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Incubar en estufa 37C hasta la aparicin de las placas de lisis (> de 5 hs).
Determinacin del ttulo del lisado P22HT transductante (Parte 1).
Realizar diluciones seriadas del lisado (dil. 10-2, 10-4, 10-6 y 10-7) en tubos eppendorf
estriles. El grupo 1 y 2 de la comisin usarn el lisado transductante obtenido a partir
de la cepa HB303 (golS::KmR, golB::lacZ-CmR), mientras que los grupos 3 y 4 el lisado
obtenido a partir de la cepa HB405 (cueR:: KmR, copA+::lacZ-CmR). Estos lisados
sern dados por el docente.
Colocar aproximadamente 3 ml de LB soft en dos tubos de hemlisis y llevar a bao a
~ 60C para que no solidifique.
Mezclar 100 l de las 2 ltimas diluciones con 100 l de un cultivo saturado de S.
enterica 14028s en un tubo de hemlisis estriles.
Punto Crtico: La infeccin ha comenzado por lo que no debe dejarse mucho tiempo la mezcla
en el tubo. Es por esto, que el LB soft debe estar listo en este punto.
Incubar en estufa a 37C hasta la aparicin de las placas de lisis (> de 5 hs).
Da 2:
Obtencin del lisado P22HT transductante (Parte 2).
Luego de la incubacin, agregar 5 ml de LB sobre la placa conteniendo el lisado de
fagos y romper la capa de LB soft con una esptula de Drygalski hasta homogeneizar.
Transferir 1 ml de la mezcla a un tubo eppendorf, agregar 200 l de cloroformo y
mezclar con vrtex.
Centrifugar 5 min a 12000 rpm y trasvasar el sobrenadante a un tubo eppendorf (no
flamear los tubos que contienen cloroformo a la llama del mechero!). Agregar
cloroformo. Este lisado lo usar otra comisin.
Determinacin del ttulo del l lisado P22HT transductante (Parte 2).
Contar las unidades formadoras de placas (UFP) presentes en cada placa y estimar el
nmero de ufp/ml en el lisado original.
Transduccin generalizada (Parte 1).
Realizar diluciones seriadas del lisado transductante (dil. 10-1 y 10-2). Cada grupo usar
el lisado cuyo ttulo determin.
En tubos eppendorf estriles realizar las siguientes mezclas.
TUBO
1
2
3
4
5
ON Salmonella
(5 x 109 ufc/ml)
50 l
50 l
50 l
50 l
50 l
Lisado P22
Placa
transductor LBA(EGTA)
50 l (puro)
Cm/Km
-1
50 l (dil. 10 )
Cm/Km
-2
50 l (dil. 10 )
Cm/Km
50 l (dil. 10-1)
Cm
(-)
Cm
Da 3:
Transduccin generalizada (Parte 2).
Hacer recuento de las colonias obtenidas. Completar la tabla usando la informacin de
los otros grupos y sacar conclusiones. Puede concluir cul fue la mejor MOI para el
ensayo de transduccin. Puede justificar las diferencias encontradas entre las cepas.
Tubo
1
2
3
4
5
Marcador
de
Seleccin
Cm/Km
Cm/Km
Cm/Km
Cm
Cm
MOI
N Colonias para
lisados de cepa
HB303
N Colonias para
lisados de cepa
HB405
Da 2 (Parte 1)
Da 3 (Parte 2)
Punto
Crtico
PREGUNTAS Y PROBLEMAS
1. Cmo se determina el ttulo de un fago? En qu unidades se expresa?
2. Qu tipos de transduccin conoce? Mencione las diferencias entre ellas.
3. Cul es la diferencia entre los mecanismos de transduccin generalizada mediada por
los fagos P1 y P22?
4. Qu tipo de partculas se pueden distinguir en un lisado de un bacteriofago que hace
transduccin generalizada (P22)? y en un lisado que hace transduccin especializada (?
5. Es posible transferir plsmidos por transduccin?
6. A qu se llama multiplicidad de infeccin o MOI? Qu MOI se debe usar al realizar
una transduccin?
7. A qu distancia mxima deben encontrarse dos marcadores para que los mismos se
transduzcan juntos en un experimento de cotransduccin? Cmo vara la frecuencia de
cotransduccin con la distancia a la que se encuentran dos marcadores?
8. De qu factores depende la frecuencia de transduccin mediada por un fago? Cules
de ellos pueden ser mejorados?
9. Un investigador aisl recientemente un fago que crece en E. coli. Este fago realiza
transduccin generalizada en algunas cepas de E. coli y transduccin especializada en
otras.
a) Cmo podra distinguir entre transduccin generalizada y especializada usando
un test gentico simple?
b) Sugiera una explicacin para estos resultados.
10. Yanofsky aisl dos mutantes trpA (trpA8 y trpA17). Para determinar el orden de las dos
mutaciones trpA respecto al gen trpE, realiz el experimento de transduccin con P1
descrito a continuacin:
Donor: trpA17 trpE+
Aceptor: trpA8 trpEMarcador seleccionado: trpA+ 100 colonias
Marcadores encontrados: trpA+ trpE+ 10 colonias; trpA+ trpE- 90 colonias
En base a estos resultados, cual sera el orden ms adecuado de estos genes? (Determine si
el orden es trpE trpA8 trpA17 o trpE trpA17 trpA8)
11. Se lleva a cabo un experimento de transduccin con P1 para determinar el orden de
sitios de mutacin en el gen trpA de E. coli, utilizando una mutacin ligada estrechamente,
llamada ant, como un marcador no seleccionable. En cada una de las cruzas listadas
debajo, son seleccionados recombinantes Trp+ y luego testeadas para el alelo ant+ o ant-.
El genotipo de la donante es dado en primer trmino y el porcentaje de recombinantes
Trp+ que es ant+ es dado entre parntesis.
Cruza 1: ant+ trpA34 x ant - trpA223
Cruza 2 ant+ trpA46 x ant - trpA223
Cruza 3: ant+ trpA223 x ant trpA34
Cruza 4: ant+ trpA223 x ant trpA46
(18% ant+)
(52% ant+)
(50% ant+)
(20% ant+)
XP1 insertado en su cromosoma. Cuando se realiza una conjugacin con la cepa V13 como
donadora, se observa que solamente se transfieren los genes hasta el gen e. Es decir que los
genes ms all del e nunca son transferidos. Sugiera una explicacin para este fenmeno.
18. El represor termosensible cI857 es desnaturalizado reversiblemente, cuando las clulas
son calentadas a 40C. Si luego del calentamiento, las clulas se vuelven a 34 C o menos,
el represor se renaturaliza, y se vuelve nuevamente activo.
a.
Se est transcribiendo el gen cI de un lisgeno a 40 C?
b.
Qu pasa si la temperatura se vuelve a 34 C?
c.
Si un lisgeno cI857 es calentado durante 10 min y luego enfriado, se
lleva a cabo el desarrollo del fago durante su incubacin en el medio de cultivo. Si
en cambio el lisgeno es enfriado luego de 5 min, no hay desarrollo del fago y las
bacterias sobreviven. Explique.
19. Una cepa A lisognica de un fago b, el cual posee una protena represora r
termosensible (a 42C se induce el ciclo ltico), es crecida en medio lquido LB a 30C toda
la noche. Se realizan diluciones (10-2, 10-4, 10-6 y 10-8) del cultivo y se siembran 100 l de
cada una en placas de medio slido LB-agar y se incuban toda la noche a 30C y a 42C. Se
observa que a 42C crecen algunas colonias slo en las placas que se sembraron las
diluciones mayores. a) Explique qu ha ocurrido. b) Por qu slo crecen a 42C en las
placas de mayor dilucin? c) Estas colonias crecidas a 42C siguen siendo lisognicas o
no? Por qu?
20. Se desea obtener una cepa de E. coli con el genetipo gal+ leu- trp-. Disee los
experimentos genticos que realizara, disponiendo de las cepas bacterianas, bacterifagos
y plsmidos que se detallan ms abajo, para llegar a la construccin deseada.
ABC-
Bacteriofago P1
Bacteriofago
pBR322::recA+ (AmpR)
El orden de los marcadores genticos en el cromosoma de E. coli es gal leu trp str y la
distancia entre gal y str es de 30 kb.
Indique en detalle los medios que utilizara en cada seleccin y fundamente cada uno de
los experimentos que realizara.
21. Existe un sitio secundario de attachment para el fago lambda dentro del gen proB del
opern proBA.
a) Dibujar un diagrama mostrando cmo un profago integrado en este sitio puede generar
partculas transductoras especializadas.
b) Cmo se podra usar este lisado transductor para obtener un lisado transductor de alta
frecuencia que lleve proA+?
GUA SEMINARIO 1:
El artculo de Datsenko y Wanner de ttulo One-step inactivation of chromosomal genes
in Escherichia coli K-12 using PCR products describe una metodologa para hacer
mutantes no polares. Es decir hacer una disrupcin en uno o ms genes sin afectar los
genes codificados corriente abajo de los genes mutados. Lo novedoso de esta metodologa
es que logran delecionar un gen introduciendo a la bacteria ADN lineal (obtenido por PCR)
y que se logra hacer la recombinacin entre dos regiones homologas entre s pero de una
longitud de tan slo 36 pb. Esto es novedoso porque E. coli normalmente degradara el
ADN lineal y adems su maquinaria de recombinacin requiere regiones ms largas. Lo
que hacen los autores para evitar la degradacin y que ocurra la recombinacin entre
regiones muy chicas es usar el sistema Red del fago lambda. Adems, otra cosa novedosa
que introducen los autores es el uso de la recombinasa FRT. Con ella logran curar el casete
de resistencia introducido gracias al sistema Red dado que dicho casete cuenta con
secuencias FRT adyacentes. Estas secuencias son el blanco de accin de FLP. La figura 1
del paper resume la ms importante de toda la metodologa desarrollada por los autores.
El objetivo de este seminario es evaluar las distintas herramientas genticas que emplean
los autores para desarrollar la metodologa antes descripta por eso no se le va a exigir al
alumno que ahonde en los detalles de la construccin de todas las disrupciones que los
autores hicieron. Las 40 construcciones fueron hechas para probar la robustez de la
metodologa por lo que la comprensin de la funcin de los genes, los fenotipos y
genotipos de las cepas que van a ser mutadas as como los fenotipos resultantes escapan
del objetivo del seminario. Debajo se enumeran una serie de preguntas que intentan
orientar al alumno hacia los aspectos ms relevantes del trabajo de Datsenko y Wanner.
Breve cuestionario gua:
1. Cmo se disean los primers para hacer las mutaciones? Dnde hibridan estos para
levantar el casete de resistencia? Qu regin del primer va a ser necesario para que el
producto de PCR se recombine con el cromosoma de E. coli?
2. Por qu lo controlan la expresin del sistema Red de Lambda? Cmo lo hacen?
Para qu construyen el plsmido pKD20 con un replicn sensible a la temperatura?
3. Cmo chequean que el casete se introdujo en el locus indicado en el cromosoma de E.
coli?
4. Qu es FLP? Acta por recombinacin homloga o sitio especfica? Para qu curan
el casete de resistencia?
5.