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IBT-UNAM
Mtodos fsico-qumicos en
Biotecnologa (2006-II)
Presentado a:
Indice
INDICE
CAPITULO 1 INTRODUCCIN..................................................................................3
CAPITULO 2 RESEA HISTRICA ..........................................................................4
CAPTULO 3 PCR EN TIEMPO REAL ......................................................................7
3.1 DEFINICIN ............................................................................................................7
3.2 EL ENSAYO..............................................................................................................7
3.3 PRINCIPIO QUMICO DEL ENSAYO ..............................................................................8
3.3.1 Qumica no especfica .....................................................................................9
3.3.2 Primers marcados con fluorforos ................................................................12
3.4 INSTRUMENTACIN PARA EL PCR EN TIEMPO REAL .................................................19
3.5 ANLISIS DE LOS DATOS .........................................................................................23
3.4.1 Ensayos de cuantificacin absoluta ................................................................26
3.4.2 Ensayos de cuantificacin relativa .................................................................26
3.6 ESTRATEGIAS DE NORMALIZACIN .........................................................................30
3.6.1 Cuantificacin de ARN mensajero..................................................................31
CAPITULO 4 APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL .............................36
4.1 VIROLOGA ...........................................................................................................36
4.2 MICROBIOLOGA CLNICA (COSTA, J. 2004) ............................................................37
4.3 INVESTIGACIN BIOMDICA....................................................................................39
4.3.1 Validacin de los resultados de microarreglos de DNA.................................40
4.3.2 Identificacin de mutaciones .........................................................................40
4.4 ORGANISMOS GENTICAMENTE MODIFICADOS (GMO) (BUSTIN, 2005) ..................41
4.5 APLICACIONES FUTURAS Y PERSPECTIVAS (VALASEK ET AL., 2005) ........................41
CAPITULO 5 TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL.................................43
5.1. CALIDAD DEL ARN...............................................................................................43
5.2. DETECCIN NO ESPECFICA ....................................................................................44
5.3. DETECCIN ESPECFICA .........................................................................................45
5.4 LINEARIDAD DEL PASO DE REVERSOTRANSCRIPCIN ................................................46
5.5 ANLISIS DE LOS DATOS .........................................................................................48
5.6 EL NIVEL UMBRAL..................................................................................................50
CONCLUSIONES ........................................................................................................52
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.........................................................................53
Introduccin
CAPITULO 1
INTRODUCCIN
Resea Histrica
CAPITULO 2
RESEA HISTRICA
mundo. El uso de la Taq ADN polimerasa fue uno de los impulsos ms importantes dados
a la tecnologa de PCR (Saiki et al., 1988). Esta enzima fue incluso obtenida de forma
recombinante, con lo que se eliminaron funciones no deseadas de la enzima original. En
1990 ya se contaba con buffers de PCR, dNTPs, MgCl2 y Taq polimerasa de forma
comercial. El mejoramiento de los buffers increment considerablemente la actividad y la
estabilidad de las polimerasas.
Rodrguez M & Rodrguez W
Resea Histrica
A principios de los aos noventa Higuchi y sus colaboradores del Roche Molecular
Systems y de Chiron (1992; 1993) desarrollaron una tcnica de PCR en la cual incluyeron
el bromuro de etidio (EtBr) en el medio de reaccin, la cual se llev a cabo bajo la luz
ultravioleta. Desde el ao 1966, Le Pecq y Paoletti reportaron que este agente intercalante
del ADN de doble cadena fluoresce bajo la luz UV. Esta propiedad fue aprovechada para
grabar la acumulacin de ADN utilizando una videocmara. Esta sencilla reaccin
combinada con la videografa permiti el nacimiento del PCR en tiempo real, el cual
combina la enorme sensibilidad de la tcnica de PCR con la precisin que asegura el
monitoreo in situ de los productos generados por esta reaccin a travs del tiempo.
La primera compaa que desarroll la instrumentacin necesaria para llevar a cabo el
RT-PCR fue Applied Biosystems en el ao 1996, y desde entonces otras compaas como
BioGene, Bioneer, Bio-Rad, entre otras han desarrollado nuevos equipos. Una parte
importante de estas mquinas se utilizan en investigacin acadmica, y de acuerdo a un
estudio realizado en el ao 2003, de 406 investigadores entrevistados, el 48% piensa
realizar RT-PCR en su futuro trabajo (Arlington, 2003). La figura 2.1 muestra el numero
de publicaciones en la base de datos Medline que contienen la palabra real time y
PCR en el ttulo o en el resumen. Como vemos, ocurri un incremento del 43% entre el
2003 y 2004, donde aparecieron 3522 publicaciones (Valasek et al., 2005). Estos datos
demuestran que la tcnica de RT-PCR se perfila como uno de los mtodos de vanguardia
en las ciencias biomdicas, fundamentalmente en el diagnstico molecular y la fisiologa.
Resea Histrica
CAPTULO 3
PCR EN TIEMPO REAL
3.1 Definicin
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa en tiempo real, tambin conocida como Real
Time PCR (RT-PCR) muestra la capacidad de monitorear el progreso de la reaccin de
PCR a medida que esta ocurre. Los datos son colectados a lo largo del proceso de PCR y
no al final como se realizaba antes. Este mtodo revolucion la forma en que se usaba la
tcnica de PCR para cuantificacin de ADN y ARN. El RT-PCR usa molculas de un
reportero fluorescente para monitorear la amplificacin de productos durante cada ciclo de
reaccin. Esta tcnica combina los pasos de amplificacin de ADN y la deteccin en un
nico ensayo y evita tener que preparar geles de electroforesis para detectar los productos
amplificados. Un anlisis apropiado de los datos y/o de la qumica tambin permite
eliminar la necesidad de realizar pruebas de Southern Blot o secuenciacin de ADN para
identificacin de los amplicones. Su simplicidad, especificidad y sensibilidad junto con su
potencial como tcnica en aplicaciones futuras y la evolucin hacia nuevos conocimientos
de la qumica, adems de la confiabilidad en la instrumentacin y protocolos mejorados,
han hecho del RT-PCT una tecnologa altamente competitiva para la deteccin de ADN y
ARN.
3.2 El ensayo
La tecnologa del RT-PCR est basada en la deteccin de una seal fluorescente
producida proporcionalmente durante la amplificacin del ADN blanco (Fig. 3.1). Antes
que revisar la cantidad de ADN blanco producido despus de un nmero fijo de ciclos, las
pruebas de RT-PCR determinan el punto en el tiempo durante el proceso de ciclado
cuando se detecta por primera vez la amplificacin de un producto de PCR. Este se
Desnaturalizacin
Primer
Sonda
Fluorescena
Extensin
Este nmero del ciclo est referido como el ciclo umbral o threshold cycle (Ct). El Ct se
determina en la fase exponencial de la reaccin de PCR y es inversamente proporcional al
nmero de copias del blanco. Por lo tanto cuanto ms alto es el nmero de copias iniciales
de los cidos nucleicos a amplificar, ms pronto se observa un aumento significativo en
la fluorescencia, y son ms bajos los valores de Ct. Los ensayos de RT-PCR son
altamente reproductivos (Fig. 3.2(A)) y pueden discriminar fcilmente entre valores
diferentes de cantidad de templado (Fig. 3.2 (B)).
3.3 Principio qumico del ensayo
El RT-PCR puede utilizar fluorforos generales de unin no especfica a ADN como el
Bromuro de Etidio o el SYBR Green I, sondas de hidrlisis (Sondas 5 nucleasa), sondas
de hibridizacin, molecular beacon o sondas de secuencias especficas (Ej. Scorpions).
Fluorescencia
Fluorescencia
Ciclos
Ciclos
Fig. 3.2 Reproducibilidad y precisin del RT-PCR. Anlisis de una placa de 96 pozos que contiene rplicas
del mismo templado. El ensayo fue llevado a cabo en un instrumento Stratagene MX 4000 usando el mtodo
Taqman. El promedio de Ct para las 96 reacciones es 230.3. (B) Dos reacciones mezcladas, ajustadas por
triplicado. Una contiene 1x103 copias de templado de ADN y marca un Ct de 23.10.15. La otra tiene 2x103
copias de templado de ADN y marca un Ct de 24.10.1. Esto corresponde exactamente al valor esperado de
DCt de 1. (Bustin, S. 2005)
Figura 3.3. Representacin de la interaccin de SYBR green I con el ADN de doble cadena.
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Sonda
beacon
Gen blanco
Emisin de fluorescencia
Gen blanco
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TABLA 3.1 Principales molculas fluorescentes empleadas como marcadores en la PCR a tiempo real
(Costa J, 2004)
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b) Molecular beacons: Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molcula
donadora en el extremo 5 y una aceptora en el extremo 3 pero, adems, presentan una
estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unin especfica
con el ADN diana.
Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no est hibridada, lo que conlleva a
que donador y aceptor estn muy cerca uno de otro. En esta conformacin la fluorescencia
emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.
Sin embargo, al hibridar con el ADN blanco la sonda se abre, alejndose donador y
aceptor, pudindose detectar la fluorescencia emitida por el primero (Fig. 3.9).
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Research. La nica mquina que utiliza lser para la excitacin hasta el momento es el
ABI Prism 7900HT (Valasek et al., 2005).
Para colectar los datos, la energa de emisin de los fluorforos tambin debe ser
detectada en longitudes de onda especficas. Los detectores estn representados por
cmaras acopladas a dispositivos de carga, tubos fotomultiplicadores u otro tipo de
fotodetectores. Generalmente se emplean filtros o canales para detectar pequeos rangos
de longitudes de onda. Usualmente se pueden detectar varias longitudes de onda discretas
simultneamente, lo que permite correr mltiples ensayos en un solo tubo de reaccin.
Otra porcin importante de la instrumentacin consiste en un termociclador efectivo para
llevar a cabo las reacciones de PCR. Es muy importante que estos mantengan una
temperatura consistente a lo largo de todos los tubos de ensayo dado que pequeas
desviaciones de la temperatura resultan en errores graves de cuantificacin (Wilhelm et
al., 2000; Zuna et al., 2002). Un bloque de calentamiento (Peltier o por resistencia) o el
calentamiento por aire, o una combinacin de ambos, son los ms utilizados. Los bloques
calentadores cambian la temperatura ms lentamente que los calentadores de aire, lo que
resulta en ciclos ms largos.
La instrumentacin del PCR en tiempo real no estara completa sin un hardware de
computacin y un software de anlisis de datos apropiado. Los softwares simplifican el
anlisis de los datos arrojando los resultados en forma de grficos que muestran la
amplificacin y disociacin de los productos. Las curvas de amplificacin permiten el
anlisis cintico y la cuantificacin del ADN de partida, mientras que las curvas de
disociacin revelan las caractersticas, entre ellas la pureza, del producto final de la
reaccin.
El primer termociclador de PCR en tiempo real fue
producido por Appied Biosystems de forma comercial en
1997, el ABI 7700 (Fig. 3.13). El sistema de deteccin de
este equipo consiste en un termociclador conectado a un
lser y a un sistema ptico CCD (dispositivo de carga
acoplada, el cual genera una respuesta elctrica
proporcional a la luz que capt). Este equipo detecta un
Fig. 3.13 ABI 7700
fluorescencia se induce emitiendo luz lser simultneamente a todas las muestras a travs
Rodrguez M & Rodrguez W
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El Rotor-Gene de Corbett
Research (www.corbettlifescience.com, Fig. 3.15)
utiliza un diseo de rotor de centrfuga que tiene
numerosas ventajas (Fig. 3.16):
1-Uniformidad ptica: Cada tubo pasa frente la
misma fuente de luz excitatoria, la cual atraviesa las
paredes laterales, y la fluorescencia emitida retorna al
mismo sistema de deteccin, en este caso un tubo
fotomultiplicador. Esto determina que no haya
necesidad de realizar la calibracin ptica del equipo,
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El Rotor-Gene utiliza varios LEDs de diferentes longitudes de onda que estn. acoplados
a un filtro de banda estrecha. Este equipo adems tiene un paso ptico pequeo y menos
complejo que el de los sistemas que utilizan fibra ptica, los cuales tienden a ser lentos,
frgiles y caros. De acuerdo a las necesidades del operador, el sistema de deteccin cuenta
con filtros band pass (que permiten el paso de rangos discretos de longitudes de onda y
por ende se prefieren para los ensayos de multiplexing) y filtros high pass (a travs de
los cuales pasan todas las longitudes de onda por encima de un valor de corte
determinado, lo que incrementa la sensibilidad de la deteccin).
2-Rpida recoleccin de los datos: Todos los tubos pasan por el detector cada 150
milisegundos.
3- Al igual que en el Light Cycler, la rotacin garantiza la uniformidad de la temperatura
del aire del sistema. Adems no hay diferencia entre los tiempos de equilibracin trmica
entre pozos durante los cambios de temperatura. Los fabricantes garantizan que entre
muestra y muestra la variacin de temperatura es menor a 0.01 grados Kelvin. El rotor
opera a velocidad normal cuando est calentando (Aproximadamente 500 rpm), y al
enfriar incrementa la velocidad, por lo que la fuerza centrifuga que se ejerce sobre cada
muestra asegura que no haya condensacin y las burbujas de aire son eliminadas
automticamente.
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Donde la referencia pasiva debe ser un cido nucleico idntico a la muestra que estamos
analizando pero sin el fragmento de secuencia correspondiente al templado, de esta forma
tenemos un control negativo perfecto.
Las curvas de amplificacin constan de tres partes diferentes:
1)
La fase inicial donde no se puede medir a acumulacin del producto de PCR pues
productos
3)
(1)
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(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
El mximo valor de es 2.0 (si se duplica la cantidad de producto en cada ciclo), pero los
valores experimentales de fluctan entre 1.5 y 1.9. Si la eficiencia es baja disminuye la
sensibilidad del ensayo pero permite cuantificaciones con mayor precisin (mayor
reproducibilidad entre repeticiones).
El error en los valores de Ct resultan del ruido de fondo y del mtodo de clculo de Ct. En
ensayos altamente optimizados, podemos obtener errores estndares menores de 0.2
ciclos, asumiendo una eficiencia de amplificacin del 100%, lo que implica que el error
relativo mnimo para la cuantificacin est entre el 10 y el 20%.
El rango dinmico de esta tcnica es extraordinariamente alto, con ms de seis rdenes de
magnitud .
Para calcular la concentracin inicial de nuestro templado se grafica el logaritmo decimal
de las concentraciones de los estndares versus el Ct. El resultado es una recta cuya
pendiente deber ser tericamente igual a 3.32 si tenemos una eficiencia de
amplificacin del 100% (Ecuacin 5). En la prctica, un ensayo es aceptable hasta con un
92% de eficiencia.
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El clculo del rango dinmico se puede realizar en amplificaciones monoplex (un solo
blanco biolgico) o en modelos multiplex (para dos o ms blancos biolgicos
amplificados simultneamente).
Curvas de desnaturalizacin
Estas curvas representan la relacin que existe entre la fluorescencia y la temperatura
(Fig.3.18.a). Se realizan para corroborar la identidad del amplicn luego del ensayo de
PCR, puesto que debe tener una temperatura de desnaturalizacin (Tm) especfica. La
deteccin se puede realizar con intercalantes del ADN como el SYBR Green o con sondas
especficas como los Molecular Beacons. Otras como los Scorpions no pueden utilizarse
pues forman parte del producto de PCR, como tampoco se utilizan las sondas TaqMan,
dado que su seal depende de la hidrlosis de la sonda. Para la caracterizacin de los
productos de la reaccin de PCR se utilizan ms los agentes intercalantes del ADN,
mientras que las sondas especficas se usan para otros estudios como los de
genotipificacin. En estas curvas la seal decrece gradualmente como resultado de la
disminucin de la fluorescencia dependiente de la temperatura y posteriormente
disminuye de forma abrupta debido a la separacin de las dos hebras de ADN. La
temperatura de desnaturalizacin o Tm se identifica como el punto ms alto de la derivada
negativa de la curva de desnaturalizacin (Fig. 3.18.b). En esta representacin adems, el
rea bajo el pico es proporcional a la cantidad de producto, por lo que las curvas de
desnaturalizacin tambin permiten cuantificar la cantidad de producto que tenemos si
contamos con estndares de concentracin conocida (Wilhelm et al, 2003).
3.4.1 Ensayos de cuantificacin absoluta
El objetivo es determinar el nmero exacto de molculas de ADN o ARN presentes en
una muestra. El resultado estar expresado en las mismas unidades que los estndares de
la curva de calibracin (nmero de copias, ng/mL,). Este tipo de cuantificaciones se
emplean para la deteccin y cuantificacin de cargas virales, agentes patgenos o en la
terapia gnica.
3.4.2 Ensayos de cuantificacin relativa
Este tipo de cuantificaciones permite determinar cuantas veces (ms o menos) cido
nucleico se tiene de un templado o una muestra biolgica determinada con respecto a un
tejido o muestra de referencia. Los resultados son expresados de manera relativa por lo
que no se necesita una curva de calibracin con un estndar de concentracin conocida.
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Para ejemplificar este modelo, mostramos la evaluacin de la expresin del gen c-myc en
cuatro tejidos diferentes: hgado, rin, pulmn y cerebro. Se emplea como control
endgeno o normalizador, la expresin de la enzima gliceraldehdo 3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) en estos tejidos. La normalizacin de los tejidos se lleva a cabo
calculando:
Ct pulmn = Ct (c-myc)pulmn- Ct (GAPDH)pulmn
Ct hgado = Ct (c-myc) hgado Ct (GAPDH) hgado
y as sucesivamente con los otros dos tejidos.
Luego calculamos Ct y la expresin relativa de c-myc en pulmn, hgado y rin
tomando como referencia el valor de Ct en cerebro:
Ct pulmn = Ct pulmn - Ct cerebro
Ct hgado = Ct hgado - Ct cerebro
Ct rin = Ct rin - Ct cerebro
y graficamos la expresin relativa de c-
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sin embargo generar resultados cualitativos, pero debemos ser muy cuidadosos si
queremos realizar un anlisis cuantitativo. Afortunadamente, con la tcnica de captura por
microdiseccin utilizando lser se puede cuantificar la cantidad de ARN mensajero
proveniente de un corte de tejido como nmero de copias del templado por rea de
diseccin (Fink et al., 1998).
3.6.1 Cuantificacin de ARN mensajero
El PCR en tiempo real es muy utilizado para la cuantificacin de los niveles de ARN
mensajero, pero existen muchos problemas que pueden afectar la calidad de los
resultados, entre los que se encuentra la variabilidad inherente al ARN, la variabilidad de
los protocolos de extraccin y diferencias en la eficacia de la reverso transcripcin, entre
otros. Es por esto que se hace imprescindible utilizar un mtodo de normalizacin de los
resultados que nos permita una cuantificacin lo ms cercana posible a la realidad
(Huggett et al., 2005).
A) Tamao de la muestra
La primera forma de minimizar el error experimental es partiendo de masas o volmenes
de tejido similares a partir del cual aislaremos nuestro cido nucleico templado.
Desgraciadamente grupos de muestras del mismo tamao no siempre son representativos
entre s. Cuando trabajamos con cultivos celulares en monocapa, muchas veces se
dificulta la estimacin de la densidad celular, no slo por la prdida debido a la
mortalidad sino por cambios morfolgicos y fisiolgicos que pueden ocurrir en las
clulas. Se hace evidente entonces que asegurar muestras de igual tamao, densidad o
peso, minimiza los errores pero no es suficiente.
B) Cuantificacin de ARN
Una cuantificacin precisa y de calidad del ARN que queremos reverso transcribir es
esencial para lograr muestras de partida homogneas. Existen muchos mtodos para
cuantificar ARN, y entre los ms precisos est el uso del reactivo ribogreen, el cual se
intercala de manera precisa en los cidos nucleicos de doble cadena y es mucho ms
sensible que el bromuro de etidio. De esta forma, si tenemos una preparacin
relativamente pura de ARN celular y medimos la cantidad de ARN ribosomal (el cual
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consta de muchas estructuras secundarias) por unin al ribogreen, podemos inferir que el
resto de nuestro ARN, sea mensajero o de transferencia, tambin conserva una buena
integridad. Se utiliza el ARN ribosomal como referencia pues representa
aproximadamente del 85 % al 95% de todo el ARN celular, mientras que el ARN
mensajero se encuentra entre el 2 y el 5%, por tanto se asume que la relacin
ARNr:ARNm no cambia entre grupos de anlisis, lo cual no siempre es vlido. Los
niveles de ARNr varan menos en condiciones que afectan a los de ARNm (Schmittgen y
Zakrajsek, 2000), por lo que su utilizacin como normalizadores se ha vuelto ms
confiable que muchos genes de referencia. Un reporte reciente donde se comparan los
niveles de expresin de ARN entre clulas nucleadas de la sangre en resposo o activadas,
revel que el ARNr 18S es el blanco de referencia ms estable.
En este tipo de anlisis podemos realizar una electroforesis, donde debemos observar dos
bandas bien definidas que corresponden al ARNr 28S y 18S, siendo la de 28S mucho ms
intensa debido a que, en condiciones normales, este ARNr se encuentra al doble de la
concentracin del ARNr 18S (Fig.3.20.a). Tambin podemos utilizar un bioanalizador
(Agilent Bioanalyser) donde, de manera similar a una cromatografa, separamos los ARNr
y se visualiza el cromatograma por tincin con ribogreen. Los tiempos de retencin de los
ARNr 28S y 18S ya son conocidos (Fig.3.20.b). No obstante, la normalizacin de una
muestra respecto al ARN total tiene la desventaja de no controlar las variaciones
inherentes a la reverso transcripcin o a las reacciones de PCR.
C) ADN genmico
La cuantificacin de ADN genmico para la normalizacin pudiera parecer una buena
estrategia, por cuanto no se necesita hacer un paso previo de reverso-transcripcin, pero la
realidad es que existen inconvenientes. Por ejemplo, cuando las clulas estn proliferando,
tenemos mucho ms ADN, lo que puede representar el doble de la informacin gentica
para clulas eucariotas. En el caso de las bacterias o las clulas tumorales, podemos tener
8 copias o ms de la informacin gentica de un cierto loci comparado con clulas que no
se replican. De esta forma aunque partamos de una cantidad de clulas similar, existe
mucha variabilidad en la cantidad de ADN genmico extrado. Otro problema es la
carencia de protocolos altamente estandarizados para una purificacin de ADN genmico
de calidad.
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ARNr 28S
ARNr 18S
Fig. 3.20. Ejemplo de una cuantificacin de ARNr de buena calidad mediante (a) Gel de
agarosa y (b) Agilent Bioanalyser.
D) Genes de referencia
Se utilizan en los ensayos de cuantificacin relativa que describimos previamente. Una de
las ventajas de esta tcnica es que tanto el gen a cuantificar como el normalizador, son
detectados utilizando el RT-PCR en tiempo real. Existen numerosas publicaciones que
subrayan el hecho de que no existe ni un solo gen de referencia universal, pues todos se
regulan de alguna forma y ninguno se expresa constitutivamente en todos los tipos
celulares y bajo cualquier condicin experimental. Muchos de los genes de referencia
clsicos ampliamente utilizados como normalizadores en los RT-PCR en tiempo real
son genes regulados, hecho que se conoce desde mucho antes de que surgiera la tcnica de
PCR en tiempo real. Tal es el caso del ARNr 18S, el cual se sobreexpresa frente a una
infeccin con citomegalovirus, o del gen que codifica para la GAPDH, el cual se
transcribe de manera similar en diferentes tejidos de rata, pero esto no correlaciona con las
cantidades de ARN mensajero encontradas en dichos tejidos. A pesar de estas evidencias,
estos genes de referencia se siguen utilizando como normalizadores sin un proceso previo
de validacin. Reportes recientes han demostrado que muchos de estos genes no pueden
utilizarse como normalizadores. Una de las peores situaciones que se pueden presentar es
que el gen de referencia se vea afectado por las condiciones que queremos evaluar.
La validacin de los genes de referencia est sujeta tambin a los problemas de la
normalizacin. El grado de variabilidad aceptable para un gen de referencia depende de la
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software
se
encuentra
disponible
en
el
sitio
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al ARN de inters. Adems no se vern afectadas por las fluctuaciones propias de los
sistemas biolgicos que muchas veces afectan a los genes de referencia. Sin embargo, la
generacin de estas molculas alien no es asequible a muchos laboratorios, sobre todo
los que realizan pocos ensayos de RT-PCR en tiempo real. La adquisicin comercial de
este tipo de estndares para la normalizacin permanece todava como una idea terica
que no ha sido validada.
En trminos generales, una adecuada normalizacin es crtica para obtener resultados
biolgicos relevantes. Dado que no existe una sola estrategia que sea aplicable a todas las
condiciones experimentales, la clave para una buena normalizacin en los ensayos de
PCR en tiempo real es la demostracin de que el gen utilizado como referencia ha sido
correctamente validado (Bustin et al., 2005).
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Aplicaciones
CAPITULO 4
APLICACIONES DEL PCR EN TIEMPO REAL
36
Aplicaciones
variaciones del mismo virus. (Furuta et al., 2001). Tambin, los estudios epidemiolgicos
han avanzado ya que con la tcnica de RT PCR se puede medir con precisin la cantidad
de dos cidos nucleicos blanco en una sola reaccin. El uso de nuevas estrategias
qumicas ha permitido una mejor discriminacin de mltiples genotipos virales en un solo
recipiente y ha provisto una alternativa a los mtodos de deteccin de virus basados en
ensayos de morbilidad y mortalidad.
El uso del RT PCR ha suministrado datos ms profundos sobre el papel de algunos
compuestos que tienen inhibicin en la reaccin de PCR como tambin ha dado luz sobre
la eficiencia de diferentes mtodos de extraccin de cidos nucleicos de un diverso tipo de
muestras. Esta capacidad de utilizar templados de diversos tipos de muestras, llena un
requerimiento importantsimo para un sistema ideal de deteccin, que es capaz de aplicar
una tecnologa sencilla en muchos campos. Esta flexibilidad se destaca por la deteccin de
cidos nucleicos virales, derivados en diferentes formas de plantas, animales, lodos
urbanos, fluido cerebroespinal, cultivo de tejidos, clulas sanguneas mononucleares,
plasma, suero, saliva y orina.
Tambin, condiciones crticas como sarcoma, carcinoma, neoplastia cervical intraepitelial
y desrdenes linfoproliferativos pueden ser fcilmente estudiados para investigar
relaciones directas o indirectas con infecciones virales. Tambin, el seguimiento de la
carga viral por tcnicas de RT PCR ha sido beneficioso para realizar seguimiento de
pacientes a quienes se les han trasplantado rganos.
Esta tecnologa se est convirtiendo en una herramienta esencial en el aseguramiento de
vectores de terapia gnica viral antes de su uso en pruebas clnicas. Adicionalmente, el
estudio de virus emergentes ha sido complementado con la tcnica de RT PCR como
herramienta para demostrar relaciones existentes entre secuencias virales nicas, seales
clnicas y sntomas de cada paciente.
La velocidad y flexibilidad del RT PCR tambin ha sido de utilidad para los intereses
comerciales y ha sido usada para la deteccin de contaminacin microbiana en
preparaciones de reactivos producidos a gran escala en sistemas de expresin eucariticos.
4.2 Microbiologa clnica (Costa, J. 2004)
Las aplicaciones del RT PCR en el campo de la microbiologa clnica no difieren mucho
de las que utilizan comnmente las reacciones de PCR convencional. Entre ellas se
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Aplicaciones
cuentan el diagnstico etiolgico, el control del tratamiento con antimicrobianos y la
caracterizacin gentica de agentes infecciosos. No obstante, es previsible que gracias a
sus indudables ventajas y a la sencillez de su empleo, la RT PCR haya ido reemplazando a
la PCR convencional y que su aplicacin se extienda a un nmero cada vez mayor de
agentes infecciosos, implementndose progresivamente en la rutina asistencial. Algunas
empresas de diagnstico (Roche Diagnostics, Artus, Abbott, Celera) han hecho ya una
apuesta decidida por la nueva tecnologa y tienen disponibles, o los tendrn en breve, kits
para el diagnstico de los agentes infecciosos de mayor inters comercial mediante
sistemas de PCR a tiempo real (VIH, VHB, VHC, citomegalovirus). Sin embargo, hay
muchas enfermedades infecciosas, con menor inters comercial, en las que el uso de
mtodos moleculares de diagnstico aporta indudables ventajas. La PCR a tiempo real,
combinada con los nuevos sistemas automticos para la preparacin de las muestras,
ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas
moleculares para la identificacin o cuantificacin de esos agentes infecciosos. Es el caso
de muchos virus, (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus, virus JC,
virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como Tropheryma
wippeli, o que crecen mal como Bordetella pertussis o Bartonella o muy lentamente como
Mycobacterium tuberculosis. Tambin, de micosis invasivas, especialmente por
Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por Toxoplasma
gondii en lquido amnitico o en lquido cefalorraqudeo (LCR).
Otro campo potencial de aplicacin del RT PCR es en la identificacin de organismos
fcilmente cultivables, cuya deteccin rpida sea beneficiosa por algn motivo. Por
ejemplo, la identificacin de Streptococcus del grupo B (S. agalactiae) en frotis vaginales.
La colonizacin del tracto genital de mujeres parturientas por este agente se relaciona con
un mayor riesgo de infeccin neonatal grave. El tiempo necesario para el aislamiento de
esta bacteria mediante cultivo es de 1-2 das, mientras que por PCR a tiempo real su
identificacin se puede llevar a cabo en 30 min. La reduccin del tiempo de diagnstico
puede mejorar la prevencin de esas infecciones en recin nacidos. En otros casos, como
la sepsis, la supervivencia del enfermo puede depender de un diagnstico precoz del
agente causal que permita establecer el tratamiento antibitico especfico en etapas
tempranas del proceso. Probablemente en pocos aos se habrn optimizado protocolos de
38
Aplicaciones
PCR mltiple a tiempo real para la identificacin de los 10 o 20 agentes ms frecuentes de
la sepsis en unas pocas horas.
Lgicamente, la PCR a tiempo real no va a reemplazar al hemocultivo, porque la sepsis
puede estar ocasionada por una variedad de microorganismos mucho ms amplia, pero la
demora en el tratamiento se podr reducir en un nmero considerable de casos, lo que sin
duda puede mejorar el pronstico de este grave proceso.
El xito de un tratamiento no slo se basa en un diagnstico etiolgico precoz, sino que en
muchas ocasiones la determinacin rpida de la sensibilidad del agente causal a los
frmacos antimicrobianos puede ser determinante. La PCR a tiempo real proporciona
mtodos giles y sencillos para la identificacin de mutaciones puntuales asociadas con
resistencias a frmacos antimicrobianos. Por ejemplo, en apenas una hora se puede
determinar la presencia en heces de enterococos resistentes a vancomicina, facilitando el
control de la transmisin de este patgeno en los centros sanitarios. En los ltimos aos se
han desarrollado mtodos sencillos para la deteccin rpida de mutaciones asociadas con
resistencias a meticilina en Staphylococcus aureus y a rifampicina y a isoniacida en
Mycobacterium tuberculosis. Tambin se han descrito procedimientos para la
identificacin de mutaciones asociadas con resistencia a agentes antivricos, como la
lamivudina en VHB. Hoy da ya estn disponibles kits comerciales para algunas
aplicaciones comentadas en este apartado y en el futuro irn apareciendo muchos otros.
Incluso para las enfermedades infecciosas menos frecuentes estn, o estarn disponibles,
protocolos bien optimizados, sencillos y rpidos para que puedan ser implementados en la
rutina asistencial.
No obstante, hay que hacer hincapi en que esta potente metodologa slo ser til si los
laboratorios de microbiologa clnica participan en programas de control de calidad bien
definidos por entes gubernamentales.
4.3 Investigacin biomdica
Gran parte de los desarrollos alcanzados en la tecnologa de RT PCR tuvieron sus inicios
en investigaciones puntuales que llegaron a trminos comerciales. Este estudio primario
de diferentes fenmenos asociados a las disciplinas de biomedicina, bioqumica y
biotecnologa es necesario tanto en empresas de diagnstico como en empresas cuyos
departamentos de Investigacin y Desarrollo son cruciales para sus futuros desarrollos.
Rodrguez M & Rodrguez W
39
Aplicaciones
El RT PCR ha llegado a ser absolutamente comn en la investigacin bsica dentro de las
ciencias biomdicas. Cuando se requieren datos de expresin gentica para un proyecto
de investigacin, est tecnologa puede ser utilizada. Sin embargo, hay usos adicionales
que son particularmente tiles a la investigacin bsica. El RT PCR se puede utilizar para
genotipificar modelos de tipo knockout, knockin o de ratones transgnicos o para
determinar la eficacia de los mtodos en sistemas de clulas animales o en cultivos
celulares. Con el uso del RT PCR para la discriminacin de alelos, la deteccin de
polimorfismos en un solo nucletido (SNP), que pueden predisponer a individuos a
enfermedades particulares, puede determinarse en poblaciones, facilitando as los estudios
epidemiolgicos.
4.3.1 Validacin de los resultados de microarreglos de DNA
Debido a la confiabilidad del PCR en tiempo real, muchos investigadores utilizan el
mtodo de cuantificacin relativa o absoluta de la expresin de genes para validar y
corroborar los resultados de los microarreglos de DNA o arreglos de oligonucleotidos
(Por ej: Affymetrix GeneChip). Los microarreglos son usados porque permiten que un
investigador observe de una manera imparcial cmo la manipulacin experimental
puede afectar algunos de los miles de genes presentes en el microarreglo. Algunos
microarreglos pretenden contener el genoma entero de un organismo modelo y pueden
ser as tericamente probados para determinar cambios en la expresin dentro del
transcriptoma entero. El problema es que puede haber artificios, y es difcil conseguir
datos cuantitativos confiables o con poder estadstico adecuado con la actual tecnologa de
arreglos. As muchos investigadores escogen el RT PCR como tcnica de soporte para
validar y para cuantificar mejor los genes de inters de sus microarreglos.
4.3.2 Identificacin de mutaciones
El RT PCR se ha usado idealmente para el anlisis de mutaciones, incluyendo los
polimorfismos de un slo nucleotido (SNP), substituyendo a menudo otras tcnicas tales
como la secuenciacin, anlisis del polimorfismo conformacional de una sola hebra, y
anlisis de polimorfismos de fragmentos de restriccin. Para detectar mutaciones en la
secuencia, el anlisis de la curva de fusin se hace automticamente en el producto
40
Aplicaciones
amplificado (amplicon) inmediatamente despus del termociclado y de la medicin de la
fluorescencia.
Aunque cualquiera de las qumicas fluorescentes descritas en el numeral 3.3 de este
documento se puede utilizar para la deteccin de mutaciones, las sondas de hibridacin
son de uso frecuente. Despus de que se completa la reaccin de PCR, las sondas de
hibridacin se unen al amplicn en tndem, permitiendo que la energa fluorescente se
transfiera del donante al aceptor, el cual emite una seal. Como la temperatura de reaccin
del recipiente aumenta durante el anlisis de la curva de fusin, la sonda donadora se
disociar, dando como resultado una disminucin en la fluorescencia. Si hay alguna
mutacin en el amplicn (en la regin de hibridacin), la sonda donadora se unir menos
fuertemente y disociar a una temperatura ms baja. As las mutaciones pueden ser
detectadas fcilmente observando un cambio en el punto de fusin del producto de PCR.
Este tipo de anlisis puede tambin ser utilizado para genotipificar
organismos
41
Aplicaciones
usar, el desarrollo de ensayos estandarizados, y los avances en microfluidos, la ptica, y
los termocicladores, se podrn cubrir ms campos de aplicacin. En el sector alimenticio y
la agricultura, la tcnica de RT PCR puede probablemente ampliar el uso para deteccin e
identificacin de microorganismos, parsitos u organismos genticamente modificados.
Las ciencias forenses se pueden beneficiar de la sensibilidad, especificidad, y velocidad
de las tcnicas de RT PCR, especialmente porque el tiempo es crucial para muchas
investigaciones criminales y el tamao de la muestra puede ser limitado. La reduccin en
el costo y la disminucin en los tamaos de los equipos abren una puerta para el
diagnostico de enfermedades en reas alejadas junto con los estudios epidemiolgicos in
situ y pueden facilitar la transferencia de tecnologas cientficas a los pases en vas de
desarrollo. Ya que la demanda para medir la expresin gentica es poco probable que
disminuya, nuevas generaciones de mquinas para RT PCR deben ser desarrolladas.
Como las computadoras, las primeras generaciones de mquinas debern ser
relativamente ms baratas y por lo tanto se incrementar el acceso global y el aumento de
la tecnologa. La enseanza del RT PCR podr ser usada como una plataforma para
introducir conceptos claves en biologa molecular, as como tambin una oportunidad para
dar a los estudiantes habilidades cientficas relevantes. El RT PCR generar un foco de
atencin hacia el transcriptoma, permitiendo a los investigadores entender mejor los
programas transcripcionales que son la base de la fisiologa, la patofisiologa, y
desarrollo.
La evolucin de la ciencia y de la tecnologa de la biologa molecular puede ser vista
cronolgicamente por pocas que estn marcadas por la maduracin del estudio de
biomolculas particulares. Bsicamente, el anlisis del DNA (genmica) fue primero
realizado en el proyecto del genoma humano. Ahora, el anlisis de los perfiles de
expresin del RNA (transcriptmica) est alcanzando madurez. El futuro inminente
promete grandes saltos en anlisis de las protenas (protemica), y en lpidos biolgicos o
intermediarios metablicos (lipmica o metabolmica, respectivamente). Se espera que
los pedazos del rompecabezas biomolecular puedan ser juntados, conduciendo a una
comprensin ms holstica de la biologa. Para formar una figura coherente, sin embargo,
sern necesarios avances paralelos en la adquisicin, la compilacin, y el anlisis de
datos.
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CAPITULO 5
TRAMPAS DEL RT-PCR EN TIEMPO REAL
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Fig. 5.1.
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Fig. 5.2
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Fig. 5.3. A. Curva de amplificacin donde el nivel umbral seleccionado de 0.12 no detecta resultados
claramente positivos. B. La reduccin manual de la lnea umbral permite tomar en cuenta los resultados
positivos de Ct para todas las muestras, donde tambin se incluye ahora el NTC (morado).
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Conclusiones
CONCLUSIONES
Como hemos visto a travs de todo este trabajo, la tcnica de PCR en tiempo real es
altamente poderosa y puede generar resultados reproducibles con significado biolgico.
Sin embargo, est ms que demostrado que hay que tomar muchas precauciones durante
la planeacin, la ejecucin del ensayo y el anlisis e interpretacin de los resultados. En el
futuro ser necesario introducir nuevos estndares y reportar todo el procedimiento para
establecer guas confiables que puedan validar los resultados experimentales y que sean
utilizadas por los editores para la revisin rigurosa de las publicaciones. En resumen, el
PCR en tiempo real es una tcnica que debe ser tratada con respeto.
52
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