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EFECTO DE LAS AUXINAS Y CITOQUININAS EN LA CALLGENESIS

SOBRE EXPLANTES NODALES E INTERNODALES DE Tropaeolum


tuberosum (R. and P. ) mashua
Snchez, D.; Huaman, K.; Pascual, E.; Snchez, H.; Estrada, R.
Laboratorio de Recursos Genticos y Biotecnologa-UNMSM
Centro Internacional de la Papa
INTRODUCCION
La mashua es una planta perenne herbcea (National Research Council, 1989;
Flores et al., 2003) perteneciente a la familia Tropaeolaceae, crece en las zonas
altoandinas del Per.
Esta planta tiene propiedades medicinales, son resistentes a las bajas
temperaturas, pestes y enfermedades, los tubrculos son usados como
antibacteriales, insecticidas y nematicidas, estas propiedades se deben a la
presencia de glucosinolatos, especialmente los itiocianatos (Flores et al., 2003;
King, S.R., 1987; Nacional Research Council, 1989, Watanabe, K., 2002).
El cultivo de mashua tiene una alta produccin, con respecto a los tubrculos
presenta un alto valor nutricional, contiene todos los aminocidos esenciales,
excepto histidina (Fandio et al., 1987), es rica en vitamina C (Fandio et al.,
1987; Flores et al., 2003; National Research Council, 1989), siendo importante en
la alimentacin de los pobladores altoandinos.
El cultivo de mashua presenta dos importantes limitaciones, una a nivel
alimenticio, presenta un sabor amargo, algo picante debido a la presencia de
itiocianatos (glucosinolatos), siendo marginado de la alimentacin, limitndose
el consumo a ciertas poblaciones altoandinas, a pesar de tener un buen valor
nutricional.
La otra limitacin se da en que la planta de mashua es susceptible al ataque de
virus, disminuyendo as su produccin.
La tcnica de cultivo de tejidos vegetales aparece como una opcin para vencer
estos dos inconvenientes, podemos obtener plntulas con caractersticas
deseables utilizando para ello protocolos de regeneracin in vitro va la
induccin de callos y a travs de la variacin somaclonal para la obtencin de
nuevas lneas de plntulas.
La importancia del cultivo de callos radica en que son usualmente el material a
partir del cual se realizan cultivos de suspensin celular (Dixon, R.A., 1983) y se
pueden realizar estudios fisiolgicos, bioqumicos, produccin de metabolitos
secundarios, etc. Para realizar este tipo de cultivo es necesario lograr una buena
induccin de callos, esto se logra optimizando diferentes factores (fsicos,
qumicos) que influyen en dicha induccin, como por ejemplo los reguladores
del crecimiento.

OBJETIVOS
El objetivo principal de este trabajo es evaluar el efecto de diferentes
reguladores del crecimiento de forma individual o combinatoria sobre explantes
de mashua a fin de obtener una buena induccin de callos en una sola etapa y
en el menor tiempo posible, a fin de que sirva como una etapa previa para
futuros trabajos de seleccin y mejoramiento gentico no convencional en
cultivos in vitro de plntulas de mashua.

METODOLOGIA

Micropropagacin
Plntulas in vitro de mashua (figura 1) fueron propagados en medio
liquido a fin de obtener una mayor cantidad de explantes. El medio
utilizado fue el medio bsico MS (Murashige and Skoog, 1962),
suplementado con sucrosa (2 %), pantotenato de calcio (2 ml), mioinositol
(100 mg) y el pH fue ajustado a 5.6. Se sembraron 2 segmentos nodales
por frasco, incubndose en agitacin continua (80 r.p.m), con un
fotoperodo de 16 h luz y 8 h de oscuridad a 18 C 2, por un periodo de 6
semanas.

Induccin de callos
De las plntulas obtenidas en la etapa anterior se procedi a cortar
segmentos nodales e internodales con longitudes de 3 mm los cuales
fueron colocados en los diferentes medios inductores de callos.
El medio utilizado fue el medio bsico semislido MS suplementado con
sucrosa (3 %), mioinositol (100 mg) y reguladores del crecimiento (ANA,
2,4-D, BAP, KIN) a diferentes rangos (factorial de 18 tratamientos
establecidos), adems se adicion agar (7 g) y el pH se ajust a 5.8,
procedindose a dispensar en frascos magentas (40 ml/frasco). Se
esterilizaron por 20 minutos a 120 libras de presin. Se colocaron 20
explantes por frasco y se incubaron a 18 2, cada tratamiento consisti
de 6 rplicas y se hicieron 3 repeticiones por tratamiento.
El proceso de induccin se realiz en una sola etapa (tiempo de
induccin de 30 das), evalundose semanalmente con la ayuda de un
estereoscopio, a fin de saber cual de los tratamientos establecidos
produjo una mayor induccin de callos, se evalu la sobrevivencia de
explantes, la formacin de callos por explante, adems se observ el tipo
y coloracin del callo inducido y el tiempo necesario para la induccin.
Tambin se evalu cual de los dos tipos de explantes respondi mejor a
los tratamientos inductores.

Tabla de tratamientos utilizados


C1
C2
C3
C4
C5
C6

= MS + ANA (0.5 mg/L)


= MS + ANA ( 1 mg/L)
= MS + ANA ( 2 mg/L)
= MS + ANA (0.5 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)
= MS + ANA ( 1 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)
= MS + ANA ( 2 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)

C7 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L)


C8 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L)
C9 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L)
C10 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + KIN (0.5 mg/L)
C11 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) + KIN (0.5 mg/L)
C12 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) + KIN (0.5 mg/L)
C13 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + KIN ( 1 mg/L)
C14 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) + KIN ( 1 mg/L)
C15 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) + KIN ( 1 mg/L)
C16 = MS + 2,4-D (0.5 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)
C17 = MS + 2,4-D ( 1 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)
C18 = MS + 2,4-D ( 2 mg/L) + BAP (0.5 mg/L)

RESULTADOS
En trabajos preliminares se observ que la induccin de callos vari con el
estado de desarrollo del explante, as para las zonas con mayor tiempo de
desarrollo (zonas con coloracin verdosa) no hubo una buena induccin de
callos, en cambio para las zonas ms jvenes (zonas con coloracin marrn) se
logr una buena induccin.
En base a estas observaciones se procedi a utilizar solamente explantes
jvenes (coloracin marrn).

Los segmentos nodales e internodales desarrollaron callos en la superficie de


los cortes en la segunda semana de sembrados (figura 2), y al trmino de la
tercera semana toda la superficie entera haba sido cubierta por callos (figura 3).
No hubo formacin de callos cuando ambos explantes fueron cultivados en el
medio control (sin reguladores de crecimiento), adems la presencia slo de
auxinas (ANA o 2,4-D) en los medios de induccin no fueron suficientes para
lograr una induccin en los explantes, solo tuvieron efecto con la presencia de
una citoquinina (BAP o KIN).

Se logr inducir callos en ambos explantes, encontrndose variacin en el


porcentaje de induccin de callos, el cual fue dependiente del tipo de explante y
del tipo de regulador del crecimiento utilizado.
Se observ que los segmentos internodales fueron mejores explantes que los
segmentos nodales para la induccin de callos, ya que se logr un mayor
porcentaje en los primeros, as mismo los segmentos nodales fueron inducidos
a formar races en la presencia de ANA o 2,4-D solos o en combinacin con una
citoquinina (figura 4).
Todos los callos inducidos presentaron coloracin verdosa tanto clara como
oscura, en cuanto a la textura del callo, se observ que fue dependiente del tipo
de regulador de crecimiento utilizado, as la combinacin de ANA con BAP
produjo callos compactos (figura 4), 2,4-D con KIN produjo callos de
consistencia compacta y dura (figura 5) y la combinacin de 2,4-D con BAP
produjo callos suaves, blandos (figura 3), pero todos los tipos de callos fueron
no friables.

El mayor porcentaje de induccin de callos se observ en los medios de


induccin con presencia de la citoquinina BAP en combinacin con ANA o 2,4
D (tabla 1 y 2), as para los segmentos internodales se obtuvo un 48.8 % (ANA 2
mg/L + BAP 0.5 mg/L) y un 46.6 % (2,4-D 2mg/L + BAP 0.5 mg/L) y para los
segmentos nodales se obtuvo un 40 % (ANA 2 mg/L + BAP 0.5 mg/L) y un 42.9 %
(2,4-D 2mg/L + BAP 0.5 mg/L)

TABLAS DE RESULTADOS

Tabla1: Resultados mostrados para los segmentos internodales


REGULADORES DEL
CRECIMIENTO
(mg/L)
ANA 0.5
ANA 1
ANA 2
ANA 0.5 + BAP 0.5
ANA 1 + BAP 0.5
ANA 2 + BAP 0.5
2,4-D 0.5
2,4-D 1
2,4-D 2
2,4-D 0.5 + KIN 0.5
2,4-D 1 + KIN 0.5
2,4-D 2 + KIN 0.5
2,4-D 0.5 + KIN 1
2,4-D 1 + KIN 1
2,4-D 2 + KIN 1
2,4-D 0.5 + BAP 0.5
2,4-D 1 + BAP 0.5
2,4-D 2 + BAP 0.5

DIAS PARA
INICIACION
DE CALLOS
0
0
0
10-15
10-15
10-15
0
0
0
15
15
15
15
15
15
12
12
12

% DE
FORMACION
DE CALLOS
0
0
0
40
46.2
48.8
0
0
0
22.7
27.1
32.7
26.1
26.5
32.4
38.8
44.4
46.6

TEXTURA DE
CALLOS
Sin induccin
Sin induccin
Sin induccin
Compacto NF
Compacto NF
Compacto NF
Sin induccin
Sin induccin
Sin induccin
C D NF
C D NF
C D NF
C D NF
C D NF
C D NF
Blando NF
Blando NF
Blando NF

COLOR DE
CALLOS
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde

GRADO DE
INICIACION
DE CALLOS
++
+
++
++
++
+
++
+
+
++
+++
+++

Tabla 2: Resultados mostrados para los segmentos nodales.


REGULADORES DEL
CRECIMIENTO
(mg/L)
ANA 0.5
ANA 1
ANA 2
ANA 0.5 + BAP 0.5
ANA 1 + BAP 0.5
ANA 2 + BAP 0.5
2,4-D 0.5
2,4-D 1
2,4-D 2
2,4-D 0.5 + KIN 0.5
2,4-D 1 + KIN 0.5
2,4-D 2 + KIN 0.5
2,4-D 0.5 + KIN 1
2,4-D 1 + KIN 1
2,4-D 2 + KIN 1
2,4-D 0.5 + BAP 0.5
2,4-D 1 + BAP 0.5
2,4-D 2 + BAP 0.5

DIAS PARA
INICIACION
DE CALLOS
0
0
0
10-15
10-15
10-15
0
0
0
15
15
15
15
15
15
12
12
12

% DE
FORMACION
DE CALLOS
0
0
0
33.3
33.3
40
0
0
0
25
23.8
24
27.5
25.3
32.4
38.1
39.9
42.9

TEXTURA DE
CALLOS
Sin induccin
Sin induccin
Sin induccin
C NF
C NF
C NF
Sin induccin
Sin induccin
Sin induccin
C D NF
C D NF
C D NF
C D NF
C D NF
C D NF
Blando NF
Blando NF
Blando NF

COLOR
DE
CALLOS
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde
Verde

GRADO DE
INICIACION
DE CALLOS
++
+
++
+
+
+
+
+
+
++
+++
+++

NF: CALLOS NO FRIABLES


C: CALLOS COMPACTOS
D: CALLOS DUROS

CONCLUSIONES

La induccin de callos es dependiente tanto de auxina como de


citoquinina, ya que no se logr induccin en los tratamientos sin
citoquininas y en los tratamientos control.

Ambos explantes son inducibles de formar callos, siendo los segmentos


internodales los mejores para lograr la induccin.

Los tipos de callos observados fueron dependientes de la accin


combinada de auxinas y citoquininas.

Todos los callos obtenidos no presentaron friabilidad, es decir no se


pueden disgregar, se presentaron en forma compacta, dura, y blandas.

Todos los callos inducidos presentaron coloracin verdosa, tanta clara


como oscura.

Los mayores porcentajes de callos inducidos se lograron en los medios


con la presencia de BAP en combinacin con ANA o 2,4-D.

Se determin que el medio MS + 2 mg/l (ANA o 2,4-D) + 0.5 mg/L (BAP) fue
el mas efectivo para lograr una buena induccin de callos.

REFERENCIAS
1. Dixon, R.A., 1985. Isolation and maintenance of callus and cell
suspension cultures. Pp 1-20 in Plant cell culture (R.A. Dixon, ed.). IRL
Press, Oxford, UK.
2. Fandio, T., Torres, O. y Perea, M., 1987. Morfognesis y
micropropagacin de Tropaeolum tuberosum (Ruiz y Pavn). Aceviv,
boletn cientifico 2: 29-35.
3. Flores, H.E., Walter, T., Guimaraes, R., Palbais, H., Vivanco, J., 2003.
Andean Root and Tuber Crops: Underground Rainbows. HortScience 38
(2): 161-167.
4. King, S.R., 1987. Four endemic Andean tuber crops: Promising food
resources for agricultural diversification. Mountain Research and
Development 7 (1): 43-52.
5. Murashige, T and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and
bioassays of tobaccos culture. Physiological Plantarum 15: 473-497.
6. Watanabe, K., 2002. Challenges in biotechnology for abiotic stress
tolerance on roots and tubers. JIRCAS Working Report. Pp 75-83.

Figura 1:
A y B: Plntulas de mashua crecidas in vitro.
C: Las flechas indican explantes nodales e internodales.

Figura 2: Induccin de callos blandos a partir de la segunda semana de siembra


en segmentos internodales cultivados en medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y BAP (0.5
mg/L).
Las flechas indican las zonas de crecimiento de los callos.

Figura 3: Induccin de callos a partir de segmentos internodales en medio MS +


2,4-D (2 mg/L) y BAP (0.5 mg/L). A la tercera semana los callos empezaron a
cubrir casi todo la superficie de los explantes.

Figura 4: Induccin de callos a partir de segmentos internodales y nodales en


medio MS +ANA (2 mg/L) y BAP (0.5 mg/L).
A y B: Presencia de callos compactos de coloracin verdosa en segmentos
internodales.
C: Adems de la presencia de callos compactos, se observ induccin de races
y crecimiento de plntulas a partir de los segmentos nodales.

Figura 5: Induccin de callos a partir de segmentos internodales


A: En medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y KIN (1 mg/L).
B: En medio MS + 2,4-D (2 mg/L) y KIN (0.5 mg/L). En ambos se observa la
presencia de callos compactos.