SECRETARA DE EDUCACIN PBLICA

SISTEMA NACIONAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICA

DIRECCIN GENERAL DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICA
SUBSECRETARA DE EDUCACIN SUPERIOR

INSTITUTO TECNOLGICO DEL VALLE DE MORELIA

EFECTO DE NH4 NO3, KNO3 y Ca (NO3)2 EN LA CALIDAD DE BROTES DE

STEVIA rebaudiana BERTONI PROPAGADA in vitro.

PROTOCOLO DE TALLER INVESTIGACIN 2

QUE PRESENTA:

SALAS GARCIA MARBELLA

71

INGENIERA EN AGRONOMIA

Dr. Santana Huicochea Gerardo Edmundo

MORELIA, MICHOACN,15 DE MAYO DE 2014

NDICE
1. INTRODUCCIN ...................................................................................................................................... 4
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................... 6
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................................ 7
3.1. Objetivo general ............................................................................................................................. 7
3.1.1. Objetivo especfico ..................................................................................................................... 7
4. HIPTESIS................................................................................................................................................. 8
4.1. Hiptesis nula.................................................................................................................................. 8
5. JUSTIFICACIN........................................................................................................................................ 9
5.1. Social ................................................................................................................................................... 9
5.1.1. Justificacin econmica ........................................................................................................... 9
5.1.2. Justificacin ecolgica .............................................................................................................. 9
5.1.3. Justificacin tecnolgica .......................................................................................................... 9
6. MARCO TERICO Y ANTECEDENTES ........................................................................................ 10
6.1. Clasificacin taxonmica de S. rebaudiana ....................................................................... 10
6.2. Descripcin botnica de la Stevia rebaudiana Bertoni ................................................. 11
6.3. Contenido nutricional ............................................................................................................... 11
6.4. Requerimientos edafoclimaticos .......................................................................................... 11
6.5 Requerimientos nutricionales ................................................................................................ 12
6.7. Produccin in vitro de S. rebaudiana .................................................................................. 13
7. METODOLOGA .................................................................................................................................... 15
7.1. Preparacin del medio de cultivo ......................................................................................... 15
7.2. Obtencin de los explantes y establecimiento del cultivo asptico. ....................... 16
7.2.1. Protocolo de desinfeccin ................................................................................................... 16
7.3Tratamientos a evaluar............................................................................................................... 17
8. RESULTADOS ESPERADOS .............................................................................................................. 19
9. CRONOGRAMA ..................................................................................................................................... 20
10. BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................... 21
10.1 Bibliografa en lnea ................................................................................................................. 22

NDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Composicin del medio de cultivo propuesto por Murashige y Skoog

(1962)...14
Cuadro 2. Soluciones empleadas en el medio de cultivo segn. (Villegas
1993).15

RESUMEN

La S. rebaudiana es una especie perteneciente a la familia de las Asteraceae; su

importancia incide en el sabor dulce caracterstico debido a los esteviosidos y
rabaudiosidos que posee toda la planta en particular las hojas, es un azcar
simple debido a esto no es perjudicial al organismo adems que desde un punto
de vista medicinal regula la glucosa, es antidiurtica, ayuda a combatir la caries.
Desde el punto de vista econmico es un cultivo que ha tenido un gran impulso ya
que se ha estado buscando una nueva alternativa para poder sustituir el azcar
obtenido de la caa de azcar por edulcorantes naturales, S. rebaudiana es un
cultivo nuevo y muy bien aceptado por algunos pases, la S. rebaudiana se
propaga principalmente por semilla pero no es viable ya que tarda mucho en
germinar, y por esquejes se pierde la homogeneidad de cultivo es por esto que se
han buscado nuevas alternativas de propagacin y la propagacin in vitro es una
muy buena alternativa ya que se obtiene mayor nmero de plantas en poco tiempo
y con condiciones aspticas muy buenas, pero para este cultivo no se cuenta con
la informacin nutrimental necesaria para el medio de cultivo es por esto que est
trabajo se pretende definir las concentraciones adecuadas de NH4 NO3, NO3 Y Ca
(NO3)2 que la plata necesita para su crecimiento y desarrollo en condicin in vitro.
El siguiente anteproyecto se realizar en el laboratorio de biotecnologa del ITVM
en Morelia Michoacn, y tiene como finalidad conocer los requerimientos
nutricionales para una mayor produccin de brotes y mayor rea foliar, se
utilizarn segmentos del tallo de 2 cm de longitud aproximadamente, y se
sembrarn en un medio de cultivo modificado por Villegas. Se realizarn 3
experimentos sucesivos utilizando un diseo completamente al azar; el primer
experimento consistir en evaluar niveles de NH4 NO3 a 0, 6, 12, 24 (mM) el
segundo experimento consistir en evaluar niveles de KNO3 a 5, 10, 15,20 (mM) y
el tercer experimento consistir en evaluar niveles de 0, 0.7, 1.4, 2.1, 2.8 (mM).
Los expantes se encubaran en la sala de incubacin por un periodo de cuatro
semanas, donde recibirn una temperatura de 22-25C y un foto periodo de 16
horas luz y 8 horas obscuridad. Las variables a estudiar: i) Conductividad elctrica
(CE), ii) pH, iii) Longitud de brotes, iv) Nmero de brotes, v) contaminacin, vi)
contenido de NO3, K y Ca en el medio de cultivo a los 15, 21 y 30 das despus de
la siembra, vii) Contenido de NO3, K y Ca en los tejidos 30 das despus de la
siembra, viii) rea foliar y ix) clorofila total.

1. INTRODUCCIN
Debido al incremento en la utilizacin de la caa de azcar como biocombustible,
se ha buscado la forma de encontrar sustitos directos del azcar de caa, ya que
el tipo de azcar glucosa provoca daos a la salud ante este problema se han
buscado alternativas como la S. rebaudiana (Jaramillo et al., 2014).
El problema ocasionado por los efectos secundarios de los edulcorantes qumicos
ha ocasionado un aumento en la demanda de los edulcorantes naturales, entre los
que se encuentra la S. rebaudiana. Japn se ha optado por el uso de cristales de
S. rebaudiana en lugar del consumo de caa de azcar, afectando ya el 50 % del
mercado en ese pas. Esto tambin se debe a que los edulcorantes sintticos
estn prohibidos desde 1970. En la mayor parte del mundo se comienza con este
cambio, siguiendo los pasos de Japn, sobre todo en los pases primermundistas
(INIFAP 2012).
La S. rebaudiana tiene propiedades edulcorantes con un contenido nfimo de
caloras. Los glucsidos que se extraen de esta planta, estevisidos,
rebaudisidos y dulcsidos, endulzan hasta 300 veces ms que el azcar refinado,
mientras que la planta en su forma natural es 15 veces ms dulce que el azcar
de mesa o sacarosa. Las hojas secas son entre 20 y 35 veces ms dulces que el
azcar (Brandle, 2005).
Por lo tanto, el cultivo de la S. rebaudiana es innovador y muy rentable, pues
presenta condiciones promisorias en los mercados nacionales y mundiales. Es
interesante observar cmo el consumo de esta planta, ya sea como hierba o como
productos industrializados derivados de esta especie vegetal, est destinado a
sustituir el mercado del uso de edulcorantes sintticos tales como el aspartame,
las sacarinas y los ciclamatos (SAGARPA 2011).
La alta demanda de esta planta hizo que se buscaran nuevas alternativas de
poderla propagar en poco tiempo, ya que su propagacin tradicional es por semilla
o esqueje pero tardo mucho en tener plantas en produccin, El cultivo de tejidos
es otro mtodo de propagacin vegetativa que permite plantaciones ms
uniformes, adems, se obtiene una rpida multiplicacin clona, pero la poca
informacin que hay sobre el medio de cultivo es una limitante para la propagacin
in vitro. Es por esto que el presente trabajo se da a conocer la importancia que
tiene la nutricin para los medios de cultivo in vitro, y se pretende generar
informacin sobre el adecuado medio de cultivo para la S. rebaudiana.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los ltimos aos las agroindustrias ha introducido en el mercado internacional

los edulcorantes artificiales bajos en caloras a base de componentes qumicos los
cuales surgieron para satisfacer las necesidades de personas con limitaciones
respecto al consumo de azcar y caloras en su dieta. Asimismo, se han explorado
otras alternativas como son los edulcorantes naturales cuyos beneficios son
similares a los de los edulcorantes artificiales pero con el valor agregado de no
causar efectos nocivos en la salud.
El rpido desarrollo de la industria de edulcorantes y la bsqueda de alternativas
menos riesgosas que los edulcorantes sintticos tradicionales, ha hecho que la
S. rebaudiana prospere en pases como Brasil, China, Japn, Corea, Tailandia,
Israel. Por eso en este proyecto se expresa la importancia que tiene la S.
rebaudiana como un posible sustituto del azcar, sin causar daos al organismo.
Una alternativa para producir planta de calidad y se pueda abastecer la demanda
nacional e internacional de esta especie es la tcnica de cultivo de tejidos
vegetales, sin embargo para el medio de cultivo en el laboratorio de Biotecnologa
del ITVM no se cuenta con un medio de cultivo especfico para multiplicar plantas
de calidad. Ante este problema se pretende definir tres de los macro nutrimentos
que la planta necesita para su crecimiento y desarrollo en el medio de cultivo
como es el caso de N- nitrato de amonio, N-K nitrato de potasio N-Ca nitrato de
calcio, los cuales influyen en los diferentes procesos metablicos de la planta y
que a altas o bajas concentraciones puede provocar trastornos fisiolgicos en las
platas lo que afecta a esta especie en campo.

3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general

Conocer el efecto de nitrato de amonio (NH4 NO3), nitrato de potasio (KNO3),

nitrato de calcio (Ca (NO3)2) en el medio de cultivo in vitro de S. rebaudiana, para
una mayor produccin de brotes en el laboratorio de Biotecnologa del Instituto
Tecnolgico del Valle de Morelia.

3.1.1. Objetivo especfico

Determinar la concentracin ptima para la generacin de brotes axilares
de S. rebaudiana.
Establecer las condiciones nutricionales del cultivo in vitro para la
propagacin de la S. redaudiana.
Generar informacin cientfica en el esquema de propagacin in vitro de
platas de calidad de S. rebaudiana en el laboratorio de Biotecnologa del
Instituto Tecnolgico del Valle de Morelia.

4. HIPTESIS
4.1. Hiptesis nula
Con diferentes concentraciones de NH4 NO3, KNO3, Ca (NO3)2 en los medios de
cultivo in vitro para la S. rebaudiana no influyen en la longitud de brotes ni en el
rea foliar.
4.1.1. Hiptesis alterna
Con diferentes concentraciones de NH4 NO3, KNO3, Ca (NO3)2 en los medios de
cultivo in vitro para la S. rebaudiana tendr una mayor proporcin en la longitud
de brotes y una mayor el rea foliar.

5. JUSTIFICACIN
5.1. Social
En la actualidad, los edulcorantes naturales constituyen una excelente alternativa
en la industria alimenticia. Si bien, sta industria emplea desde hace varios aos
productos qumicos como el aspartamo, acelsufame-K, sacarina o ciclamato, la
inocuidad de estas sustancias ha estado siempre como tema de discusin en los
principales foros acadmicos alimenticios, generando desconcierto entre los
consumidores de productos bajos en caloras, e incluso mltiples dudas entre las
propias autoridades reguladoras, en especial cuando se habla del largo plazo de
ingesta de stas sustancias. En los ltimos aos se ha investigado en plantas
medicinales alternativas de edulcorantes mucho ms seguras y que a la vez
mantengan el ndice de dulzor en niveles adecuados para el consumo humano;
destacan entre las sustancias ms estudiadas Taumatina, Monellina y Stevisidos,
las cuales ya forman parte de muchos productos alimenticios
En las ltimas dcadas el cultivo de la S. rebaudiana se ha convertido en el centro
de atencin de muchos sectores agrcolas del mundo, iniciando su trayectoria
desde los campos de Paraguay y Brasil donde se ha dado origen a esta especie
de edulcorante natural.
5.1.1. Justificacin econmica
Es un cultivo de gran potencial econmico, sabiendo que el esteviosido puede ser
usado como edulcorante natural no calrico, ya que no es asimilado por el
organismo humano, puede ser utilizado como azcar diettico.
5.1.2. Justificacin ecolgica
Es una planta silvestre debido a esto se puede adaptar a suelos pobres, podemos
utilizar suelos degradados para poder establecer el cultivo.
5.1.3. Justificacin tecnolgica
La tcnica de propagacin de tejidos vegetales es una buena tcnica para
propagar la S. rebaudiana ya que se obtienen explantes libres de patgenos y con
una nutricin adecuada para cuando se lleve a campo tenga buena adaptabilidad
y alta produccin.

6. MARCO TERICO Y ANTECEDENTES

La S. rebaudiana es originaria de Paraguay y descubierta en 1887: fue descrita y
clasificada en 1889 por el botnico suizo Moiss Santiago Bertoni (1857-1929),
momento a partir del cual recibi el nombre cientfico de Stevia rebaudiana Bertoni
(Ministerio de Agricultura y Ganadera, 1996).
Es una planta herbcea con propiedades extremadamente favorables para la
salud humana, es utilizada como endulzante natural pues sus hojas molidas son
300 veces ms dulces que el azcar de caa y si secramos la hoja entera es 15
veces ms dulce que el azcar comn (INIFAP 2012).
La S. rebaudiana, es una especie de la familia de las asterceas nativa de la
regin tropical de Sudamrica; se encuentra an en estado silvestre en el
Paraguay, especialmente en el departamento de Amambay, pero desde hace
varias dcadas se cultiva por sus propiedades edulcorantes y su bajo contenido
calrico (Cortes 2012).
6.1. Clasificacin taxonmica de S. rebaudiana
Segn Salgado (2007) menciona lo siguiente:
Subreino: Eukaryota
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Subdivisin: Spermatophyta
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Asteridae
Orden: Asterales
Familia: Asteraceae
Subfamilia: Asteroideae
Gnero: Stevia
Especie: rebaudiana
Nombre binomial: Stevia rebaudiana Bertoni

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6.2. Descripcin botnica de la Stevia rebaudiana Bertoni

La S. rebaudiana, es un arbusto que alcanza los 90 cm de altura, durante su

desarrollo inicial no posee ramificaciones, llegando a producir hasta 20 tallos en
tres a cuatro aos, es una planta subfruticosa, con tallo anual, subleosa,
ramificada formando mltiples brotes con tendencia a inclinarse lvarez (2004).
La raz es perenne, fibrosa, filiforme, abundante, formando cepa. Las hojas son
pequeas, lanceoladas, muy dulces, festoneadas, opuestas en verticilos
alternados, ssiles. La parte ms ancha de la hoja se encuentra en la mitad de la
parte superior (Bonilla et al., 2007).
La flor es hermafrodita, pequea y blanquecina; su corola es tubular,
pentalobulada, en captulos pequeos terminales o axilares, agrupados en
panculas corimbosas, agrupados en panculas corimbosas, de lbulos blancos. El
fruto es un aquenio delgado y plumoso (Flores et al., 2011).
6.3. Contenido nutricional
Ms del 50 %: carbohidratos de fcil asimilacin.
Ms del 10 %: fibras, polipptidos (protenas vegetales).
Ms del 1 %: lpidos, potasio.
Entre el 0.3 y 1 %: calcio, magnesio y fsforo.
Menos del 0.01 %: cromo, cobalto, hierro, manganeso, selenio, silicio, zinc
(INIFAP 2012).
6.4. Requerimientos edafoclimaticos
Zuabieta (2007) menciona lo siguiente:

Temperatura: 15 a 30 C.
Humedad relativa: 75 a 85 %.
Precipitacin: 1000 -2000 mm.
Altitud: 300-1800 msnm.
Topografa: Plana.
pH: 6,5 a 7.
Suelos: De textura franco arenosa a franco, buena permeabilidad y
drenaje.
Requiere una alta luminosidad, 13 horas de luz da.
Vientos: Moderados.

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6.5 Requerimientos nutricionales

Los fertilizantes qumicos aportan nutrientes esenciales a las plantas; Existen

formulaciones y /o combinaciones que pueden ser utilizadas en el momento de la
fertilizacin qumica del cultivado de la S. rebaudiana Bertoni y una de las ms
recomendadas debido a su abundancia en el mercado, lo cual facilita su
obtencin, es:
60 Kg de N
60 Kg de xido de potasio (K20)
120 Kg de anhdrido fosfrico (P202)
Una de las recomendaciones ms importantes, especialmente para el nitrgeno,
es la de no aplicar en una sola oportunidad toda la dosis de fertilizante
recomendada; esto se realiza atendiendo al comportamiento nutricional de la
planta en sus diferentes etapas de su desarrollo; es decir que la planta presente
una exigencia nutricional variada en cada etapa de su desarrollo.
En una investigacin desarrollada en 2002, se cuantific el efecto de la aplicacin
de dosis combinadas de los elementos N, P y K sobre variables morfolgicas y
fisiolgicas de Morita 2 y se determinaron los contenidos de estos elementos en
la planta en diferentes estados de desarrollo. Se utiliz un diseo completamente
aleatorio con tres repeticiones.
Respuestas observadas en la acumulacin de biomasa de las hojas por planta
mostraron que, ante la ausencia de P, los niveles altos de K pueden incidir de
manera negativa sobre esta biomasa, pero que a niveles medios y altos de P el
aumento del peso seco de las hojas es directamente proporcional al incremento en
los niveles de K, lo que sin duda sugiere la importancia de mantener niveles
adecuados de los dos elementos en el plan de nutricin. Asimismo, se pueden
analizar los resultados en el sentido que no hay respuesta importante al P cuando
la aplicacin de K es cero, pero es alta y positiva cuando los niveles de K
disponible son altos (Jarma 2014).
Por la rpida aceptacin de este nuevo edulcorante natural, la produccin se ha
visto forzar para cumplir con la demanda que se tena, se buscaron nuevas
alternativas de propagacin, ya que tradicionalmente se haca por semilla o
esqueje pero el tiempo que tardan en tener plntulas para poder establecer un
cultivo en determinada superficie se prolongaba bastante tiempo, se buscaron
nuevas alternativas de propagacin como es la propagacin in vitro.

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6.6. Propagacin in vitro

La propagacin in vitro o micropropagacin se define como cualquier

procedimiento asptico que comprenda la manipulacin en las plantas de rganos,
tejidos o clulas que produzcan poblaciones de plntulas limpias, Las ventajas
de la micropropagacin, en comparacin con sistemas convencionales, son el
incremento acelerado del nmero de plantas, la disminucin del tiempo de
multiplicacin, un mayor nmero de plantas por superficie utilizada, el mayor
control de la sanidad, el fcil transporte para intercambio internacional de
materiales y la posibilidad de multiplicar rpidamente especies en peligro de
extincin( Landzur et al., 2014).
La propagacin in vitro, es un mtodo alternativo para producir mayor cantidad de
plantines en menor tiempo. Reporta una tasa de multiplicacin de 3 a 4 en cada
subcultivo, utilizando pices meristemticos. El nmero de subcultivos promedio
que se reporta es de 5, para un total aproximado de 3200 plantines por explante
en un periodo de 8 meses, considerando un 75 % de sobrevivencia. Adems, La
clonacin in vitro es la tcnica ms factible a la hora de realizar mejoramiento
gentico, ya sea para la obtencin de plantas uniformes y con alto contenido de
steviosido y rebaudiosido (glucsidos de mayor poder edulcorante), as como para
lograr plantas con mayor rendimiento en hojas (Delvalle 2001).
6.7. Produccin in vitro de S. rebaudiana

Segn CIAT (1990) la mayora de las plantas cultivadas in vitro pasan por las
siguientes etapas en el proceso de micorpropagacin:
1) La seleccin del mejor explante es muy importante ya que de esto depender la
futura propagacin. Los explantes pueden tener un origen diverso como secciones
de hojas, micro-estacas, races, meristemos.
El mejor procedimiento para la seleccin del material vegetal, es recolectando
ramas de brotacin joven de unos 10 a 12 cm de longitud. Se recomienda cortar
los tallos en horas de la maana para evitar la deshidratacin y con tijeras de
podar bien desinfectadas con alcohol al 70%.
2) Establecimiento, que consiste en la desinfeccin de los explantos
(generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial
de modo de inducir callo, brote, raz o embrin somtico segn se desee.

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3) Multiplicacin, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneracin

del nmero de plantas necesarias.
5.8. Medio de cultivo
El medio de cultivo tiene dos funciones principales, la primera es proporcionar los
nutrientes bsicos para el crecimiento continuo de los explantes aislados y los
propagulos subsiguientes y la segunda, es dirigir el crecimiento y desarrollo
mediante el control hormonal, el xito que del cultivo de tejidos depende del medio
de cultivo adecuado, as tambin del empleo de los tejidos viables, incubacin,
calidad de reactivos (Vzquez 2012).
Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o
100 veces soluciones madre (Murashige y Skoog. 1962), como se menciona en el
cuadro 1 .En la solucin madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre
que no se produzcan problemas de precipitacin. Algunos elementos, como el Fe,
se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo.
Cuadro 1. Solucin madre para medios de cultivo in vitro

(Murashige y Skoog.1962)
Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma lquida o con un agente
gelificante como el agar.
Para el cultivo de la S. rebaudiana se ha tenido mejor resultado en medio lquido,
producen mucho ms rpido races en comparacin con el medio gelificado.

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7. METODOLOGA

El presente proyecto de investigacin se establecer en el laboratorio de

Biotecnologa del Instituto Tecnolgico del Valle de Morelia ubicado en el Km. 6.5
Carretera Morelia-Salamanca fraccionamiento Los ngeles, Morelia Michoacn.
6.1 Medio de cultivo
Soluciones empleadas segn (Villegas 1993).
Cuadro 2.
NH4 NO3
KNO3
CA (NO3)2
Mg SO4
KH2PO4
QUELATOS
MICRONUTRIENTES
MIO- INOSITOL
TIAMINA
BA
CISTEINA
SACAROSA
pH

12ml
10ml
15ml
15ml
12ml
10ml
10ml
10ml
10ml
10ml
50mg
30g
5.70

7.1. Preparacin del medio de cultivo

1. Se mide en una probeta de 25 ml la dosis indicada de la solucin madre, y
se coloca en un vaso de precipitado de 50 ml.
2. Se pesa 30 gramos de sacarosa en una bscula granataria.
3. Se pesa 50 mg de cistena en una balanza analtica.
4. En un vaso de precipitado de 1ltr. Se coloca 700ml de agua destilada.
5. Se coloca en vaso de precipitado con los 700 ml de agua en un agitador
magntico, se coloca dentro del vaso las soluciones madre ya medidas,
sacarosa y posterior mente la cistena.
6. Se afora a un litro.
7. Se ajusta el pH a 5.70 con la ayuda de un pH-metro se agrega KaOH al
10% para subir el pH y HCI al 10% para bajarlo.

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8. Se coloca 10 ml del medio en tubos de ensaye, se coloca papel filtro dentro

del tubo, posteriormente se tapan.
9. Se agrupan 20 tubos con ayuda de una liga para poder manejarlos de una
manera ms segura.
10. Se colocan en la autoclave los tubos de ensaye con el medio para ser
esterilizados.
11. Se prende en autoclave, se abre la vlvula para que esta pueda ser
purgada, posteriormente se sierra y se deja que la temperatura llegue a
50C, despus se deja 15 minutos y se apaga.
12. Se deja que la presin baje y posteriormente se abre y se sacan los tubos
con el medio ya esterilizado, este se coloca en la salas de siembra.
7.2. Obtencin de los explantes y establecimiento del cultivo asptico.

1. Se obtiene una plata de S. rebaudiana, de preferencia joven y sana para que

sus brotes sean tiernos y no haya problemas al momento de la siembra.
7.2.1. Protocolo de desinfeccin
1. Posteriormente se colocan las varetas en un recipiente y se lavan con agua
y jabn de 2 a 3 veces
2. Se eliminan las hojas dejando una pequea porcin de peciolo, y se cortan
las varetas de aproximadamente 2 cm.
3. Sumergir las varetas en una solucin de 250 ml de alcohol al 70% durante
un minuto mantenindolas en agitacin.
4. Pasar las varetas a una solucin de hipoclorito de sodio al 12% por 10
minutos mantenindolas en agitacin.
5. Limpiar y esterilizar la sala de siembra.
6. Llevar las varetas en la solucin de hipoclorito de sodio a la sala de
siembra, ya dentro de la campana de flujo laminar eliminar los residuos de
la solucin de hipoclorito de sodio.
7. Colocar dentro de la campana de flujo laminar un mechero de alcohol,
pinzas, bistur, algodn y un aspersor con alcohol.
8. Se esterilizan las pinzas y el bistur por cada vareta que se siembra.
9. Se procede a realizar la siembra, se coloca en cada tubo de ensaye una
vareta, con la ayuda de las pinzas se empuja el papel filtro para que est en
contento con el medio y la plata pueda alimentarse, procurando siempre
trabajar cerca del fuego para que la siembra sea lo ms asptica posible.
10. Se sellan todos los tubos con plastipack.
11. Posteriormente se llevan los tubos a las sala de incubacin
Los explantes permanecern en la sala de incubacin durante 30 das

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7.3Tratamientos a evaluar

El primer experimento consistir en evaluar el NH4NO3, los tratamientos a evaluar

son los siguientes:
Tratamiento 1) 0 mM L-1.
Tratamiento 2) 6 mM L-1
Tratamiento 3) 12 mM L-1
Tratamiento 4) 18 mM L-1
Tratamiento 5) 24 mM L-1
El segundo experimento consistir en evaluar el KNO 3, los tratamientos a evaluar
son los siguientes:
Tratamiento 1) 0 mM L-1
Tratamiento 2) 5 mM L-1
Tratamiento 3) 10 mM L-1
Tratamiento 4) 15 mM L-1
Tratamiento 5) 20 mM L-1
El tercer experimento consistir en
evaluar son los siguientes:
Tratamiento 1) 0 mM L-1
Tratamiento 2) 0.7 mM L-1
Tratamiento 3) 1.4 mM L-1
Tratamiento 4) 2.1 mM L-1
Tratamiento 5) 2.8 mM L-1
Las variables a evaluar

Conductividad elctrica (CE).

pH.

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evaluar el Ca (NO3)2, los tratamientos a

Longitud de brotes.
Nmero de brotes.
Contaminacin.
contenido de NO3, K y Ca en el medio de cultivo a los 15, 21 y 30 das
despus de la siembra.
rea foliar.
clorofila total.

Por cada una de las variables a evaluar se tomaron datos cada semana durante
un mes.
Para este experimento se utilizara un diseo experimental completamente al azar
son 3 tratamientos con 5 diferentes dosis y 20 repeticiones cada uno.
= + +
Dnde: Yij= Respuesta de la variable bajo estudio en relacin con el tratamiento i
y el bloque j
= Media general del experimento
T= efecto del tratamiento i
= Efecto del bloque j
E= error experimenta

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8. RESULTADOS ESPERADOS
Se espera que con las modificaciones que se le harn al medio de cultivo
modificado por (Villegas 1993), la S. rebaudiana responda de una manera
favorable vindose los resultados con un 60% en mayor de rea foliar, nmero
de brotes y longitud de brotes.

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9. CRONOGRAMA

Actividades

Meses

Enero
S1
S2
1 2 3 4 5
Elaboracin del medio de cultivo
x
Esterilizacin del medio de cultivo X
en el autoclave
Establecimiento in vitro de los
x
explantes de la S. rebaudiana
Trasladar a la sala de siembra
x
toma de datos
x X
Anlisis anova
Conclusiones del experimento

20

S3

S4

Febrero
S1 S2

x
x
x

10. BIBLIOGRAFA
lvarez, J. (2004). Stevia revaudiana Bert. Universidad EAFIT 5 p.
Brandle, J., A. Richman., A. Swanson y B. Chapman. (2002). Leaf ESTs from
Stevia rebaudiana: a resource for gene discovery in diterpene synthesis. Plant Mol.
Biol. 50, 613-622.
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