Generacin de anticuerpos

(http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?
p=Aplicacion_anticuerpos&opc=tecnicas)
Los anticuerpos son protenas que son producidas por el sistema
inmunolgico en respuesta a molculas externas que entran en el
cuerpo, estas molculas externas son los llamados antgenos, y su
reconocimiento molecular por el sistema inmunolgico da como
resultado la produccin selectiva de anticuerpos que son capaces de
unirse especficamente a ese antgeno. Los anticuerpos son
producidos por los linfocitos B y circulan a travs de la sangre donde
se unen a su antgeno especfico, permitiendo ser eliminados de la
circulacin.
Esta habilidad del sistema inmunolgico animal para producir
anticuerpos para unirse especficamente a los antgenos nos permite
fabricar marcadores que nos permiten la deteccin de molculas de
inters
en
aplicaciones
de
investigacin
y
diagnstico.
Otra de las caractersticas de los anticuerpos que nos ayudan a
utilizarlos como herramientas de reconocimiento es su relativa
uniformidad y su buena estructura caracterizada que nos permite
purificarlos, marcarlos y detectarlos de una manera predecible y
reproducible
por
mtodos
generalizados.
Durante los 70 y 80 se generaron protocolos de produccin,
purificacin y modificacin para uso de deteccin especfica de
antgenos, y siguen relativamente vigentes. La produccin de
anticuerpos necesita la preparacin de animales, inyeccin del
antgeno en el laboratorio para provocar la alta produccin de
anticuerpo y su posterior recoleccin. Alternativamente las lneas
celulares de hibridomas producen monoclonales especficos para un
antgeno se pueden producir por fusin de una clula que secreta un
anticuerpo especfico con una lnea inmortal de mieloma.
La purificacin de anticuerpos incluye el aislamiento del anticuerpo
del suero (anticuerpos policlonales), fluido asctico, sobrenadante de
cultivo de una lnea celular de hibridoma (anticuerpo monoclonal). Los
mtodos de purificacin varan desde muy crudos (precipitacin de
las protenas de la muestra incluyendo cualquier anticuerpo
presente), a purificacin general (purificacin por afinidad de ciertas
clases de anticuerpos sin tener en cuenta la especificidad al antgeno)
hasta la especfica (purificacin por afinidad de los anticuerpos que se
unen especficamente a un antgeno en concreto. El nivel de
purificacin necesaria depende de la aplicacin para la cual queremos
utilizar el anticuerpo.

TIPOS DE ANTICUERPOS
Estructura de una inmunoglobulina

Los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son glicoprotenas compuestas de una o ms

unidades, cada una de ellas contiene 4 cadenas de polipptidos:
- 2 cadenas idnticas, son las llamadas cadenas pesadas (H)
- 2 cadenas idnticas, son las llamadas cadenas ligeras. (L)
Las amino terminales de las cadenas polipptido tienen una alta variacin en la
composicin de aminocidos y son consideradas como las regiones variables (V) para
distinguirlas de las consideradas relativamente regiones constantes (C).
Cada cadena L consiste en un dominio variable VL y un dominio constante CL.
Las cadenas H consisten de un dominio variable VH y 3 dominios constantes CH1, CH2 y
CH3.
Cada cadena pesada tiene alrededor del doble de aminocidos (peso molecular aprox.
50.000) que la cadena ligera, resultando aproximadamente un peso molecular de
150.000.
Las cadenas pesadas y ligeras se unen por la combinacin de interacciones no covalentes
e interacciones covalentes de enlaces disulfuro, formando una estructura simtrica
bilateral.
Las regiones V de las cadenas H y L comprenden las sitios de unin con el antgeno de la
molcula de la inmunoglobulina (Ig). Cada monmero Ig contiene 2 sitios de unin de
antgenos.

Clases de inmunoglobulinas
Las 5 clases primarias de inmunoglobulina son IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Estas se
distinguen por el tipo de cadena pesada que se encuentra en la molcula:
- Molculas IgG con cadena pesada conocidas como cadena -

IgM como cadena -

IgA como cadena
IgE la cadena
IgD como la cadena

Diferencias en polipptidos de la cadena pesada permite a estas inmunoglobulinas

funcionar en diferentes tipos de inmuno respuestas y en diferentes estadios de la inmuno
respuesta. La secuencia de la protena poliptido responsable de estas diferencias se
encuentran primeramente en los fragmentos FC. Mientras hay 5 diferentes tipos de
cadenas pesadas solo hay 2 tipos principales de cadenas ligeras. Kappa y Lambda.
IgG, como monmero, es la clase Ig predominante en suero humano. Producida como
parte de la inmuno respuesta secundaria de un antgeno, lo que representa el 75% del
total de Ig del total del suero. Debido a su relativa abundancia y excelente especificidad
hacia un antgeno, IgG es el principal anticuerpo usado en investigacin y diagnstico.
IgM existe como un pentmero en mamferos, predomina en respuestas inmunes
primarias a los antgenos y es el 10% de las Ig en suero humano. Las IgM tambin se
expresa como monmero en la membrana de los linfocitos B. Es el receptor de antgenos
de las clulas B, y la cadena H contiene un dominio hidrofbico para anclarse en la
membrana. Monmeros de IgM se unen a travs de enlaces disulfuro y una cadena de
unin (J).
IgA existe en suero en dos formas, monomrica y dimrica, constituyendo
aproximadamente el 15% del total de Ig. Las IgA de secrecin, un dmero, es el primer
mecanismo de defensa contra alguna infeccin local por su abundancia en membranas de
secrecin (saliva, lgrimas). La principal funcin de las IgA de secrecin puede no se de
destruir el antgeno, si no prevenir la introduccin de sustancias externas al sistema
circulatorio.
IgD e IgE se encuentran en suero en cantidades mucho ms pequeas que otras Igs. IgD
de membrana es un receptor de antgenos encontrado principalmente en linfocitos B
maduros. Las IgE defienden primeramente la invasin parasitaria.
Adicionalmente a la mayor clase de inmunoglobulinas, hay diferentes subclases de Ig
basadas en menores diferencias en el tipo de cadena pesada de cada una de las clases Ig
existentes en todas las membranas de cada especie animal. En humanos hay 4 subclases
de IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 nombradas en orden decreciente de su concentracin
en suero). Su variacin es menor que la variacin en la clases de Ig.

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Anticuerpos policlonales y monoclonales

Los anticuerpos (sin importar su clase o subclase) se producen y purifican en dos formas
bsicas para su uso como reactivos en inmunoensayos: policlonales y monoclonales.
Normalmente, la respuesta inmunolgica a un antgeno es heterognea, resultante de
diferentes lneas celulares de linfocitos B (precursores de las clulas del plasma)

productores de anticuerpos para el mismo antgeno. Todas estas clulas originarias de

clulas madre comunes, desarrollan un anticuerpo que detecta un eptopo diferente del
mismo antgeno. Como consecuencia de esta heterognea respuesta, el suero de un
animal inmunizado contendr numerosos clones de anticuerpos especficos de un
antgeno, potencialmente de diferentes clases y subclases de Ig comprendiendo sobre el
2-5% del total de Ig. Debido a esta coleccin heterognea un anticuerpo purificado de
esta muestra se llama anticuerpo policlonal. Los anticuerpos policlonales son
especficamente tiles como anticuerpos secundarios marcados en inmunoensayos.
Si un linfocito B individual produce y secreta solo una molcula de anticuerpo especfica,
los clones de linfocitos B producen anticuerpos monoclonales. Todos los anticuerpos
secretados por un clon de clula B son idnticos, proveen una fuente de anticuerpos
homogneos con una especificidad definida y especfica. Aunque los linfocitos B se
pueden separar de una suspensin, tienen una vida limitada y no se pueden cultivar para
producir una cantidad suficiente de anticuerpo.
Afortunadamente esta restriccin ha sido superada con el desarrollo de la tecnologa de
hibridoma, en la que los linfocitos B aislados se fusionan con clulas de mieloma e la
misma especie para crear lneas celulares hibridas de monoclonales que son virtualmente
inmortales que mantienen su capacidad de producir anticuerpos monoclonales. Estos
hibridomas se pueden guardar congelados y cultivar para producir anticuerpos
monoclonales en grandes cantidades.
Los anticuerpos monoclonales son usados como anticuerpos primarios en aplicaciones
que requieren especificidad a un solo eptopo. Los clones de hibridoma se pueden hacer
crecer en cultivos celulares para recoger los monoclonales en el sobrenadante o crecerlos
en la cavidad peritoneal de un ratn para recolectarlo del fluido asctico.

PURIFICACIN DE ANTICUERPOS

Los anticuerpos son protenas, por lo que los mtodos de purificacin a partir de muestras
biolgicas (suero, fluido asctico o sobrenadante de cultivo) son formas especializadas de
los mtodos de purificacin de protenas. La purificacin se puede hacer en forma cruda,
es decir precipitando todas las inmunoglobulinas y otras protenas, o solo los anticuerpos
que puedan fijarse a un antgeno especfico.
La purificacin cruda de anticuerpos se puede hacer con diferentes mtodos como
precipitacin con persulfato de amonio, adsorcin tioflica o cromatografa de intercambio
inico. Estos mtodos son tiles dependiendo de la aplicacin en la que vayamos a utilizar
nuestro anticuerpo. En aplicaciones a mayor escala normalmente se utiliza el intercambio
inico para purificar un tipo de inmunoglobulina, en cambio en investigacin y en
produccin a pequea escala se utiliza ms la purificacin por afinidad.
La cromatografa por afinidad (purificacin por afinidad), un ligando es unido a un soporte
slido, como por ejemplo crosslinkado a gel de bolas de agarosa. La muestra fluida sa a
travs del soporte material permitiendo que las inmunoglobulinas se unan al ligando
inmovilizado. Mientras que los componentes que no se han unido se lavan y eluyen del
soporte. Posteriormente ponemos un buffer que nos cambie las condiciones del medio y
haga que se rompa la unin entre la inmunoglobulina y el ligando de manera que
podamos eluir nuestro anticuerpo en una forma purificada.
Proteica A, protena G y sus formas recombinantes, son componentes de la pared celular
bacteriana que se unen a la regin Fc de las inmunoglobulinas y son de lejos las ms
escogidas para purificar IgG por afinidad. La protena L es la tercera protena de origen
bacteriano que ha sido desarrollada para usarla en purificacin anticuerpos por afinidad,
se une a diferentes clases de inmunoglobulinas (por ejemplo IgG, IgM, IgA) siempre y
cuando tengan la cadena ligera Kappa. Algunas lectinas se unen especficamente a IgA
humana. Mannan binding protein (MBP) nos permite purificar IgM tanto humana como
de ratn.

Como en cualquier mtodo de purificacin, los buffers de unin como de elusin son
componentes importantes en la purificacin de anticuerpos cuando se usan los ligandos
comentados anteriormente. Generalmente, la fuerza inica y el pH son los factores ms
importantes afectando la eficiencia de unin y consecuentemente la elusin de las
inmunoglobulinas de estos ligandos. Sin embargo, la temperatura y otros componentes
son tambin importantes en casos particulares.
Para purificar anticuerpos especficos contra antgenos, hemos de inmovilizar el antgeno
a un soporte y lo utilizamos para purificar por afinidad las inmunoglobulinas que se unan
a l.

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PRODUCCIN DE ANTICUERPOS
Produccin de anticuerpos policlonales
El proceso de produccin de policlonales es relativamente sencillo, se inmuniza el animal
y el sistema inmunolgico de este responde al antgeno para producir anticuerpos contra
la molcula inyectada. Sin embargo, esta produccin depende de este sistema biolgico
complejo, los resultados no son predecibles. Los animales individualmente e incluso de la
misma identidad gentica, responden de manera diferente generando anticuerpos
diferentes contra la molcula inyectada. Sin embargo con el conocimiento bsico de
cmo responde el sistema inmunolgico a la inyeccin de una molcula exterior y con las

herramientas adecuadas para la inyeccin, un investigador puede aumentar mucho las

probabilidades de obtener un anticuerpo til.

El sistema inmune
El sistema inmune es un sistema de vigilancia diseado para proveer proteccin al
inquilino de invasores externos. La vigilancia se produce por protenas y clulas que
circulan por el organismo para identificar y destruir clulas externas, virus o
macromolculas.
La proteccin inmune es proveda por un sistema dual compuesto por la respuesta
celular inmune y por la respuesta humoral inmune. La respuesta celular inmune es
producida por los linfocitos T y no puede ser transferida de un individuo a otro por
transfusin de suero. La inmunidad humoral envuelve las protenas solubles
encontradas en suero (anticuerpos) que se pueden transferir cuando el suero es
transfusionado.

Inmunogenicidad
- Antgenos e inmungenos
Una generacin satisfactoria de anticuerpos depende de la unin de linfocitos B,
procesando y presentando el antgeno al linfocito helper T, el cual seala la clula B
a producir y secretar anticuerpos. Un antgeno es cualquier molcula ques es
identificada como no propia por los componentes del sistema inmune. Un
inmungeno es un antgeno que es capaz de provocar una respuesta inmune
incluyendo la produccin de anticuerpos va respuesta inmune. Todos los
inmungenos son antgenos pero no todos los antgenos son inmungenos. Es
importante tenerlo en cuenta porque para producir anticuerpos es importante
convertir los antgenos en inmungenos en el caso de que no sean antes de
inyectarlos al animal, y para ello los unimos qumicamente a otras molculas
inmungenas.

- Propiedades que determinan la inmunogenicidad

Inmunogenicidad es la habilidad de una molcula para crear una respuesta
inmune.
Para que una molcula sea inmunognica tiene que cumplir tres caractersticas:
Externa, alto peso molecular y complejidad qumica.
Tiene que ser externa para que el sistema no la reconozca como propia y la ignore.
Generalmente los compuestos de un organismo no son inmunognicos al mismo
individuo y son inmunognicamente pobres para individuos de la misma especie.
En cuanto al peso molecular, compuestos de tamao pequeo (ej. MW<1.000 o
MW 1.000-6.000) no son inmunognicos). La mayora de los compuestos con MW>
6.000 son inmunognicos.

- Macromolculas como inmungenos

Es posible hacer ciertas generalizaciones sobre la inmunogenicidad de las 4
mayores clases de macromolculas: Carbohidratos, lpidos, cidos nucleicos y
protenas. Los carbohidratos son solo inmunognicos si tienen una estructura
relativamente compleja de polisacridos o forman parte de una molcula ms
compleja, como glicoprotenas.
Los lpidos normalmente no son inmunognicos pero pueden hacerse si se
conjugan a una protena crrier. Lo mismo les pasa a los cidos nuclicos.
Por su complejidad y tamao, las protenas son generalmente buenas
inmungenas. Dado que la gran mayora de inmungenos naturales son
macromoleculas compuestas por protenas, carbohidratos o una combinacin de los
dos, es perfectamente entendible que las protenas son ampliamente
inmunognicas. Los pptidos pueden tener la complejidad necesaria para ser
inmunognicos, pero su pequeo tamao normalmente les hacer ser poco

inmunognicos por si solos. Normalmente los pptidos se conjugan a un carrier

para provocar una respuesta inmune y producir anticuerpos.

- Haptenos y eptopos
Pptidos otras molculas pequeas que se usan como antgenos les llamamos
haptenos. Son antignicos, no inmunognicos. Los haptenos pueden hacerse
inmunognicos unindolos a un carrier.
Un eptopo es el sitio especfico del antgeno donde se une el anticuerpo. Para
antgenos muy pequeos, prcticamente la estructura completa puede actuar como
eptopo. Dependiendo de su complejidad y tamao, un antgeno puede causar la
produccin de diferentes anticuerpos dirigidos a varios eptopos. Los anticuerpos
policlonales son mezclas de inmunoglobulinas y colectivamente se unen a mltiples
eptopos en el antgeno. Los anticuerpos monoclonales por definicin contienen un
solo clon de anticuerpo y es especfico en su unin a un eptopo en particular.
Anticuerpos especficos se pueden generar contra casi una nica estructura, natural
o sinttica, siempre que sea posible presentarla al sistema inmune de forma que
sea inmunognica. Los anticuerpos resultantes se pueden unir a eptopos
compuestos de molculas enteras, grupos funcionales particulares de molculas
grandes, grupos de aminocidos funcionales en estructuras terciarias de protenas,
una nica estructura en lipoprotenas, glycoprotenas, RNA, DNA o polisacridos.
Los eptopos puedn ser tambin partes de estructuras celulares, bacterias, hongos
o virus.

Carriers
Una protena carrier es cualquier protena usada para unirse con pptidos u otros
haptenos que no son suficientemente grandes o complejo por s mismos para inducir
una respuesta inmune para producir anticuerpos. El carrier, como es grande y
complejo, confiere inmunogenicidad al hapteno conjugado, resultando la produccin
de anticuerpos de eptopos del hapteno y el carrier. Muchas protenas se pueden usar
como carriers y se escogen basndonos en inmunogenicidad, solubilidad y
disponibilidad de grupos funcionales en los cuales podemos conjugar el hapteno. Los
dos ms usados comnmente son Keyhole Limpet Hemocayanin (KLH) y Bovine
Serum Albumin (BSA).
En una respuesta inmune tpica los anticuerpos son producidos por linfocitos B
(normalmente en conjuncin con clula T-helper y clulas presentando-antgeno). En
la mayora de los sistemas carrier-hapteno, las clulas B producirn anticuerpos que
son especficos para ambos, el hapteno y el carrier. En el sistema clsico haptenocarrier, Los linfocitos T reconocen el carrier y coopera con las clulas B las cuales
induce una respuesta anticuerpo-especfica al hapteno.
Una respuesta anticuerpo se dirigir contra eptopos a ambos, carrier y hapteno, es
muy importante planificar cuidadosamente como los anticuerpos especficos al
hapteno van a ser identificados y purificados del suero inmunizado final. Para crear el
inmungeno mejor, puede ser beneficioso preparar el conjugado con difertentes
carriers y con diferentes ratios de unin hapteno-carrier.

- KLH como carrier

KLH es ampliamente usado como carrier por su gran peso molecular (agregados de
450.000-8.000.000 kDa compuestos de subunidades de 350 y 390 kDa) y muchos
grupos lisina disponibles. Es una protena que contiene cobre que pertenece a un
grupo de protenas llamadas hemocianinas que se encuentran en artrpodos y
moluscos. KLH se asla del molusco Megathura Crenulata. Cationes divalentes
ayudan en la formacin de grandes agregados. Los agregados del KLH no se
disocian con la simple extraccin de los cationes divalentes de la suspensin.
Mientras el KLH es 5 estados diferentes de agregacin en buffer TRIS, PH 7.4, se
disocia reversiblemente a estados de agregados menores o subunidades
individuales con cambios moderados de PH y se disocia completamente a PH 8.9.

Cada subunidad contiene sitios de unin de oxgeno, y una molcula de oxgeno se

puede unir por cada 2 tomos de cobre en KLH. La protena que contiene oxgeno
es azul, mientras que la que no contiene oxgeno es incolora. La extraccin del
oxgeno tambin disocia la protena a estados de agregados menores. Cuando el
KLH se disocia en subunidades se espera que se unan ms anticuerpos porque
habr ms sitios antignicos disponibles.
Debido a su tamao, KLH muchas veces es poco soluble en agua. Mientras esto no
afecta a su inmunogenicidad , la manipulacin del KLH en solucin puede ser difcil.
Incluso retirando las partculas insolubles de la solucin de KLH, es difcil
determinar la cantidad de KLH presente. Las soluciones de KLH son turbias, por lo
que las lecturas de absorbancia a 280 son imprecisas.
Imject Mariculture Keyhole limpet Hemocyanin de Pierce est purificada y liofilizada
en un buffer estabilizante. Despus de su reconstitucin, la solucin-suspensin es
un azul opalescente, lo cual es caracterstico de altamente purificado, KLH no
desnaturalizado. Los productos Imject mcKLH de Pierce ofrecen las ventajas
combinadas de alta inmunogeneicidad y buena solubilidad en agua, haciendolos
ideales para la conjugacin hapteno-carrier.
Tradicionalmente, KLH se obtena de Keyhole Limpets gigantes recolectados de su
ambiente natural. Este mtodo distorsionaba el frgil ecosistema donde vivan. Los
mtodos actuales son mucho menos agresivos al hbitat natural y ahora se
cultivan en tanques (cultura marina o mariculture), donde se les saca la sangre
como una donacin de sangre humana y as pueden vivir durante muchos aos.
Adems de ser obtenido con un mtodo medioambiental ms amigable, mcKLH
tiene algunas ventajas sobre el KLH obtenido tradicionalmente. Lo ms importante
para su uso como carrier, mcKLH ha mejorado su uniformidad y solubilidad, por lo
que el buffer que contiene altas concentraciones d cloruro sdico no es necesario
para prevenir la precipitacin de la protena durante la reaccin de conjugacin con
el hapteno y su uso. Todos los productos de Pierce carrier KLH usan mariculture
KLH.

- BSA y OVA como carriers

La albmina srica bovina (BSA; peso molecular 67.000) pertenece a la clase de
protenas sricas llamadas albminas. Las albminas constituyen ms o menos la
mitad del contenido de protenas del plasma y son bastante estables y solubles.
BSA es mucho ms pequea que el KLH pero es completamente inmunognica. Es
un carrier bastante popular para compuestos poco antignicos. BSA es un
polipptido de cadena simple con 59 residuos de lisinas, 30-35 de los cuales tienen
aminas primarias que son capaces de reaccionar con reactivos de conjugacin.
Tiene numerosos grupos carboxilatos que dan al BSA su carga negativa neta (PI
5.1). Imject BSA es un BSA altamente purificado que una vez reconstituido puede
usarse para conjugas haptenos sin dualizaciones ni purificaciones posteriores.
BSA es utilizado comnmente en el desarrollo de inmunoensayos porque es
completamente soluble y tiene numerosos grupos funcionales tiles para
croslinkar a pequeas molculas que de otro modo no se uniran eficientemente a
las placas de poliestireno. Adems, BSA se utiliza mucho como estndard para
ensayos de protenas, como tiene carga tambin se utiliza como marcador de peso
molecular en SDS-PAGE y tambin como reactivo de bloqueo. Sin embargo, este
mltiple uso del BSA requiere que tengamos cuidado para evitar reacciones
cruzadas con el carrier en protocolos de screening de anticuerpos en aplicaciones
finales.
Por esta razn, BSA se utiliza frecuentemente como protena carrier no-relevante
en screening de anticuerpos e inmunoensayos despus de usar KLH para provocar
la respuesta inmune contra el hapteno. Solo usando diferentes carriers en la misma
inmunizacin y pasos de screening/purificacin podemos asegurarnos la deteccin
de anticuerpos hapteno-especfico en vez de carrier-especfico.

Ovoalbmina (OVA; peso molecular 45.000) se puede usar como carrier. Es

tambin conocido como albmina de huevo, constituye el 75% de las protenas en
los huevos de gallinas. OVA contiene 20 grupos lisina y se utiliza principalmente
como carrier secundario (screening) mejor que para inmunizaciones, aunque es
inmunognica. Tambin contiene 14 residuos de cido asprtico y 33 residuos de
cido glutmico que aportan grupos carboxilo, lo cuales se pueden utilizar para la
conjugacin con los haptenos. OVA es un polipptido de cadena simple con muchos
residuos hidrofbicos y un punto isoelctrico de 4.63. La protena se desnaturaliza
por encima de 56C o cuando se le somete a corriente elctrica o se agita
vigorosamente. OVA es inusual entre las protenas en siendo soluble en altas
concentraciones de solvente orgnico DMSO, permitiendo conjugaciones con
haptenos que nos son solubles en buffers acuosos.

Adyuvantes
Para aumentar la respuesta inmune a un inmungeno, se puede utilizar varios aditivos
llamados adyuvantes. Cuando se mezcla y se inyecta con un inmungeno, un adyuvante
aumentar la respuesta inmune. El adyuvante no es el sustituto del carrier porque
aumente la respuesta inmune al inmungeno porque no puede hacer que el hapteno sea
inmunognico. Los adyuvantes son estimuladores no especficos de la respuesta inmune,
ayudando a anclar o secuestrar el material inyectado y causando un aumento dramtico
en la respuesta de anticuerpo.
Hay muchos adyuvantes populares, incluyendo los Freunds complete adjuvant (FCA).
Este reactivo consiste de una emulsin agua-aceite y mycobacterium muerto. La
emulsin de agua-aceite localiza el antgeno durante un largo periodo de tiempo, y el
mycobacterium atrae los macrfagos y otras clulas apropiadas al sitio de inyeccin. El
FCA es usado en las inyecciones iniciales. Las siguientes inyecciones usan inmungeno en
una emulsin con FCA que no contiene el componente mycobacterial. FCA son muy
efectivos, pero ponen en riesgo al animal y el experimento por la toxicidad del
componente mycobacterial.
Imject Alum es igualmente efectivo y una alternativa ms conveniente a los FCA. La
preparacin de la muestra con los Imject Alum es simplemente mezclar el antgeno con
la solucin de adyuvante, y a continuacin la inyeccin.
Otra alternativa a los FCA es el Adjuprime Immune Modulator. Es un adyuvante
carbohidratado no txico y fcil de administrar en una sola fase acuosa. Estas
caractersticas nicas le hace ms fcil y seguro de usar que el FCA. El adjuprime es una
diana de macrfagos y adyuvante de liberacin sostenida de antgeno. Prporciona un
amplio espectro macromolecular y antgenos oligopptidos a la superficie celular del
macrfago y estimula la respuesta humoral al antgeno. El Adjuprime genera una
respuesta de anticuerpo equivalente al FCA sin la respuesta inflamatoria asociada.

Proceso
Los animales normalmente utilizados son conejos, ratones, ratas, cobayas, gallinas,
cabras, caballos, ovejas, vacas y llamas.
Uno de los factores importantes en la produccin de policlonales es el background, y
para reducirlo lo ms importante es utilizar animales libres de patgenos y que no hayan
sido inmunizados anteriormente. Otro factor es el estrs antes y durante la
inmunizacin, y para reducir este factor es importante anestesiar el animal en la
inyeccin, extraccin de la sangre y mantenerlo en una sala limpia y acondicionada.
Cada productor de anticuerpos puede tener su propio programa y puede variar entre 60
y 100 das de inmunizacin.

En funcin de nuestras necesidades podemos crear policlonales prcticamente contra

cualquier molcula como por ejemplo protenas, pptidos, DNA y molculas qumicas.

Anticuerpos contra protenas versus contra pptidos

Lo mejor es tener un anticuerpo contra nuestra protena, pero lo ideal es tener un
anticuerpo contra un eptopo de nuestra protena, pero tal como hemos comentado
tendremos una mezcla de anticuerpos contra diferentes eptopos, por ello tenemos la
posibilidad de crear anticuerpos contra pptidos de nuestra protena, lo que nos
proporcionar una mayor especificidad de nuestro policlonal, aunque tenemos el
riesgo de que no sea reconocido en nuestro ensayo porque puede quedar en el
interior de nuestra protena plegada en el caso de que queremos detectarla de forma
nativa.
Para crear anticuerpos contra pptidos es muy importante seleccionar bien el pptido
de nuestra protena, y para ello debemos tener en cuenta diferentes parmetros: su
hidrofobicidad, es decir, si este pptido puede estar en la parte externa de nuestra
protena plegada o en su interior. Su antigenicidad. Prediccin de estructuras
secundarias. Y prediccin de la probabilidad de que est en la parte superficial de la
protena. Normalmente el pptido sintetizado puede tener un tamao entre 10 y 17
aminocidos. Despus hemos de sintetizar el pptido y acoplarlo a un carrier.
La cantidad de antgeno necesaria en la inmunizacin puede ser aproximadamente:
Animal

Antgeno/inyeccin

Ratn

40 microgramos

Rata

50

Cobaya

50

Cabra

400

Oveja

400

Llama

400

Gallina

200

Conejo

100

Programa clsico de inmunizacin

Como hemos comentado se pueden establecer diferentes programas de inmunizacin
en funcin de la aplicacin posterior del policlonal y la dificultad que presente nuestro
antgeno.
Ante la posibilidad de que el antgeno pueda provocar daos al animal y causar su
muerte, siempre se recomienda utilizar como mnimo dos animales para asegurarnos
la produccin de los policlonales.
- Un programa estndar de inmunizacin para conejos sera el siguiente:

Da

14

28

Inyeccin

Sangrado

Preinmune

38

56

66

87

20 ml

60 ml

2 ml

- Programa para inmunizacin de huevos:

Da

14

28

Inyeccin

Yema de
Huevo

Preinmune

38

56

66

87

Huevos*

(*) Los huevos se recogen entre el dia 38 y el 87 y se mezclan por semana y por
gallina.

- Programa para inmunizacin de ratones:

Da

14

28

Inyeccin

Sangrado

Pre-inmune

38

350 ul

Produccin de anticuerpos monoclonales

Como hemos comentado un monoclonal es un anticuerpo que reconoce un solo eptopo.
La produccin se puede dividir en 5 fases:
1.
2.
3.
4.
5.

Inmunizacin.
Fusin.
Screening y amplificacin del hibridoma.
Clonacin e isotipado
Produccin del monoclonal

Vamos a describir un programa estndar, el cual puede ser modificado segn las
necesidades.
Fase I: Inmunizacin.
En este paso utilizamos ratones de una edad aproximada de 6-8 semanas. Para poder
servirnos de referencia de la efectividad de la inmunizacin cogemos suero preinmune
del ratn en el da 0. A cada uno de los ratones se le suministra 4 inyecciones con una
cantidad de 50 ug de antgeno por inyeccin y por animal. En todas las inyecciones
utilizamos la misma cantidad de volumen de antgeno como de Freunds complete
adjuvant (FCA). La primera inyeccin en el da 0, el resto de las inyecciones cada 3
semanas.
A los 10 das de la ltima inyeccin seleccionamos por elisa cual es el ratn con una
mejor respuesta inmune.
Este proceso puede durar unas 11 semanas.
Fase II: Fusin.

Esta fase la podemos realizar de dos maneras diferentes:

1. Clsica
2. Electrofusin
1. Sistema clsico:
Cogemos los linfocitos, del ratn con una mejor respuesta inmune tal como hemos
comentado, y los fusionamos con une lnea celular tumoral (por ejemplo SP2- Ag14) utilizando Polietileno Glycol (PEG) para formar un hibridoma (clula resultante
de la fusin de las dos clulas con caractersticas similares a ambas, que
expresar anticuerpos de manera permanente). Los hibridomas resultantes los
sembraremos en placas de 96 pocillos en medio HAT.
Este proceso puede durar 2-3 semanas.
2. Electrofusin:
En el sistema clsico fusionbamos los dos tipos de clulas utilizando reactivos
qumicos y dndole un tiempo para que esta fusin sucediese de manera
espontnea. En la electrofusin lo que hacemos es utilizar un campo elctrico
para fusionar las clulas, para ello tenemos 4 pasos diferentes:
a. Alineacin y compresin: para ello utilizamos un proceso llamado
dielectroforesis, es decir un campo elctrico no uniforme y cambiante. Es
necesario porque un cuerpo sin carga (en este caso la clula) no se mueve,
pero si el campo elctrico va cambiando las cargas internas de las clulas
formarn un dipolo y har que la parte positiva de la clula se mueva hacia el
polo negativo del electrodo y as las clulas se van alinendose formando una
cadena de manera que la parte positiva de una clula se una con la negativa
de otra.

b. El segundo paso es aplicar un campo elctrico ms fuerte para que las

membranas formen poros y se puedan abrir para fusionarse. Este pulso es
parecido al de la transfeccin, en este caso las membranas de clulas
adyacentes al estar ambas abiertas se pueden unir y se fusionan.
c. Este tercer paso se trata de aplicar un campo elctrico dbil y cambiante para

mantener las clulas alineadas y de tiempo para que maduren y se unan los
citoplasmas.
d. En el cuarto paso es despus de la maduracin de la unin de las membranas
las clulas se cultivan para promover su viabilidad y su crecimiento.
Escreening y amplificacin del hibridoma
- Las IgG producidas por los hibridomas se testan contra el antgeno deseado.
- Las colonias positivas se expanden y se testan otra vez contra el antgeno.
- En este punto tambin podemos testar otros antgenos u otras regiones de nuestro
antgeno para ver posibles reacciones cruzadas que nos puedan interferir en
nuestro ensayo final.
Por ejemplo las tcnicas para testar los IgG pueden ser Elisa, western blot e
inmunofluorescencia.
Esta fase puede durar aproximadamente 5-7 semanas.
Clonacin e isotipado
Los hibridomas especficos seleccionados se clonan por dilucin limitada, es decir
diluimos los pocillos que nos han dado positivos en la fase anterior y volvemos a
sembrar, para que en cada pocillo solo quede un clon. Para seleccionar el clon de
inters podemos hacer el escreening como en la fase 3, primero contra el antgeno
utilizado en la inmunizacin y posteriormente los positivos contra otros antgenos.
Una vez seleccionado el clon, a continuacin vemos la subclase de cada uno de los
monoclonales por un test de Elisa.
Fase 5: Produccin de monoclonal
En esta fase es cuando obtenemos nuestro anticuerpo monoclonal en grandes
cantidades, se puede realizar de dos maneras diferentes:
1. Inmunizacin de ratones.
2. Cultivo celular.
1. Inmunizacin de ratones:
Se trata de inyectar el hibridoma en la zona peritoneal del ratn para que
produzca anticuerpos del hibridoma introducido, de manera natural. Al cabo de
10-15 das podemos extraer el medio asctico del ratn y purificar el anticuerpo.
Aproximadamente podemos obtener unos 5-10 ml de fluido por cada uno de los
ratones inmunizados.

2. Cultivo celular
Este es un sistema In Vitro donde no utilizamos animales para producir nuestros
anticuerpos monoclonal.
Cultivamos nuestro hibridoma seleccionado en un frasco de cultivo con los
nutrientes adecuados, de esta forma los hibridomas expresan el anticuerpo
monoclonal al medio de cultivo donde lo recogeremos y purificaremos. Los
anticuerpos los recogeremos cada 5-7 das y cambiaremos el medio para aportar
nuevos nutrientes.
Otro tipo de produccin In Vitro es con un sistema en continuo de nuestros
hibridomas y el medio de cultivo. Se usa la tecnologa de Holow -Fibre, los

hibridomas se colocan en un birreactor que contiene las Holow -Fibre a travs de

las cuales circula el medio de cultivo fresco, los capilares de la Holow -Fibre son
porosos y a travs de ellos pueden pasar los nutrientes a las clulas y los
metabolitos de las clulas pasan al interior de las fibras para ser eliminados, los
anticuerpos secretados y las clulas no pueden pasar al interior de la fibra debido
a su tamao. Los parmetros de cultivo como puede ser el nivel de oxgeno y PH
se pueden regular externamente. De esta manera podemos producir anticuerpos
de forma continua ya que tambin los podemos extraer de forma continua, de
manera que alargamos el tiempo de cultivo y tambin el rendimiento en la
produccin de anticuerpos monoclonales. Al ser un sistema cerrado nos
aseguramos que la probable contaminacin del cultivo sea mnima.
La ltima innovacin en bioreactores a pequea escala son los llamados Celline

En una cmara intermedia colocamos el hibridoma para que produzca el

anticuerpo monoclonal, en la cmara superior tenemos el medio de cultivo y esta
dos estn en contacto a travs de una membrana con un tamao de poro de
10.000 KDa a travs de la cual se produce el intercambio de nutrientes y
metabolitos. En una cmara inferior encontramos un espacio vaco por donde
entrar el oxgeno y el CO2 que nos proporcionar el intercambio gaseoso con los
hibridomas a travs de una membrana de silicona.
A nivel industrial podemos producir nuestro anticuerpo monoclonal para tener un
gran cantidad utilizando bioreactores, en los cuales pondremos los hibirdomas en
la superficie de partculas porosas que estn en suspensin. A estas partculas se

les adhieren los hibridomas en los poros, y debido a su gran superficie nos
permite tener un gran nmero de clulas en cultivo, unido a la gran capacidad de
los bioreactores, podemos producir monoclonales en cantidades importantes.
Tambin podemos hacer pequeas producciones en el laboratorio con partculas
en suspensin con los llamados Cellspin, un sistema de agitacin para mantener
las partculas en suspensin y producir nuestro anticuerpo a escala media.

Tambin podemos utilizar frascos rodantes a nivel industrial o laboratorio. Las

clulas se adhieren a la superficie del plstico y al rodar el frasco las clulas van
adquiriendo los nutrientes necesarios para producir y liberar los monoclonales.