCIN DE RADIACIN
En estudios cuantitativos involucrando absorcin de radiacin, se necesita una medida experimental que
pueda caracterizar la cantidad de radiacin electromagntica absorbida por una muestra. Esta cantidad
corresponde a lo que se llama potencia radiante, sea, la cantidad de energa caracterstica de la
radiacin por unidad de tiempo. La unidad de potencia es el Watt, y su magnitud puede variar con la
direccin. As, se hace conveniente definir la potencia radiante como funcin de un plano perpendicular a
la direccin del flujo de la radiacin (Figura 1). Experimentalmente, la radiacin absorbida por una
muestra es determinada comparndose la potencia radiante del haz transmitido en la ausencia de
especies absorbentes, con la potencia radiante transmitida en la presencia de estas especies.

Figura 1 - Haz de radiacin con energa E, incidiendo perpendicularmente en una superficie.

Aunque las medidas experimentales sean realizadas en funcin de la potencia radiante,

usualmente encontramos en la bibliografa informaciones sobre la intensidad de la
radiacin. Estas dos cantidades no corresponden a la misma cosa, pero estn relacionadas
entre s. La Intensidad de radiacin, I, es definida como la razn entre la potencia radiante y
el ngulo slido de incidencia. Cuando el rea iluminada, el ngulo slido y el volumen de
la especie absorbente son pequeos, tal como es el caso de las medidas con fines
analticos, la potencia de la radiacin puede ser tomada como la intensidad.

Figura 2 - Fenmenos involucrados cuando un haz

(monocromtico) de radiacin incide sobre una cubeta
conteniendo una solucin que absorve en la longitud de
onda incidente.

Cuando un haz de radiacin monocromtica, con

intensidad Io, incide sobre una cubeta conteniendo
una solucin, varios fenmenos pueden ocurrir. El
efecto ms significativo ocurre cuando parte de la
radiacin es absorbida por el medio que est siendo
analizado. Sin embargo, este no es el nico efecto
que puede ser observado. Parte de la radiacin
incidente puede ser reflejada, dependiendo de la
especie absorbente o de las diferencias entre el
ndice de refraccin del medio donde la radiacin se
propaga del medio que est sendo analizado
(inclusive por las paredes de la cubeta), al mismo

tiempo que otra parte podr simplemente ser dispersada, en el caso de que el medio no sea transparente
y homogneo.
En consecuencia, la intensidad del haz que es medida despus de atravesar la muestra (intensidad
transmitida, It) ser menor que la intensidad inicial, Io.
Sin embargo, un aspecto sumamente importante, es que todos estos efectos asociados con la intensidad
de radiacin (Figura 2), estn relacionados entre s por una expresin linear descrita por la ecuacin:
Io = Ir + Ie + Ia + It

eq. 1

Io = Intensidad del haz incidente,

Ir = Intensidad del haz reflejado, resultado de las diferencias del ndice de refraccin entre la especie
absorbente y el ambiente,
Id = Intensidad del haz dispersado, resultado de un medio no homogneo (suspensin) y/o de
fluctuaciones trmicas,
Ia = Intensidad del haz absorbido por el medio
It = Intensidad del haz transmitido.
En medidas analticas convencionales, el efecto de reflexin de la radiacin electromagntica, Ir, puede
ser minimizado con el uso de medidas relativas y de cubetas con paredes homogneas con poca
espesura y de caras paralelas. En otras palabras, se preparan dos cubetas, una conteniendo la muestra
que se desea analizar y otra conteniendo todos los componentes de la cubeta anterior, menos la
sustancia de inters. La medida de la intensidad del haz transmitido a travs de la segunda cubeta servir
de referencia para calibrar el instrumento, antes de la medida de la intensidad transmitida a travs de la
cubeta conteniendo el material de inters. Este procedimiento es empleado para descontar los posibles
efectos de reflexin observados en el experimento. De esta forma se puede deducir la necesidad del uso
de cubetas prcticamente idnticas, con paredes de poca espesura y con caras paralelas. El
procedimiento general para calibracin del espectrofotmetro es de fcil ejecucin.
Gran parte de los procedimientos involucrando absorcin de luz, son realizados con soluciones
homogneas y transparentes, de tal modo que la intensidad de la radiacin dispersada, Id, puede ser
considerada despreciable. De esta forma, trabajndose con soluciones homogneas, puede considerarse
que la intensidad de la radiacin incidente est siendo utilizada en dos procesos descritos por la ecuacin:
Io = Ia + It

eq. 2

Las intensidades incidente (Io) y transmitida (It ) pueden ser medidas directamente. Por lo tanto, la parte
absorbida (Ia) puede ser determinada como la diferencia entre Io e It.
Algunas tcnicas analticas, tales como la turbidimetria y la nefelometra, utilizan la propiedad que
presentan determinadas soluciones no homogneas de dispersar la luz. Para tales procedimientos, la
intensidad del haz disperso ser el factor determinante para aplicaciones analticas. En este texto,
particularmente, no sern discutidos los elementos relacionados con la dispersin de luz, apenas aquellos
relacionados a las soluciones homogneas.
Cuando se piensa en evaluar las propiedades de soluciones en funcin de la intensidad de haces de luz,
imagnese inicialmente que este es el tipo de informacin que est intrnsicamente asociado a utilizacin
de luz elctrica o de instrumentos especiales. Sin embargo, al buscarse el origen de los estudios de
absorcin de luz por soluciones, sorprendentemente se encuentra que estos estudios son anteriores al
descubrimiento de la luz elctrica. Eran utilizadas luz solar o luz emitida por llama.
Entre las primeras investigaciones sobre la relacin existente entre las intensidades de radiacin incidente
y transmitida, se destacan los experimentos de Pierre Bouguer (1729) y de Johann Heindrich Lambert
(1760). Estos dos cientficos efectuaron observaciones independientes y verificaron que las propiedades
asociadas al proceso de absorcin de luz pueden ser enunciadas en trminos de dos leyes
fundamentales:
*La intensidad de luz (monocromtica) transmitida por un cuerpo homogneo es proporcional a la
intensidad de luz incidente. Es decir: It = k Io.
*La intensidad de luz (monocromtica) transmitida disminuye exponencialmente con el aumento de la
espesura de la capa del cuerpo homogneo.
La Figura 3 muestra claramente la existencia de este fenmeno, en la rutina del laboratorio, con el uso de
luz solar.
Figura 3 - Solucin de CuSO4 en medio amoniacal, contenida en un matraz. Ntese que la
solucin parece ser ms clara en la regin del ajuste del menisco, debido a que el dimetro del
tubo (espesura de la especie absorbente) es mucho menor que en la parte inferior del matraz.

Esta ley es representada por la ecuacin 3 y puede ser deducida matemticamente

de varias formas:

eq. 3
Donde: e es la base del logaritmo natural y k' el coeficiente de absorcin. Considerndose la
siguientepropiedad matemtica asociada a la potenciacin:
eq. 4
Donde

, se puede convertir el trmino

en

, convirtiendo a la
eq. 5

ecuacin 3 en:

En 1852, August Beer estudi la influencia de la concentracin de soluciones coloridas sobre la

transmisin de luz. La conclusin a la que lleg fue que el valor de a' para una determinada sustancia es
proporcional a su concentracin, es decir:
donde, c es la concentracin y a absortividad ( constante independiente de la concentracin).
La ley de Beer es anloga a la ley de Bouguer - Lambert. Mientras que Bouguer y Lambert estudiaron la
variacin en la absorcin de un haz de luz, en funcin de la variacin de la espesura de la camada
absorbente, Beer hizo el mismo estudio en lo que se refiere a la concentracin de la solucin,
manteniendo la espesura constante. En ambos casos, el resultado es el mismo pues, ya que al variar la
concentracin, o variar la espesura de la solucin a ser atravesada por la luz, esencialmente aumentamos
o disminuimos el nmero de partculas que interaccionan con la radiacin.
Combinndose las ecuaciones 4 y 5, se obtiene la ley bsica da espectrofotometra, sea la Ley Bouguer
- Lambert - Beer, ms conocida como la Ley de Beer:
eq. 6
S la concentracin c estuviera expresada en mol por litro y la espesura de la especie absorbente (en este
caso el camino ptico de la cubeta, b) en centmetros, la constante toma el nombre de absortividad
molar, y el smbolo normalmente empleado para esta cantidad pasa a ser (psilon). La absortividad, es
la ms usada cuando no se conoce la naturaleza del material absorbente (y por lo tanto su masa molar),
siendo la concentracin expresada en gramos por litro. La absortividad molar (e) es preferible cuando se
desea comparar cuantitativamente la absorcin de varias sustancias. Para una misma espesura de
material absorbente (camino ptico), cuanto mayor el valor de e mayor la sensibilidad del mtodo. De este
modo, se puede escribir la ecuacin 6 como:
eq. 7
La absortividad molar, , depende de la sustancia, de la longitud de onda utilizada, de la temperatura y del
solvente. Analizndose la ecuacin 7, se nota que cuanto mayor el valor de , mayor ser el nivel de
absorcin observado y ms sensible el mtodo espectrofotomtrico. Esta es la razn por la cual,
idealmente, se busca trabajar con una radiacin monocromtica, siempre que sea posible,
correspondiente al mximo de absorcin de la especie a ser determinada.
Rearreglando la ecuacin 7 se obtiene:
eq. 8
La relacin It / Io se llama transmitanca y es representada por el smbolo T. As:
eq. 9
Se nota por la ecuacin 9 que la relacin entre T y c no es linear, lo que tiende a dificultar la comparacin
entre diferentes transmitancias y las concentraciones asociadas a ellas. Sin embargo, aplicando
logaritmos a la ecuacin 8 ( 9), se obtiene:
eq. 10

Figura 4 - Representacin
grfica de la Ley de Beer, para
soluciones de KMnO4 en l = 545
nm y un camino ptico de 1 cm.
a) En %Transmitancia [%T
versus c - eq. 9];
b) En Absorvancia [ A versus c eq. 12].

La relacin log10 (Io / It) es llamada de absorbancia por muchos autores de idioma portugus, pero varios
otros prefieren la derivacin del ingls, absorbancia (absorbancia en espaol). Por razones de uso, este
texto utilizar esta ltima alternativa. As, la Ley de Beer puede ser representada como en la Figura 4 y
enunciada simplemente como:
A=bc
eq. 11
o en el caso de no utilizarse la concentracin en mol por litro:
A= bc
eq. 12
Se nota claramente en la ecuacin 12, la relacin lineal entre la absorbancia, A, y la concentracin c. Por
lo tanto, mantenindose el camino ptico constante, se puede determinar la concentracin de una especie
en solucin, a travs de la medida de la absorbancia. En la prctica, es construida una curva de
calibracin (absorbancia versus concentracin), de la especie de inters y la concentracin de la muestra
es determinada a travs de esta.
Para realizarse un anlisis espectrofotomtrico es tambin necesario conocer el espectro de absorcin de
la muestra que se quiere determinar. Esto es hecho para definirse cual es la longitud de onda de la
radiacin incidente, que causar la absorcin mxima de la especie a ser determinada y as obtener la
mejor sensibilidad en su cuantificacin. El espectro de absorcin es obtenido variando la longitud de onda
de la radiacin que incide sobre la muestra y medindose la cantidad de radiacin absorbida en un
espectrofotmetro.
Una otra caracterstica particular de la ley de Beer es la sumatoria de las absorbancias. En muchos casos,
es posible determinar simultneamente dos o ms especies diferentes presentes en una muestra,
utilizndose esta misma ley. Tericamente, esto puede ser realizado desde que no ocurra ninguna
interaccin entre las especies y que el espectro de absorcin observado por la mezcla sea la suma de los
espectros individuales que serian obtenidos en el caso de que slo una de las especies estuviese
presente en la solucin y bajo las mismas condiciones experimentales. En la prctica, estas condiciones
ideales no ocurren, pero sin embargo es posible la determinacin de especies qumicas en una mezcla.
En este caso, para cada longitud de onda, la absorbancia total debida a las especies presentes en la
solucin puede ser expresada como la suma de las absorvancias de cada una de ellas,
Para el caso particular de dos sustancias,

donde A e A son los valores de absorbancia medidas a dos longitudes de onda diferentes, 1 e 2, y
los ndices 1 y 2 representan las dos sustancias diferentes.