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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUÍZ GALLO

FACULTAD DE MEDICINA
HISTOLOGÍA PRIMERA CLASE 04-03-2010. Dr. Velasco

MÉTODOS DE ESTUDIO DE TEJIDOS Y CÉLULAS

LA HISTOLOGÍA es el estudio de los tejidos al microscopio.

La histotecnología es la ciencia que estudia el conjunto de métodos usados para

preparar tejidos y células, para su análisis en los diferentes tipos de microscopios.
Técnicas de más de 100 años.

Las técnicas histológicas deben ser dirigidas a estudiar una capa muy delgada (micras).

Debe ser estudiada por transparencia en el microscopio, tratando de conservar la forma y

la estructura de la célula.

EVOLUCIÓN DE LA HISTOLOGÍA

• La histología al principio fue una asignatura empírica. Los primeros histólogos

aprendieron una sorprendente cantidad de conocimientos sobre la estructura.

• Descubrimiento del microscopio óptico: HansANS y Zacharías Janssen(

1580-1638), Cornelis Drebbel ( 1572-1633), Anton Von Leuuwenhoek ( 1632-
1723), Robert Hooke ( 1635- 1703) y Marcello Malpigi ( 1628- 1694).

• Robert Hook en 1665 , por primera vez designa “CÉLULA” a celdillas observadas al
estudiar una lámina de corcho.

• Marcelo Malpighi ( 1628- 1694). Corpúsculo renal. Células epidérmicas .

• Schwann ( 1810- 1882). SNP.

• William Bowman ( 1816- 1892). Cápsula renal.

• Virchow (1821-1902) propuso su teoría celular sobre la estructura de los

organismos vivos: “La enfermedad es básicamente celular”.

• Ramón y Cajal (1852-1934): teoría celular en el tejido nervioso, demostró la

individualidad morfológica y genética de las neuronas.

• El primer Microscopio Electrónico: En 1925 por Ernst Ruska ( Alemán) ( 1907-

1988).
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LA HISTOLOGÍA ( anatomía microscópica)

• Estudia la estructura microscópica del material biológico y su relación con los

distintos componentes individuales.

• Los tejidos son organizaciones estructurales y funcionales de las células.

• Tejidos que forman órganos y sistemas: corazón, hígado, riñón, etc.

• Histología moderna: técnicas de actualidad: microscopía electrónica, clonación de

células en cultivo , genética molecular.

• Actualmente podemos explorar las bases moleculares y fisiológicas de las

estructuras biológicas para examinar con el microscopio el aspecto químico de los
tejidos vivos.

• Microscopía electrónica: permite ver en detalle las pequeñas estructuras de las

células, aumentando de forma importante la resolución: composición subcelular de
las células.

• La microscopía electrónica quedó relegada por la microscopía óptica.

LA HISTOLOGÍA Y OTRAS CIENCIAS

• Histología y citología.

• Histología y anatomía ( anatomía microscópica).

• Histología y patología ( alteraciones histológicas).

• Histología en el diagnóstico de enfermedades.

METODOLOGÍA- HISTOTECNOLOGÍA

SELECCIÓN Y OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

- Tipos: biopsias, necropsias, citológicos ( Papanicolaou ), líquidos biológicos
- Biopsias pequeñas y grandes .BAAF
- Origen
- Tamaño
- Forma de la muestra

1. FIJACIÓN
Destinada a inmovilizar las estructuras celulares y tisulares en un estado lo más próximo
posible al estado vivo. Tiene por objeto asegurar una coagulación todo lo homogénea
posible de los geles proteicos intra y extracelulares. Esta coagulación ocasiona un
endurecimiento de los tejidos. Un buen fijador debe tener una penetración rápida y
homogénea, no producir retracción de los tejidos.
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Reglas generales de la fijación

- Lo más precoz posible ( biopsias y necropsias)
- La fijación debe ser rápida ( espesor )
- Líquido fijador abundante ( 30- 40 veces el volumen de la pieza)
- Duración de la fijación

Principales fijadores
- Formol. Formol comercial. Solución concentrada de aldehído fórmico al 40%.
A partir de solución madre, formol al 10%= Formol 10 vol. + agua 90 vol.
FORMOL NEUTRO AL 10 %
Formol (40%) ....................................... 100 ml.
Agua destilada ...................................... 900 ml.
Fosfato de sodio, monobásico .............. 4 g.
Fosfato de sodio, dibásico ..................... 6.5 g.
Uso: pH .................................................. 6.8

- Alcohol (glucógeno). Cloroformo. Acido acético

-Acetona
- Mezclas fijadoras:
Líquido de Carnoy: ( hígado,Bazo)
Alcohol absoluto ......... 6 vol
Cloroformo .............. 3vol
Ac.Acético ................. 1 vol

Líquido de Bouin: Sol. Saturada de ac.pícrico.......30 vol

Formol 40% ...........................10 vol
Ac. acético…………………… ...2 vol

Líquido de Regaud (mitocondria)

Solución acuosa de bicromato de K al 3%.....4 vol
Formol comercial neutralizado...................... 1 vol.

Líquido de Zenker: Bicloruro de mercurio ....................... 5gr

Bicromato potásico ........................ 2.5gr
Sulfato sódico ................................... 1 gr
Agua destilada .................................. 100ml.

Mezcla de Susa : Formol comercial .................................. 5 vol

Ac. tricloracético al 5% ......................... 20 vol
Sol. Acuosa saturada de sublimado ...... 25 vol.

Descalcificación ( Reblandecimiento )
Los tejidos calcificados son de una gran dureza y deben ser desembarazados de sus sales
calcáreas ( fostato y carbonato de calcio).
- Cortar
- Fijar
- Descalcificar: Acido nítrico al 5% en sol acuosa. 7 a 8 % en sol. Alcohólica
Mezcla descalcificante: Ac. tricloracético ................ 10 ml.
Agua .................................. 80 ml.
Formol .............................. 10 ml.
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LAVADO ( post formol ). Agua corriente.

2.-DESHIDRATACIÓN: Alcoholes de menor a mayor concentración ( 70, 80,90,100° ).
Sólo el alcohol absoluto es indispensable en un a laboratorio de patología.
Los alcoholes débiles se obtienen fácilmente a partir del precedente . Tiempos.
3.-ACLARAMIENTO: Xilol. Expulsa el alcohol, disuelve las grasas y deja la pieza
trans-
parente. Tiempos.

4.-IMPREGNACIÓN: parafina , ésta son mezclas complejas de carburos procedentes de

destilación del petróleo; son sustancia blancas, cristalinas, untuosas, insolubles en el
agua y el alcohol, solubles en los hidrocarburos bencénicos.) Parafina en estufa
a 58-60°. 2 a 3 baños ( 2 horas). Importancia del AUTOTECHNICON hasta aquí.

5.- INCLUSIÓN PROPIAMENTE DICHA. Blocajes por solidificación de la parafina. Moldes

especiales- Taco. Orientación de la muestra. Etiqueta.

6.-CORTES: MICROTOMÍA. Tipo Minot: cuchilla fija. Tipo deslizamiento: cuchilla móvil.
Espesor cortes. Micrómetro. Nanómetro. Extendido láminas. Baño maría
7.-SECADO DE LAS LÁMINAS con el tejido ( estufa 60° )

CORTES POR CONGELACIÓN

Biopsia peroperatoria. Examen rápido.
La congelación de un tejido le confieren una consistencia que puede ser cortado y
coloreados inmediatamente. Micrótomos de congelación. Criostatos.

- Histoquímica
- Inmunofluorescencia
- Coloraciones
- Indicaciones

TEJIDOS INCLUIDOS EN RESINAS ACRÍLICAS Y EPOXI COMO

MEDIOS DE INCLUSIÓN ( MOAR ).
• ( Microscopía óptica común en cortes parafinados ).

• Cortes más delgados en resinas acrílicas y epoxi permiten conseguir

resoluciones mucho mejores ( 0,5 – 2um).
• Inclusión en una resina acrílica: se obtienen cortes entre 1 a 2 um. de grosor

• Inclusión en resina epoxi: Son medios de soporte más duros para el material
biológico .
Se consiguen cortes entre 0,5 a 1 um. para estudio de microscopía óptica,
cortes ultrafinos para la microscopía electrónica (ME) de transmisión.

El mejor detalle celular con MO, cortes epoxi de 0,5-1um, coloración con azul
de toluidina( único colorante que penetra la resina epoxi).

Los cortes para ME suelen tener un grosor de 0,1 um. ( cortes ultrafinos). Fijador
más frecuente es el glutaraldehído . Inclusión en resina epoxi.
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• La ME de barrido permite la percepción de resolución tridimensional de las

estructuras subcelulares, utilizando piezas sólidas de tejidos más que cortes. Se
seca una pequeña pieza de tejido fijado y se cubre de oro. Un haz electrónico barre
la muestra y los electrones reconstruyen una representación tridimensional.

COLORACIONES

El principio de las coloraciones se basa en la afinidad particular de ciertos tejidos o

estructuras celulares por una sustancia colorante determinada. No existe una coloración
estándar que cubra todas las exigencias de la histología. Cada coloración posee ventajas
e inconvenientes y exige una fijación particular.

Coloraciones simples y directas: tiñe por sí solo, sin necesidad de mordiente

Coloraciones indirectas después de aplicación de un mordiente: consiste en impregnar el
tejido a teñir de un “mordiente” destinado a acrecentar la fijación electiva del colorante. Los
“M” en histología son diversos, la mayor parte son oxidantes: ácidos crómico,
fosfomolíbdico, fosfotúngstico , oxálico; permanganato potásico, yodo , anilina.

Materias colorantes se entiende por colorante toda materia de color que puesta en
contacto con un soporte apropiado se fija sobre él de forma durable y le comunica su
color.
Colorantes naturales, la mayor parte de origen vegetal: la orceína, la hematoxilina
( extracto de palo azul de América central o palo de Campeche),el azafrán, el índico, etc.
Sólo el carmín es de origen animal. Muchos han sido desplazados por los colorantes
artificiales.

Colorantes artificiales derivados de los productos de destilación de la hulla. Colorantes

básicos (nucleares), Colorantes.ácidos (citoplasmáticos) Colorantes neutros e
indiferentes.

Colorantes básicos: son sales cuya propiedad colorante está en relación con el
componente básico de su molécula. Su grupo aminado forma una sal con un ácido cuya
única propiedad es la de ser soluble en el agua. Las estructuras basófilas de las células
son los soportes del DNA y del RNA. Más usados: fucsina básica(magenta)
azul de metileno, azul de toluidina, violeta de metilo, verde de metilo.

Colorantes ácidos: son también sales cuya propiedad colorante está unida al
componente ácido de su molécula. Más usados: eosina, eritrosina, verde brillante,
naranja, fucsina ácida.
Colorantes neutros: Son sales cuyas propiedades colorantes van unidas a los dos
componentes, ácido y básico de la molécula: eosinato de azul de metileno ( compo-
nente del Giemsa.

Colorantes indiferentes: No poseen grupos capaces de formar sales. Estos colo-

rantes comunican su color incorporándose a disolventes dentro del tejido que deben
teñir: sudán, escarlata.

Colorantes metacromáticos: Colorantes que tiñen diversos elementos histológi-

cos con un tinte distinto del de la solución colorante. Ej: azul de toluidina tiñe rojo
púrpura el mucus y la sustancia fundamental del cartílago. Más usados: azul de
toluidina, tionina, azul de cresil brillante, azul de metileno.
Los mecanismos exactos de la metacromasia no son todavía conocidos. Según
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Lison cree que la metacromasia detecta en principio sustancias de peso molecular
elevado portadoras de grupos aniónicos.

COLORACIÓN CON HEMATOXILINA Y EOSINA:

Es la técnica más utilizada en histología y en anatomía patológica.
La hematoxilina es un colorante básico, tiñe las estructuras ácidas en un tono violáceo.
Los núcleos, ribosomas y RER poseen una fuerte afinidad por este colorante debido a su
alto contenido en ADN y ARN, respectivamente.
La Eosina es un colorante ácido que tiñe de rojo o rosa las estructuras básicas. La
mayoría de las proteínas citoplasmáticas son básicas, por lo que los citoplasmas suelen
teñirse de rosa o rojo rosado.
En general, cuando se aplica la técnica de H-E a las células, los núcleos se tiñen de
azul y los citoplasmas de rojo o rosa.

HEMATOXILINA-SOLUCIÓN DE TRABAJO.
Varias fórmulas:
Hematoxilina de Harris: Sol A : Hematoxilina cristalizada ............................. 1 gr.
Alcohol absoluto.......................................... 10 ml

Sol B: Alumbre potásico 20 gr.

Agua............................................................. 200ml.

Sol C: Permanganato potásico ............................... 1 gr.

Agua ............................................................ 16 ml.

Hematoxilina férrica de Weigert :

Sol A: Hematoxilina ..................................................... 1 gr.

Alcohol de 96° .............................................................. 100 ml.

Sol B: Percloruro de hierro oficial ................................ 4 ml.

HCL concentrado ................................................. 1 ml.
Agua ..................................................................... 95 ml.

Hematoxilina de Mayer:

Alumbre de amonio o potasio ................................ 50 g.

Agua destilada .......................................................... 1000 ml.
Cristales de hematoxilina ......................................... 1 g.
Iodato de sodio ......................................................... 2 g.
Acido cítrico .......................................................... 1g.
Hidrato de cloral ................................................... 50 g.

EOSINA- SOLUCIÓN DE TRABAJO:

colorante débilmente ácido que pertenece al grupo de las fluoresceínas. Contiene 4
moléculas de bromo. Soluble en agua. Se utiliza en solución acuosa al 1 % añadiendo 1
gota de ácido acético por cada 100 ml. de solución colorante.
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COLORACIONES ESPECIALES ( TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS ):

Colorean los componentes del tejido colectivamente a través del uso de colorantes y por
reacciones químicas semiespecíficas. Por ejemplo: hongos, bacteria, tejidos bandos
musculares, colágeno.

PAS: ( Periodic Acid Schiff ): Hidratos de carbono, querasina, cerebrósido

mucoproteínas, glicoproteínas, membrana basal. Cartílago.

AZUL ALCIAN: Método de tinción de la mucina. Algunos tipos de mucina, se tiñen de azul
con este método (cartílago).

TRICRÓMICO DE MASSON: Se conoce como la técnica del tejido conjuntivo, porque se

usa para demostrar los elementos del tejido de sostén, especialmente el colágeno. Como
su nombre implica, la técnica produce tres colores: núcleos y otras estructuras
basófilas se tiñen de azul, el colágeno se tiñe de verde o azul, dependiendo del
colorante que se aplique, los citoplasmas, músculos, eritrocitos y la queratina: color
rojo brillante.

VAN GIESON: Otro método para el tejido conjuntivo en el que el colágeno se tiñe de rojo,
lo núcleos de azul y los eritrocitos y citoplasmas, de amarillo. En combinación con una
tinción para las fibras elásticas, éstas se tiñen en azul / negro, color que se suma a los
antes mencionados. Es una técnica útil para vasos sanguíneos y piel.

ORCEÍNA: Fibras elásticas

Orceína natural ................................. 1 gr.
Alcohol de 70° .................................. 100 ml.
Acido nítrico concentrado ................ 0,7 ml.
Resultado: Fibras elásticas de color castaño oscuro.

TINCIÓN DE RETICULINA: Técnicas que muestra a las fibras de reticulina del tejido de
sostén, a las que tiñe de azul / negro. Los núcleos pueden contrastarse en azul con
hematoxilina o en rojo con el colorante rojo neutro.

IMPREGNACIÓN ARGÉNTICA: se basa en la precipitación de plata metálica en las

estructuras por reducción de sales argénticas y no son, por tanto coloraciones en sentido
estricto. El resultado final en negro. Químicamente consiste en la propiedad que tienen las
sales de plata de transformarse en óxido de plata por la acción de álcalis fuertes.

Argentafino: se dice del tejido que reduce la plata ( la impregnación argéntica es posible
sin tratamiento previo).

Argirófilo: La impregnación sólo es posible después de una reducción con mordientes o

con formalina
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GIEMSA: Habitualmente tiñe células sanguíneas y otras extensiones celulares (médula

ósea). Tiñe los núcleos de azul oscuro o violeta, los citoplasmas de fondo de color azul
pálido y los eritrocitos, de rosa pálido.

AZUL DE TOLUIDINA: Es una tinción básica que tiñe los componentes ácidos en diversos
tonos de azul. Algunos componentes del tejido pueden hacer que el colorante azul adopte
un tono rojo: metacromasia.

SUDÁN NEGRO: Tiñe estructuras que contienen lípidos.

Recomendaciones para coloración de grasas: fijación formol neutro. Cortes por
congelación. Coloración: Sudan, lavado rápido en solución alcohólica débil de70°.

LÍQUIDO DE FONTANA ( Nitrato de plata amoniacal ): Melanina.

FERROCIANURO DE K : Hemosiderina

ROJO CONGO. CRISTAL VIOLETA ( metacromasia). Amiloide.

GRAM( bacterias).

GROCOTT (hongos)
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RESUMEN DE TRABAJO EN HISTOLOGIA

(BIOPSIA- HISTOLOGÍA)

SELECCIÓN Y OBTENCIÓN DE LA MUESTRA. Rótulo: microbiopsias y biopsias

PROCESO

- Fijación : formol 10 % - Formol neutro ....................... 6 horas hasta 24h

- Lavado
- Deshidratación: alcoholes crecientes hasta 100° ..... 2 a 4 horas
- Aclaramiento: Mínimo 2 frascos de xilol .................. 1 a 2 horas
- Impregnación: Mínimo 2 frascos parafina 58° ........... 1 a 2 horas
- Inclusión: Parafina pura. Moldes. Taco. Rótulo.
- Enfriamiento de los tacos para cortes
- Cortes: micrótomo. Rótulo. Lápiz diamante.
- Extendidos (baño maría) y secado láminas en estufa a 60°: 1/2 a 1 hora

COLORACIÓN HEMATOXILINA Y EOSINA ( H-E).

Es la técnica más utilizada en histología y en anatomía patológica.

- Xilol, por lo menos 3 frascos( desparafinar):................. 10 minutos

- Alcoholes decrecientes(hidratar): 100-100-80-70-50..10 minutos
- Lavar en agua corriente
- Hematoxilina: .............................................................. 2 a 5 minutos
- Lavar en agua corriente
- Alcohol-ácido
- Lavar
- Carbonato de litio
- Lavar en agua corriente
- Eosina ............................................................................1/2 a 1 minuto
- Lavar en agua corriente
- Alcoholes crecientes(deshidratar)50-70-80-100-100.. 10 minutos
- Xilol
- Montaje-bálsamo
- Observación al microscopio.
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INMUNOHISTOQUÍMICA ( IH )

INMUNOHISTOLOGÍA. INMUNOFLUORESCENCIA

La IH es la rama de la inmunología que estudia las sustancias químicas y reacciones del

sistema inmunitario . Interacción entre Ag y Ac.

Anticuerpos policlonales: producidos por diferentes células(clonas). Son

inmunohistoquímicamente disimilares porque reaccionan con varios epítopes del Ag.
Aanticuerpos monoclonales: producidos por descendientes de una sola célula(clona).
Los Ac monoclonales son inmunohistoquímicamente idénticos y reaccionan con un solo
epítope del Ag.

La técnica de IH tiene aproximadamente 45 años, pero todavía es considerada una

tecnología nueva. En los últimos 10 años: diagnóstico de casos difíciles
( neoplasias:
origen y tipo).

En la actualidad se utilizan sistemáticamente diversas técnicas inmunohistológicas con

fines diagnósticos y de investigación.

Las técnicas IH dependen de la extraordinaria especificidad que los Ac muestran por sus
correspondientes Ag. En consecuencia una sustancia ( Ag ) puede ser identificada de
forma específica siempre que se disponga del Ac adecuado.

TÉCNICA:
Solución del Ac sobre el tejido, en un portaobjetos. Éste se une al Ag ( sólo las células que
contienen el Ag en cuestión retienen el Ac) a él fijado. Para demostrar la posición del Ac,
éste se unió previamente a una sustancia indicadora, que puede ser un producto
fluorescente como la fluoresceína ( Técnica de inmunofluorescencia), detectándose la
posición del Ac (IgG, IgA,IgM, fracciones del complemento) sobre tejido congelado,
observado con un microscopio de fluorescencia.

Sin embargo es más útil unir el Ac a una enzima( peroxidasa) capaz de convertir una
sustancia incolora en un producto coloreado, se observa con el microscopio ordinario
( Técnica de la Inmunoperoxidasa).

ALGUNOS MARCADORES INMUNOENZIMÁTICOS

Filamentos proteicos citoplasmáticos:
-keratina(citoqueratina):carcinoma vs linfoma
- Vimentina, presentes en todas las células mesenquimatosas: sarcoma
- Desmina:músculo:Rabdomiosarcoma
- Neurofilamentos: tumores de origen neurológico ( Schwannoma)
CEA (antígeno carcino embriónico): Adenocarcinoma gastrointestinal,pulmonar.
PSA ( Próstata)
S-100 ( Melanoma)
HMB 45 ( Melanoma)
Cromogranina: suprarrenales
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LCA ( Linfoma)
RECEPTORES Estrógenos, Progesterona ( Mama)
AFP
P53 (gen supresor)
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