LA MICROSCOPA:

HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CLULAS Y TEJIDOS

CAPTULO 4
EL MICROSCOPIO COMPUESTO.
4.1.-Breve resea histrica
4.2.-Partes del microscopio compuesto moderno
4.3.-Sistema mecnico del microscopio

4.4.-Sistema ptico del microscopio

Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes aumentadas y
ntidas de los especmenes que se observan. Los componentes pticos estn colocados en
una base estable que permite un intercambio rpido y un alineamiento preciso. El sistema
ptico est constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.

4.4.1.-Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal funcin
consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y proyectar una imagen ntida, real,
invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar
centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir exactamente para formar el eje
ptico del sistema. Sus lentes estn hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros)
con un alto grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento,
resolucin y de la correccin de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que
pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos categoras de

objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los objetivos apocromticos. En

cada categora se distinguen an dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersin
(64, 65, 66):
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja. Correccin de
esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de color verde y son ideales
para microfotografa blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromtico cuando no
posee ninguna denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el
azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin de esfericidad es para dos colores,
el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y estn mejor diseados para la
microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y por ello,
son ms costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo
y verde); correccin de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para
microfotografa y video a color. Debido a su alto grado de correccin, estos objetivos poseen
mayores aperturas numricas que los acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un
inconveniente puesto que el campo de observacin se presenta un poco curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se manifiesta como
curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan plan-acromticos, plan-fluoritas
o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto
de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio
interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy diferente del ndice del vidrio
porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de inmersin el
medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de
refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o
mejor an aceite de cedro, que posee un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del
vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin de la
refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad
de la imagen est aumentada, mientras que en los objetivos secos, est disminuida. El
empleo de la inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor resolucin
gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 35) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.
ptica finita y ptica infinita:
La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas pticos
en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver por un extremo, como el ocular por

el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos
que funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en
algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es
rectilneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por
prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear objetivos
diseados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no corresponda
produce incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo
diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas que
transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los fabricantes estn
elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseados para realizar una
correccin infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra
lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los
objetivos con esta correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa. Los
sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparicin de imgenes
fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos
nuevos modelos son de mayor tamao (66) (fig. 4-4).

Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al infinito.

Modificado de Microscope objetives.

Olympus Microscopy Resource Center (66).

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y
las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee
grabadas las especificaciones y caractersticas.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una lente frontal y dos
pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c)
objetivo apocromtico que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esfrica
frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
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Nomenclatura de los objetivos:
La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la
nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones necesarias
para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa informacin, generalmente en el idioma ingls,
puede contener (fig. 4-6):
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromticos);

Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS (infinity corrected
system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chromefree, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del
fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono luminoso.
Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milmetros (160,
170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con correccin infinita.
Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos
espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar de correccin en
las lentes internas para realizar la correccin y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener
una escala graduada mvil para el ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en
milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen
resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de acuerdo a la Royal
Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan con las siglas
RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El dimetro general es
de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca ms amplia y slo funcionan en sus
microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin y para ello se
emplea un cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous
immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para
facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 4-1).

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales en este objetivo
denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC differential
interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con platina
caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Cdigo de color
de inmersin

Medio de
inmersin

Negro

Aceite

Naranja

Glicerol

Blanco

Agua

Rojo

Especial o
multiuso

Cdigo de color
de aumento

Aumento

Negro

1x, 2.5x

Marrn

2x, 2.5x

Rojo

4x, 5x

Amarillo

10x

Verde

16x, 20x

Azul turquesa

25x, 32x

Azul celeste

40x, 50x

Azul cobalto

60x, 63x

Blanco, crema

100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos.

Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical

Microscopy. (15).

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4.4.2.-El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son
separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va
introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real
e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:
Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen
del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la
imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto.
La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real
del objetivo; la lente inferior tambin se denomina colectora y es la que aplana y aclara el
campo (fig. 4-7).

Clasificacin:
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y formados por dos lentes
plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre
ambas. Tambin denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes.
Muy comn en modelos de microscopios antiguos (11).
Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas
entre s y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen aberraciones y
funcionan de manera ptima con los objetivos corregidos al infinito (15).
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los
diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se aprecia en los objetivos
apocromticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromticos secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la imagen en una

pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para exhibicin (11).
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el
poder de resolucin es igual tanto en el centro como en la periferia del campo ptico (11).
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de
mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero con una doble lente
ocular (11).

Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular
de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes
(colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes
(c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 4-8) que
contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas, la curvatura de campo y su
empleo ptimo es en combinacin con objetivos de gran poder de aumento.

Figura 4-8.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular negativo. Modificado de M,

Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (mono-oculares), sin

embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos ms modernos son trinoculares,
especiales para la microfotografa. Los binoculares tienen los objetivos dispuestos con una
inclinacin de 45 para realizar la observacin cmodamente.
Campo del microscopio:
Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el ocular. Tambin
podemos definirlo como la porcin del plano visible observado a travs de las lentes. Si el
aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente
proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo est determinada por el
diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede
ser cuadrado y esta forma es muy til al realizar estudios de coprologa o hematologa, en
donde se requiere reconstruir la totalidad del campo de observacin de la preparacin, lo cual
se dificulta con un campo circular clsico al quedar zonas superpuestas (11).
El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de
este aumento est inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x,
20x o 25x. Otro valor es el nmero de campo que consiste en el dimetro en milmetros de la
apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus caractersticas:

 UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observacin
microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.
Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de estructuras del
espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el nmero, tamao o
dimensiones de las clulas y dems elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio
con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del
espcimen al encontrarse en el plano de formacin de la misma. Los oculares para la
medicin poseen un mecanismo de enfoque mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de
medicin del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear
algn software de computacin para realizar mediciones sobre las imgenes digitales y
obtener datos muy precisos, no obstante, el mtodo ms econmico y de uso ms
generalizado es la medicin con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre,
pestaa, cerda) denominada sealador, con la finalidad de indicar de manera especfica
alguna estructura en particular en el campo de observacin. El sealador se aprecia como
una lnea oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo.
Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte
colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por otra, impedir la formacin de
reflejos luminosos que dificulten la visualizacin. Algunos microscopios binoculares poseen un
mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptras en caso que el observador posea
una disminucin de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo
derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del
observador (usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa un campo

rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el orden de 1/10
mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta el nmero de divisiones que ocupa y
la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que
corresponde al tamao de la misma. Si la clula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si
el aumento del objetivo es 100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza H G. (1997).
Microscopy from the very begining. 2 ed. (13).

http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_
4.htm