La degradacin de tolueno por las enzimas de escisin en orto

Burkholderia fungorum FLU100

Daniel Dobslaw y Karl-Heinrich Engesser *

Departamento de Residuos Biolgico de purificacin de aire, Instituto
de Ingeniera Sanitaria y Calidad del Agua Residuos Slidos
Gestin de la Universidad de Stuttgart, Bandtle 2,
Stuttgart, D-70569, Alemania.

Sumario
Burkholderia fungorum FLU100 oxida simultneamente
cualquier mezcla de tolueno, benceno y monohalogen
bencenos a (3-sustituido) con catecoles
una selectividad de casi el 100%. Metabolismo ms
producido a travs de las enzimas de las vas de escisin orto
con la mineralizacin completa. Durante la transformacin
de 3-metilcatecol, 4-carboximetil-2metilbut-2-en-4-olida (2-metil-2-enelactone, 2-ML)
acumulada transitoriamente, siendo an ms mineralizada
slo despus de una fase de retardo de 2 h en el caso de las clulas preadultos

el benceno o mono-halgenas bencenos. No lag

fase, sin embargo, se produjo despus de un crecimiento en tolueno.
Los cultivos inhibidos por cloranfenicol despus del crecimiento
en benceno o mono-halgeno bencenos fueron incapaces
para metabolizar 2-ML suministra externamente, incluso despus de
incubacin prolongada. Una cultura de control cultiva con
tolueno no mostr ninguna fase de latencia y se usa 2-ML como
un sustrato. Esto significa que 2-ML es un intermediario
de la degradacin de tolueno y convertida por especfica
enzimas. La conversin de 4-metilcatecol como una
muy menor subproducto de la degradacin del tolueno en
cepa FLU100 result en la acumulacin de
4-carboximetil-4-metilbut-2-en-4-olida (4-metil2-enelactone, 4-ML) como un producto sin salida, excluyendo
su naturaleza como un posible intermedia. Por lo tanto, 3metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, 3-metilcatecol,
Muconate 2-metilo y 2-ML fueron identificados como
intermedios centrales de escisin orto productiva
vas para el metabolismo de tolueno en B. fungorum
FLU100.

Introduccin
Debido al uso generalizado de alquilo, as como halgeno
bencenos como reactivos y disolventes en la industria qumica,
pertenecen al top ten de las ms frecuentes que aparecen

contaminantes en el agua y el suelo (UBA, 2013). Biolgica

descontaminacin de estos sitios es altamente interesante
debido a sus bajos costos y carcter "baja tecnologa"
(Christodoulatos et al., 1996; Johnson y Odencrantz,
1,999; Kao y Borden, 1999; Smul Sachsen, 2000; Kao
y Prosser, 2001; Kao et al., 2006; Farhadian et al.,
2008). En contraste, la degradacin de ccteles de contaminantes
todava es problemtica (Corseuil et al., 1998; Lovanh
et al., 2002), particularmente con respecto a las mezclas de chloroand
compuestos aromticos sustituidos con metilo.
El clorobenceno es el mono-halgeno ms ampliamente utilizado
benceno. Se convierte en primer lugar (cloro-) catecoles
como intermediarios centrales va dioxigenacin del
anillo aromtico que forma chlorocyclohexa-3,5-dieno-1,2-dioles
(Reineke y Knackmu, 1984;. Beil et al, 1997), a travs de dos
sucesivas monooxygenations producen clorofenoles
como productos intermedios, o por medio inicial (Yen et al., 1991)
formando fenol deshalogenacin (Zhang et al., 2011).
Chlorocatechols generalmente se transforman adicionalmente por
intradiol (orto) la escisin del anillo formando cloro-cis / cismuconates
(Dorn y Knackmu, 1978; Schlmann,
1994; Reineke, 1998; Zerlin, 2.004; Grning et al.,
2012). La posterior conversin se lleva a cabo por una
chloromuconate cycloisomerase formando directamente dienelactone
Con intermediario (-en-4-olides 4-carboxymethylenebut-2)
deshalogenacin (Schmidt et al, 1980;. Kuhm

et al., 1990; Vollmer et al., 1994; Vollmer y Schlmann,

1995; Reineke, 1998), o indirectamente a travs de chloromuconolactones
y la subsiguiente deshalogenacin (Vollmer et al.,
1994; Moiseeva et al., 2002; Skiba et al., 2002; Nikodem
et al., 2003; Grning et al., 2012). Los dienelactones son
ms escindido hidrolticamente a malelo ser acetato
reducida en el siguiente paso para 3-oxoadipate, un centro de
metabolito de la va 3-oxoadipate (Reineke, 1998).
La degradacin de fluorobenceno, bromobenceno y
yodobenceno procede de una manera similar a la degradacin
de clorobenceno (Strunk, 2000; 2007;. Carvalho et al,
2006; 2007; 2009; Strunk et al., 2006; Moreira et al.,
2013; Strunk y Engesser, 2013).
Tolueno como ampliamente utilizado aromtico sustituido con alquilo
ya sea compuesto se convierte en methylcatechols, catecol o 3,4dihidroxibenzoato como productos intermedios centrales.
Formacin de methylcatechols - similar a
chlorocatechols - se lleva a cabo ya sea a travs de dioxigenacin
el anillo aromtico formando metilciclohexa-3,5-dieno-1,2diolefina (Gibson et al, 1974;. Zylstra et al., 1988; Warhurst
et al., 1994; Cho et al., 2000; Kim et al., 2002; Cafaro
et al., 2005; Chaikovskaya et al., 2008) oa travs de dos sucesivos
monooxygenations con cresoles como intermedios.
En segundo lugar, el tolueno puede ser transformada a travs de la cadena
lateral catecol
oxidacin formando alcohol benclico, benzaldehdo y
benzoato como productos intermedios (Worsey y Williams, 1975;

Harayama, 1994). Por ltimo, la transformacin de tolueno para 3,4dihidroxibenzoato a travs de p-cresol y 4-hidroxibenzoato
Tambin se ha descrito (Richardson y Gibson, 1984;
Escudos et al., 1989; Kaphammer et al., 1990; Yen et al.,
1.991). Posteriormente, methylcatechols suelen ser mineralizada
por extradiol (meta) la escisin del anillo (Hou et al., 1977;
Taeger et al., 1988; Reineke, 1998).
Mientras que la mineralizacin de alquilarse o halogenado
aromticos como sustratos nicos es no crtica con la mayora
bacterias, mezclas de esos compuestos son difcilmente biodegradable,
basado preferentemente en la incompatibilidad de
itinerarios individuales con potencial de formacin de reactivo
intermedios en caso de la va de escisin meta
(Klecka y Gibson, 1981; Knackmu, 1981; Bartels
et al., 1984; Rojo et al., 1987; Pettigrew et al., 1991). Slo
unas pocas cepas son capaces de hacer frente a sustituido clorocatecoles travs de la va de escisin de meta. No obstante, en
la mayora de estas cepas, la inactivacin de la meta
pyrocatechase solamente se compensa parcialmente por la reactivacin
o caro continuar la sntesis de novo (Oldenhuis
et al., 1989; Haigler et al., 1992; Arensdorf y Focht,
1994; 1995; Hollender et al., 1994; 1997; Wieser et al.,
1994; Heiss et al., 1997; Marte et al., 1997; 1,999;
Franck-Mokross y Schmidt, 1998; Kaschabek
et al., 1998; Riegert et al., 1998; 1,999; Gbel et al.,
2004).

La segunda alternativa para mineralizar mezclas de alkyland

compuestos aromticos sustituidos con halgeno es degradar no slo
los catecoles halogenados, sino tambin-alquilo sustituido
compuestos aromticos como el tolueno a travs de vas orto. El orto
la escisin de methylcatechols como una reaccin individual
fue descrito colector en la literatura. Por ejemplo,
4-metilcatecol se convirti en 4-carboximetil-4metilbut-2-en-4-olida (4-metil-2-enelactone, 4-methylmuconolactone,
4-ML) es un metabolito sin salida en
la mayora de las cepas que poseen vas de escisin orto
(Catelani et al, 1971;. Rojo et al, 1987;. Sovorova
et al., 2006; Marn et al., 2010). Sin embargo, Cupriavidus
necator JMP134 (Pieper et al., 1985; 1,988; 1,990;
Bruce et al., 1989), Rhodococcus opacus 1CP
(Sovorova et al., 2006) y Pseudomonas knackmussii
B13 FR1 (pFRC20p), una cepa genticamente modificada
(Rojo et al., 1987), fueron capaces de eludir esta botella
cuello por una enzima isomerasa, cambiando el metilo
grupo de 4-posicin a la posicin 3 con el fin de conseguir
3-methylmuconolacton (4-carboximetil-3-metilbut-2en-4-olida), que era un sustrato de crecimiento para cada
cepa.
Sin embargo, el principal obstculo para la degradacin de
tolueno a travs de reaccin de escisin orto es el hecho de que
principalmente 3-metilcatecol se forma como un intermedio de
la oxidacin del anillo. Este intermedio es mayor

transformado a 2-metil-cis, cido cis-mucnico seguido de

formacin de 4-carboximetil-2-metilbut-2-en-4-olida
(2-metil-2-enelactone, 2-methylmuconolactone, 2-ML),
que con frecuencia se ha descrito a ser un callejn sin salida
metabolito.
Hasta ahora, slo unos pocos autores describieron una productiva
mineralizacin de 2-ML. Taeger et al. 2-ML utilizado como sustrato
para enriquecimientos obtencin de cepas bacterianas totalmente
mineralizacin 2-ML. Sin embargo, la exposicin de estas cepas
a 3-metilcatecol, enzimas de escisin de la meta
va fueron inducidos (Taeger et al., 1988). Pettigrew
et al. encontrado un mutante de Pseudomonas sp. JS150, llamado
JS6, que tena un defecto en la catecol-2,3-dioxigenasa
y por lo tanto era incapaz de escindir 3-metilcatecol por
va meta (Pettigrew et al., 1991). Adems,
3-metilcatecol era mineralizada por un orto modificado
Camino con 2-ML como intermedio. Sin embargo, tolueno
hubo inductor de esta va orto y la cepa nativa
mineralizacin preferido de tolueno por escisin meta
va. Resultados similares fueron encontrados con Ralstonia sp.
PS12 (Lehning, 1998). Franck-Mokross y Schmidt
inform acerca de la cepa de Pseudomonas sp. D7-4
siendo capaces de degradar m-toluato productivamente a travs
3-metilcatecol y 2-ML mediante el uso modificado orto
enzimticos (Franck-Mokross y Schmidt, 1998).
Sin embargo, 2-ML acumula temporalmente y era an ms

mineralizado despus de una fase de latencia que dura unos pocos horas.
Consistentemente, esta cepa no fue capaz de mineralizar
tolueno.
Hemos descrito previamente la cepa Burkholderia
fungorum FLU100 poder mineralizar todas monohalogenado
bencenos, benceno y tolueno como pura
sustancias por una va de escisin orto (Strunk, 2000;
2007; Dobslaw, 2003; Strunk et al., 2006; Strunk y
Engesser, 2013). Hemos postulado 2-ML como intermedio de
la va de degradacin tolueno.
En el presente artculo, mostramos los datos claramente demostrando
2-ML como el principal producto intermedio en la produccin
degradacin de tolueno por escisin orto modificado
enzimas as como la capacidad de la cepa para FLU100
degradar mezclas de benceno, tolueno y monohalogen
bencenos simultneamente. Para nuestro conocimiento,
esta es la primera descripcin de una funcional, no ingenieril
orto va para la degradacin total de
tolueno.

Resultados y discusin
La degradacin simultnea de mezclas de
compuestos aromticos
Fungorum Burkholderia FLU100 fue capaz de degradar cualquier
mezcla de los compuestos aromticos benceno, tolueno,
fluorobenceno, clorobenceno, bromobenceno, as como

yodobenceno simultneamente presentado como suela de carbono

fuente sin observar una fase de latencia. El aumento de la
nmero de compuestos, la transformacin-sustrato especfico
tasas disminuyeron. Sin embargo, la suma de la especfica
tasas de transformacin se quedaron casi constante durante cada
serie de pruebas. Por lo tanto, la transformacin de cada sustrato parece
para ser llevada a cabo por el mismo dioxigenasa inicial previamente
descrito (Strunk y Engesser, 2013).
Los extractos de medios de cultivo con 0,25% FLU100
dimetilformamida (DMFA) y 2 a 3 mmol l-1 aromtico
compuestos como concentraciones de inicio mostraron transformacin
tasas de entre 90 y 120 mg l-1 C-1 h-1 OD
Y
180 mg l-1 C-1 h-1 OD al mximo en caso de ptima
condiciones de induccin (Apoyo a la Informacin Tabla S1).
Muestras acuosas sin DMFA, analizados por un alto
cromatografa lquida - sistema con
UV / detector de luz visible (HPLC-UV / VIS), revel tasas de hasta
a 280 mg l-1 C-1 h-1 OD en el caso de tolueno como suela de carbono
fuente que muestra el efecto txico de DMFA. Sin embargo, el
tasas de transformacin-sustrato especfico reflejan diferencias
en la afinidad de la enzima por diferentes sustratos
(en mg l-1 C-1 h-1 OD
: Tolueno, 280; benceno, 178;
fluorobenceno, 127; clorobenceno, 159).
Como se muestra, la mxima velocidad de transformacin especfico para

tolueno con FLU100 en caso de concentraciones variables de

tolueno fue 280 mg l-1 C-1 h-1 OD y se mantuvo estable
con la disminucin de las concentraciones de tolueno a 60 mg
tolueno l-1
. De esta manera, un valor de Ks de 30 mg tolueno l-1 poda
ser calculado.
Influencia del valor del pH en el comportamiento de la mineralizacin
de tolueno
La transformacin de altas cantidades de tolueno, benceno o monohalogen
bencenos como sustratos nicos, as como en cualquier
mezcla, los sobrenadantes de cultivo y las clulas se tieron de FLU100
negro. Esto es debido a una polimerizacin dependiente del pH bien conocida
de (sustituido) catecoles tan pronto como que estn siendo
acumulada. Por lo tanto, la tasa de escisin de catecoles es una
cuello de botella en la va de degradacin de estos compuestos aromticos
impidiendo arriba-escala para aplicaciones a gran escala. La cantidad
de productos polimerizados fotomtricamente fue analizado
reducida mediante la reduccin del valor del pH del medio de cultivo
a partir de 7.15 a 5.0. En consecuencia, HPLC correspondiente
anlisis mostraron un incremento en la concentracin de
2-methylmuconate (Apoyo a la Informacin Fig. S1) como
as como un metabolito siendo desconocido con mayor lipofilia
de 3-metilcatecol. Obviamente, bajo este rgimen,
mayores cantidades de metilcatecol podran ser enzimticamente
metabolizado sin sufrir autooxidacin qumica.
Relaciones de captacin de oxgeno-sustrato especfico

Strain FLU100 degrada un amplio espectro de compuestos aromticos,

favoreciendo una amplia aplicacin en la biorremediacin posible.
El potencial de oxidacin de las enzimas iniciales se caracteriz
mediante la medicin de las tasas especficas para la absorcin de oxgeno
diferentes fuentes de carbono en dependencia de fluorobenceno,
tolueno y benceno como sustratos pre-cultivo, permitiendo
para juzgar el nmero de enzimas iniciales mediante el anlisis de
las tasas de transformacin mximas relativas. El correspondiente
Los resultados se muestran en la informacin de apoyo
Tablas S2 y S3. Todos los resultados estn estandarizados para el tolueno
o catecol como 100%, respectivamente. Estos datos estn dando
el resultado promedio de varios experimentos independientes
cada uno realizado por doble.
Con la excepcin del valor de fluorobenceno en
fluorobenceno clulas cultivadas, las actividades especficas relativas
para cada sustrato fueron casi independiente de la precultivo
condiciones. Por lo tanto, la misma inicial oxigenasa
parece estar inducida independientemente de la naturaleza de
diferentes derivados de benceno. Como nicas actividades bajo posible
medirse con los derivados de fenol probados, as como
con alcohol benclico y benzoato, la enzima inicial ms
probablemente es una dioxigenasa oxidante directamente con el aromtico
anillo. No hay actividad para la oxidacin de la cadena lateral, que es una
posible
, no se observ reaccin en el caso de tolueno. Actualmente,
no tienen ninguna prueba para explicar la mayor actividad de fluorobenceno
despus del crecimiento en fluorobenceno. La existencia de una especial

sistema de transporte para fluorobenceno en las clulas inducidas

por fluorobenceno es la explicacin ms probable.
En contraste con la dioxigenasa inicial, la absorcin de oxgeno
los valores de las enzimas de escisin dependen fuertemente de catecol
el tipo de sustrato de crecimiento. La captacin absoluta de oxgeno
de casi 2.100 U en el caso de las clulas pre-cultivan en
fluorobenceno era 10 veces mayor que el medido para
clulas tolueno y 20 veces mayor que la de las clulas crecidas con
anterioridad
en benceno (ver informacin de apoyo Tabla S3).
Esto intensifica la expresin de la escisin catecol
enzimas en caso de fluorobenceno pueden reflejar y compensar
las actividades relativas ms bajas para la escisin del anillo de
3-fluorocatechol con el fin de evitar su acumulacin y
autooxidacin.
En general, muconates se describen como inductores de
catecol vas de escisin orto (Feist y Hegeman,
1969). De acuerdo a la literatura, a 2 halomuconates son
inductores fuertes de la va chlorocatechol modificado
de 2-methylmuconate o no sustituido muconate
(Reineke, 1998). Sin embargo, la comparacin de la relacin
actividades para muconates en clulas pre-cultivan en fluorobenceno
o tolueno, respectivamente, mostraron una alta similitud. En Por el contrario,
se encontraron las clulas cultivadas en benceno a fuertemente
desviarse de este patrn, lo que indica la presencia de una
va orto adicional, ser demasiado especfico para tolerar
sustituyentes voluminosos en los sustratos. Por lo tanto, es tolueno

transformado principalmente por la va orto modificado con

chlorocatechol-1,2-dioxigenasa como la enzima inicial, seguido
por una enzima de amplio especificidad como chloromuconate
cycloisomerase.
La prueba de la naturaleza de la enzima dioxigenasa inicial
acumulacin de sus productos
La existencia de una enzima dioxigenasa inicial fue tambin
a prueba por un transposn mutante de la cepa FLU100, llamado
FLU100 P2R5 (Strunk, 2007), donde el transposn
se insert dentro del elemento de benceno dihydrodioldehydrogenase
que codifica la secuencia del gen. Durante el volumen de negocios
de tolueno, la 3-metilciclohexa-3,5- correspondientes
dieno-1,2-diol acumulada en el sobrenadante. Esta
diendiol se puede volver a aromatizado tambin qumicamente por el calor
tratamiento para 5 min en condiciones cidas produciendo el
o-cresol correspondiente cuantitativamente. Para todos monohalogen
bencenos, tolueno y benceno, el correspondiente
diendiols se transformaron en compuestos fenlicos,
que fueron identificados y verificado por comercial
normas.
En segundo lugar, se produjeron las mismas estructuras diendiol
por Escherichia coli pST04, un anlogo de la cepa
pSTE44, que contena regulado opern lac un
dioxigenasa tetraclorobenceno. Esta cepa, as como
los productos de la transformacin fue anteriormente descritos en
literatura con ms detalle (Pollmann et al., 2003). Esta

establece claramente la naturaleza de 3-metilciclohexa-3,5dieno-1,2-diol para ser el director intermedia del

oxidacin de tolueno en FLU100 despus del crecimiento con
tolueno.
Por otra parte, el uso de FLU100 P2R5, hemos sido capaces de
producir y aislar estas estructuras diendiol para los seis
sustratos aromticos (para estructuras diendiol de benceno,
tolueno y fluorobenceno, ver informacin de apoyo
Fig. S2) y, adems, los utilizaron como sustratos en la conversin
experimentos. Se sigui el proceso de conversin
por anlisis de HPLC. Durante la conversin de la
3-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, por ejemplo, un temporal
acumulacin de otros intermedios de tolueno
la degradacin, a saber, 3-metilcatecol, 2-metil-cis, cismuconic
cido, as como 2-ML se observ, de nuevo proponer
el camino del metabolismo de tolueno para seguir la ruta
para-halo benceno degradacin hasta el nivel de metilo
lactona.
La tasa de conversin del compuesto en comparacin diendiol
con tasas de conversin de 3-metilcatecol,
cido 2-methylmuconic y 2-ML era extremadamente alta. En
caso de 3-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, casi
0,6 mmol l-1 del sustrato, equivalentes al 50% de la
concentracin suministrado, se convirti biolgicamente a la
catecol correspondiente dentro de 5 min (Fig. 1). Porque
retrasos de HPLC anlisis, la tasa de conversin de

diendiol entre la segunda y tercera mediciones

fue trasladado a la Tabla 1, que muestra la conversin absoluta
tarifas de todos los sustratos y productos intermedios relevantes para las
clulas
pre-crecido en tolueno.

GRAFICA
Identificacin de 3-metilcatecol y 2-metil-cis /
cido como otros intermedios cis-mucnico del tolueno
va de degradacin
Catecoles correspondientes se formaron fuera de la
intermedios diendiol por deshidrogenacin utilizando viable
las clulas (Fig. 1). La identificacin se realiz utilizando una
cromatgrafo de gases con un espectrmetro de masas como detector
(GC-MS) y el anlisis del concentrado orgnico
fase despus de una extraccin con acetato de etilo tres veces
as como la metilacin de la fase orgnica con
diazometano. Para tolueno, 3-metilcatecol (antes
metilacin) y 2-metoxi-3-metilfenol (despus de
metilacin) se identificaron mediante el uso disponible comercialmente
compuestos estndar (informacin de apoyo
Tabla S4).
Los catecoles de los seis sustratos se escindieron por una
orto va escote y sin actividad de escisin meta
fue observado. Medicin de la absoluta y relativa
actividades de conversin de clulas enteras, as como el crudo

extractos de FLU100 cepa mostraron un patrn de actividad

con una baja similitud con el patrn en la conversin
P. knackmussii B13 (Dorn y Knackmu, 1978). En
Por el contrario, el patrn de actividad de FLU100 revel alta
similitud con el patrn de actividad tpico para chlorocatechol1,2-dioxigenasa de B13 readoptado por los autores
(Dobslaw, 2003).
A pesar de que la cepa FLU100 es capaz de metabolizar
4-sustituidos catecoles, el principal, casi exclusivamente
productos de transformacin formados de los derivados del benceno
examinados en este estudio son los correspondientes
Catecoles 3-sustituido. Estos catecoles son ms
escindido a los correspondientes (2-sustituido) cis-cismuconic
cidos. Estos cidos mucnico fueron identificados por
comparacin de tiempos de retencin y espectros de longitud de onda
con sustancias de referencia producidas por E. coli Klon 4,
llevar plsmido pBBRCI, a partir del correspondiente
catecoles. Este mutante expres chlorocatechol-1,2dioxigenasa regulado por un opern lac y anteriormente fue
descrito (Prez-Pantoja et. al, 2003).
La naturaleza intermedio de 2-en methylmuconolactone
la va de degradacin de tolueno de FLU100
Mientras 2-halogenados mucnico cidos se pueden transformar
de trans-dienlactone durante la formacin del anillo de lactona /
eliminacin de haluro por muconate-cycloisomerases (ver
por ejemplo Vollmer et al., 1994; Vollmer y Schlmann,

1995; Reineke, 1998; Moiseeva et al., 2.002), 2cido methylmuconic como intermedio de tolueno no puede ser
transformado de esta manera, debido a que el grupo metilo no es
grupo saliente en absoluto. Se observ que la cycloisomerase
transformado cido 2-methylmuconic a
2-methylmuconolactone (2-ML), que era ms mineralizado.
No haba indicios de la existencia de un
exocclico 5-methylmuconolactone, un posible producto de
cicloisomerizacin alternativa de cido 2-methylmuconic.
En contraste con la cepa Pseudomonas sp. D7-4 (FranckMokross
y Schmidt, 1998; Taeger et al., 1988;) y
otras cepas obtenidas por el enriquecimiento, el 2-ML y
3-metilbenzoato de metilo (Taeger et al., 1988), que tambin eran
capaces de mineralizar 2-ML, cepa FLU100 fue capaz de crecer
en tolueno como nica fuente de carbono y energa.
Sin embargo, la transformacin de 3-metilcatecol por las clulas de
FLU100 tensin pre-cultiva en benceno o monohalogen
bencenos, casi el 55-65% de la prevista
3-metilcatecol acumula temporalmente como 2-ML.
Adems transformacin se observ despus de una fase de latencia de
2-3 horas (Fig. 2). Por el contrario, no hay o slo pequeas concentraciones
de 2-ML acumulado en caso de tolueno-inducida /
clulas en crecimiento (Fig. 3). Esto significa que las enzimas clave para
degradacin de 2-ML solamente fueron inducidos despus de la adaptacin
en tolueno, pero no en benceno o mono-halgeno
bencenos.

Para probar esta interpretacin y para evitar la induccin de

nuevas enzimas, los mismos experimentos se realizaron despus
adicin de cloranfenicol (CAP) como un inhibidor de
sntesis de protenas. Las clulas inducidas con benceno o monohalogen
bencenos mostraron concentraciones similares de
2-ML acumular en el sobrenadante en comparacin con
clulas no inhibido. Sin embargo, ninguna otra transformacin

GRAFICA
aparecido, incluso despus de una incubacin prolongada (Fig. 2). En
Por el contrario, no se detect acumulacin de 2-ML cuando
clulas utilizadas fueron inducidos previamente con tolueno (Fig. 3).
En un segundo experimento, una solucin acuosa de
2-ML fue producido por la transformacin completa de
3-methycatechol por las clulas de FLU100 crecido en benceno,
seguido de la posterior separacin de las clulas. El final
concentracin de 2-ML se ajust a aproximadamente 1,7 mmol l-1
.
Esta solucin se dividi y se aade a dos cultivos lquidos de
FLU100 tensin pre-cultiva en tolueno. Una de estas culturas
se ha complementado con la PAC. Ambos cultivos
transformado 2-ML sin mostrar fase de latencia en la transformacin
tasas de 0,35 mmol l-1 h-1 OD-1 (cultivo sin PAC) y
0,17 mmol l-1 h-1 OD-1 (con CAP), respectivamente. La transformacin
tarifa sin CAP fue dos veces mayor, porque
la formacin de nuevas enzimas era posible (Fig. 3). Los

resultados de ambos conceptos experimentales confirmaron la

induccin de enzimas que transforman 2-ML-especficas en caso
de las clulas de FLU100 tolueno-metabolizar.
2-ML como metabolito se identific por HPLC-MS y
GC-MS anlisis e identidad estaba a prueba por comparacin
con los datos de Knackmu y colegas (1976) y
Pieper y sus colegas (1985), dan en la Tabla 2.
Una ruta alternativa terica para dioxigenacin tolueno
en posicin 3,4, es decir, en meta y posicin para la formacin
4-metilciclohexa-3,5-dieno-1,2-diol, 4-metilcatecol,
3-metil-cis, cido cis-4-mucnico y ML como productos intermedios,
se encontr que era no productiva. Metabolismo de cido 4metilcatecol, aadido a las clulas enteras de FLU100, conducir a
acumulacin estequiomtrica de 4-ML como un callejn sin salida
metabolito (datos no mostrados). 4-ML en s, as como
Metil ster de 4-methylmuconolactone como producto de reaccin
despus de metilacin fueron identificados por GC-MS anlisis (ver
Tabla 2).

GRAFICA
Para identificar otros intermedios de 2-ML degradacin
va, los anlisis se realizaron mediante el uso de HPLCs con
un detector de dispersin de luz por evaporacin (HPLC-ELSD) o
un espectrmetro de masas (HPLC-MS). Sin embargo, ni
metabolitos de degradacin de 2-ML eran reproducible

identificacin detectable ni de compuestos detectados era

posible. Succinato de 2-metilo como hipottica intermedia
de la va de degradacin 2-ML, sin embargo, se utiliz como
un sustrato en experimentos de conversin. Considerando que la
referencia
succinato de sustrato se transform sin
mostrar ninguna fase de latencia, metilo sustituido succinato era
no se convierte en absoluto por las clulas enteras de FLU100 (ver
Apoyo
Tabla de Informacin S5). Por lo tanto, la revelacin de la
completa va de degradacin aguas abajo del intermedio
2-ML no tuvo xito. Conversin mxima
las tasas de los intermedios identificados de la degradacin de tolueno
por FLU100 pre-crecido en tolueno se dan en la Tabla 1.
La va de degradacin de la correlacin se muestra en la Fig. 4.
Observaciones finales
Cepa fungorum Burkholderia FLU100 demostr mineralizar
tolueno sola y simultneamente en cualquier mezcla
con benceno y bencenos mono-halgeno, incluso incluyendo
fluorobenceno. El ataque inicial en todos estos sustratos
por una dioxigenasa atacar el anillo aromtico
producido en el correspondiente 3-sustituido cyclohexa3,5-dien-1,2-dioles, que se metabolizan a travs de una deshidrogenasa
a las correspondientes 3- (sustituidos) catecoles.
Estos catecoles se escindieron casi exclusivamente por un
chlorocatechol-1,2-dioxigenasa al cido mucnico

derivados. Sobre la base de la falta de actividad de escisin meta,

tolueno se atpicamente escindido por esta enzima orto resultante
en la formacin de cido 2-methylmuconic, seguido de
2-metil-2-eno-lactona (2-ML) como los siguientes pasos. En contraste
a la literatura, este ltimo intermedio no es un callejn sin salida
metabolito. La mayor degradacin de 2-ML by hasta ahora
enzimas desconocidas, inducidas por el crecimiento con tolueno,
queda an por esclarecer.
Procedimientos experimentales
Las condiciones de cultivo de FLU100 (tipo salvaje
y mutantes)
Wild tipo de FLU100 cepa se cultiv a 30 C en 500 ml
frascos de vidrio que contienen 200 ml de un medio de sal mineral
previamente
descrito (Dobslaw, 2003). Cerca de 20 l de tolueno,
benceno o mono-halgenas bencenos se aadi directamente a
este medio y los matraces se incubaron durante 48-72 h. Despus
aadiendo 10-15 l de sustrato, los cultivos se incubaron adicionalmente
durante la noche y se recogieron por centrifugacin. El sedimento se
se resuspendieron en medio fresco.
El P2R5 mutante de FLU100 cepa se obtuvo a travs de
transposn mutagnesis por apareamiento con el destinatario FLU100
la cepa donante de E. coli pCro2a (ONACA et al., 2007) y
proyeccin de casi 16 800 mutantes. El plsmido lleva una
gen de resistencia a ampicilina para la deteccin de falsos positivos,

mientras que la pieza de insercin Tn5 lleva un gen de resistencia a

kanamicina
y una secuencia ori. Los mutantes se seleccionaron por difusin
las clulas en placas de medio minerales que contienen 10 mmol l-1
glucosa y 100 mg l-1 de kanamicina. Colonias crecido eran
transferido a cultivos lquidos (20 ml de volumen) con el mismo
medio. La acumulacin de los productos intermedios de la degradacin
aromtico
se comprob mediante la adicin de 10 l de tolueno u otro
compuesto aromtico y 200 l de una solucin de glucosa 1 M
despus de 48 h. Formacin de intermedios se verific la siguiente
da a travs de anlisis por HPLC.
Para la cuantificacin de las concentraciones de compuestos aromticos
restantes
en el medio lquido a travs de la extraccin y el anlisis de CG
posteriores,
mezclas de compuestos aromticos se suministran en DMFA
con concentraciones finales de 2 a 3 mmol l-1 y compuestos aromticos
0,25% DMFA en el medio de cultivo. Se realiz extraccin
usando diclorometano.
En el caso de experimentos de absorcin de oxgeno, el sedimento se
resuspendieron en medio mineral fresca y de cultivo se
se agita a 30 C durante la noche sin suministro de sustratos. Como
preparacin, el cultivo se airea, muestras de 3 ml de
la suspensin se introdujeron en un agitador templado 30 C y
la captacin de oxgeno se registr. Para la medicin de la

la absorcin de oxgeno-sustrato especfico, 30 l de una solucin de

sustrato
(c = 0,1 mol L-1
) fue aadido.
En el caso de experimentos extracto crudo, el centrifugado
pellets de FLU100 cepa, P. knackmussii B13 o E. coli
Klon 4, se lavaron dos veces con solucin salina y
re-suspendido en 15 ml de una solucin tampn Tris (8 gl-1
Tris, pH 8,0). Las clulas fueron rotas por la liberacin de presin en
dos o tres carreras en una celda de presin francesa con 10 000 psi.
El extracto se centrifug durante 10 min a 14 000 rpm a 4 C
y el sobrenadante libre de clulas se almacen en hielo. En la conversin
pruebas de catecoles, 100 l de extracto crudo se
aadi a 1 ml de tampn Tris pH 8,0, y 900 l de desionizada
de agua y 26 l de cido etilendiaminotetraactico
(c = 0,1 mol L-1
) En unos 4 ml fusionados cubeta de slice. Despus de la aireacin
durante 1 min, 20 l de la catecol probado (c = 0,1 mol L-1
)
se aadi y el cambio en la extincin a 260 nm era
determinar. En caso de alta rotacin, las muestras fueron
medido por anlisis de HPLC a 210 nm y 260 nm
longitudes de onda. La cuantificacin de las tasas de conversin (mol
l
-1 Min-1 mg protena-1

) Se realiz a travs de la medicin fotomtrica

en ola de extincin mximo longitudes usando extincin
coeficientes dados por (Dorn y Knackmu 1978). Los
concentracin de protenas se midi por el mtodo de
Bradford.
Pruebas de conversin de catecoles en clulas enteras de la cepa
FLU100 se realizaron utilizando cultivos con densidades pticas
de OD546nm = 1,5-2,5. Los cultivos se cultivan en primer lugar pre-en
una
sustrato aromtico, se centrifug y resuspendi en nueva
medio mineral. Catecoles relevantes se aadieron en concentraciones
finales
de 3 mmol l-1
. Las concentraciones de catecoles
y los intermedios correspondientes con el tiempo fueron observados por
HPLC anlisis.
2-ML como se obtuvo sustrato para las pruebas de transformacin a
travs de
conversin de 3-metilcatecol por clulas enteras de la cepa
FLU100 pre-crecido en benceno. Directamente despus de
transformacin total
de 3-metilcatecol a 2-ML, mezclas de reaccin se
centrifug y el sobrenadante se utiliz directamente en la posterior
experimentos de conversin como solucin de sustrato acuoso.
La solucin puede ser almacenada a 4 C aproximadamente 1 semana.
Evitar
la induccin de nuevas enzimas durante la transformacin de 2-ML,

Se aadi la PAC como frmaco citosttico (10 mg por 50 ml de reaccin

volumen). Concentraciones reales de 2-ML en los matraces de reaccin
se midieron por anlisis de HPLC.
Las condiciones de cultivo de las cepas de E. coli
Todas las cepas de E. coli fueron pre-cultivan en medios de caldo
lysogeny
que contiene 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g de
cloruro de sodio por litro de agua desionizada. El medio se
en autoclave a 121 C durante 30 min. Con la excepcin de la cepa
pCro2a, se aadieron 2,5 mmol l-1 de la lactosa. Para el cultivo de
pCro2a, 100 mg l-1 de ampicilina y 50 mg l-1 de kanamicina
fueron agregados. En el caso de E. coli Klon 4, 100 mg l-1 de kanamicina
y en caso de E. coli pST04, 100 mg l-1 de ampicilina y
Se aadieron 10 mmol l-1 de glucosa. Los cultivos se cultivaron
a 37 C durante la noche. Despus, los grnulos de pST04 y
Klon 4 se recogieron y se resuspendieron en nuevas LB-media
con los aditivos correspondientes y adicional 0.250,4 mmol l-1 IPTG y 5-10 mmol l-1 de sustrato aromtico
(pST04) o 1 mmol l-1 de catecol (Klon 4). Despus de 4 h, una
significativa
de color azul apareci muestra la expresin del lacregulated
secuencias de genes. La produccin de sustituido
ciclohexa-3,5-dieno-1,2-dioles se midi directamente por
HPLC analiza a 260 nm. Para la produccin de cidos mucnico,
Klon 4 se prepar anlogamente como FLU100 para el crudo
mediciones de extracto.

Las condiciones de cultivo de las cepas de P. knackmussii B13

B13 cepa se cultiv a 30 C en un medio mineral
que contiene benzoato o 3-clorobenzoato como sustrato. Mientras
un catecol-1,2-dioxigenasa se indujo en caso de la
ex sustrato, un chlorocatechol-1,2-dioxigenasa era
inducida en el caso de este ltimo sustrato. La preparacin
fue similar a la de las mediciones de extracto crudo de
FLU100.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer con gratitud la
extremadamente valiosa contribucin de DH Pieper, Helmholtz
Centro de Investigacin de Infecciones en Braunschweig, para
Agradecimientos
Los autores desean reconocer con gratitud la
extremadamente valiosa contribucin de DH Pieper, Helmholtz
Centro de Investigacin de Infecciones en Braunschweig, para tiles
150 D. Dobslaw y K.-H. Engesser
2014 The Authors. Biotecnologa Microbiana publicado por John Wiley
& Sons Ltd y Sociedad para Microbiologa Aplicada, Microbiana
Biotechnology, 8, 143-154
comentarios, as como el suministro de Escherichia coli pST04
y E. coli Klon 4. Un agradecimiento especial a J. Altenbuchner,
Instituto de Gentica Industrial, Universidad de Stuttgart
la oferta de E. coli pCro2a. Finalmente agradecemos a P. Fischer,
Instituto de Qumica Orgnica de la Universidad de Stuttgart, por

GC-MS y HPLC-MS anlisis.