UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

E.A. P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

ASIGNATURA: BIOQUIMICA
SEMESTRE 2014-I
PRACTICA 9

ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE UNA PROTEASA ACIDA

I.

OBJETIVOS
Evaluar la actividad de la pepsina y evaluar el hidrolizado de protenas.

II.

INTRODUCCIN TEORICA
Las proteasas cidas se denominan as porque actan a bajo pH. La pepsina fue la
primera al que se dio la denominacin de proteasas por Schwann 1825, otros miembros son la
quimosina (renina) que se usa en la fabricacin de queso. La catepsina (que est implicada en
el ablandamiento post morten de la carne)
PEPSINA
La pepsina est constituida por una cadena poli peptdica sencilla que contiene 327 restos de
aminocidos con un PM de 34,644 daltons. La Ser-68 est fosforilada pero este fosfato se
puede eliminar sin que se alteren significativamente las propiedades catalticas del enzima. Al
igual que en otras proteasas, el sitio activo es un rea extensa que se puede acomodar como
mnimo cuatro a cinco y quizs hasta siete, restos de aminocidos. El enzima presenta una
preferencia por los aminocidos hidrofbicos en cualquiera de los lados del enlace escindible.
La hidrolisis de las protenas demuestra que tiene especificidad por la Leu, Phe, Trp y Glu en el
sitio S1 y por Trp, Tir, Iso y Phe en el sitio S1.
La pepsina se segrega como un zimgeno precursor, el pepsingeno por las clulas
principales gstricas. El cido gstrico activa el pepsingeno activo segregado, siendo 2 el pH
ptimo.

La pepsina contina actuando en el estmago cido y slo se inactiva tras el paso del quimo al
duodeno, donde se produce la neutralizacin. El cido activa la pepsina.
ENDOPEPTIDASA DIGESTIVAS

3.4.21.n
3.4.23.n

Proteinasas de serina (especialmente las enzimas pancreticas: tripsina y

quimotripsina)
Proteinasas cidas o aspartato proteinasas grupo en el que se sitan la
mayor parte de las enzimas utilizadas para la coagulacin de la leche:
enzimas de origen animal (quimosina 3.4.23.4; pepsina 3.4.23.1)

MECANISMO DE ACCIN
En la pepsina hay dos residuos catalticos activos, el Asp-32 y el Asp-215. Sus
ionizaciones se observan en el perfil de actividad frente al pH (2-3) y que depende de la forma
cida de un grupo de pKa cercano a 4.5 y de la forma bsica de un grupo de pKa de alrededor
de 1.1

Mg.Rosario Calixto Cotos

Las pepsinas contienen fsforo mientras que la quimosina carece de l. Se encuentran de 1 a 3

tomos de fsforo en la pepsina II y de 0 a 2 en la pepsina I, Cuando se examina por
electroforesis a la pepsina II se observa la presencia de 5 a 6 componentes pero tras la
desfosforilacin enzimtica aparece slo uno. La pepsina bovina II es estable a un pH ms
elevado que la pepsina de cerdo.
La actividad proteoltica es a pH 2. Se inhibe a pH superiores a 6.6 por ello no coagula las
leches frescas.
ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS
Quimosina
Pepsina bovina
II(B)
II(A)
pH
ptimo
de 3.4
7.0
<2
actividad proteoltica
sobre la Hb
pH para un 50% de 8.15
7.45
7.85
inactivacin
Peso molecular
34,400
30,000(?) 33,400
Datos de Antonini Ribadeau (1971) (1)

Pepsina
porcina
<2

7
34,500

QUIMOSINA
Es el componente principal de los cuajos. Se secreta en el abomaso (cuajar) bajo una
forma inactiva, la proquimosina. Se transforma en enzima activa por un proceso autocataltico
acelerado por los iones H+ como en el caso del pepsingeno. La activacin es instantnea a pH
2. En el curso de la activacin, de la parte N-terminal de la proenzima se separan pepidos
bsicos.
La quimosina A es ms activa que la quimosina B, de la que slo se distingue por una
sustitucin Asp/Gli en la posicin 290 de su cadena peptdica; la forma B es siempre
predominante. La tercera forma C es un componente menor. La quimopsina es una
holoprotena y no contiene tomos de fsforo (ni de metal, ni de glcidos). El pH ptimo cuando
el sustrato es la casena de vaca, se acerca a 4.
La actividad enzimtica se medir por la desaparicin del substrato (disminucin de la
turbidez en los tubos que contiene albmina), y la lectura se puede realizar entre 420-460 nm.
La hidrolisis de la albmina produce aminocidos libres, pptidos de cadena corta y larga.
Estos productos pueden ser evaluados mediante el reactivo de Biuret el cual puede ser medido
por colorimetra a una long. de onda a 545 nm.
III. PARTE EXPERIMENTAL
III.1. MATERIALES Y REACTIVOS
Gradilla, pipetas de 1, 2 y 5 mL, tubos de ensayo y probetas 50 ml
Bombilla, bao de agua 37C, espectrofotmetro
Agua destilada, ovoalbmina, pepsina, HCl 0.1N, NaOH 0.1N
III.2. PROCEDIMIENTO
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA

Fundamento: La velocidad de una reaccin enzimtica a concentraciones saturantes

de sustrato, dependen linealmente de la concentracin de la enzima.

Mg.Rosario Calixto Cotos

Preparar la siguiente batera de tubos:

Tubos

ml agua destilada

2.7

2.4

2.1

1.5

0.3

ml HCl 1N

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

ml albmina

Pepsina preincubada por 5 minutos en otro tubo A

1. Preincubar a 37C por 5 min los tubos del 1 al 5, e inmediatamente.
aadir la pepsina preincubada a los tubos del 2 al 5, segn el siguiente esquema:
Tubos
1
2
3
4
5
Pepsina 1%
-----0.3
0.6
1.2
2.4
Incubar a 37C por 7 min. Detener la reaccin colocando los tubos en bao
de agua helada.
Observar la turbidez de los tubos
IV. REPORTE DE RESULTADOS
1. Realiza la ecuacin enzimatica que se desarrolla en la reaccin., en los tubos 1,2 y 5
1.
2. ..
3. ..
.
2. Al terminar la reaccin enzimtica, que significa mayor turbidez y menor turbidez
La presencia de turbidez indica: ..
3. Explique si los productos constituyen hidrolizados de protenas.

4. Conclusiones :

V.

VI.
2.

CUESTIONARIO
1. Establezca mediante un cuadro 5 diferencias entre la pepsina y la quimosina.
2. Cul es el mecanismo de accin de la quimosina?
3. Mencione 4 inhibidores alimentarios de la pepsina.
4. La actividad enzimatica se puede expresar por formacin de productos, explique cmo lo
realizara, explique el mtodo.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Alais Charles. Ciencias de la leche. Principios de la Tcnica lechera. Ed. Reverte S.A 2005.
Fenema Qumica de los alimentos Ed.Acribia. 3era edicin, p.374, 2007
3. Robinson David. Bioqumica y valor nutritivo de los alimentos. 2da edicin. Editorial
Acribia 1991. Zaragoza.

Mg.Rosario Calixto Cotos

Mg.Rosario Calixto Cotos