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Manual de Prcticas
del
Laboratorio de Biorreactores
ndice
PRCTICA 1
Prctica 1. Presentacin de biorreactores diversos
Presentacin de
biorreactores
diversos
INTRODUCCIN
Cualquier proceso biotecnolgico de nivel industrial tuvo que haber pasado por las
siguientes escalas de operacin: laboratorio, planta piloto e industrial (en ese orden
temporal).
Cada escala tiene sus propias caractersticas y objetivos, mismos que sern tratados en
otra asignatura (Ingeniera de Bioprocesos), sin embargo, al hablar de biorreactores
habr que hacer la distincin entre tamaos, forma de operacin y configuracin
geomtrica.
Entre las caractersticas que debe reunir un biorreactor se encuentran las siguientes:
CLASIFICACIN DE BIORREACTORES
Agitado
Biorreactores
Columna
Propelas
Circulacin
Airlift
Jet
Biorreactores agitados
Cuentan con un motor al que se acopla la flecha de transmisin que contiene a su vez
los impulsores que agitarn el lquido. Dependiendo del tamao del reactor, el motor
puede colocarse en la tapa superior o en la inferior, pero invariablemente se requiere de
sellos mecnicos para garantizar el trabajo asptico. Generalmente la aireacin se
realiza a travs de tubos (o placas) perforados, efectundose la dispersin del aire en
las zonas cercanas a los impulsores.
Biorreactores de columna
Biorreactores de circulacin
OBJETIVO
Dado que uno de los aspectos formativos de los alumnos de la carrera de Ingeniera
Biotecnolgica se relaciona con el diseo, construccin, implementacin, operacin y
mantenimiento de biorreactores industriales, en la presente prctica se propone como
objetivo que el alumno identifique y describa los diferentes tipos de biorreactores y sus
partes accesorias, al igual que la forma como se operan, controlan, esterilizan, cargan y
descargan, etctera.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
FORMULACIN DE RESULTADOS
Tipo de biorreactor.
Capacidad.
Mtodos de Cultivo (lote, lote alimentado o cultivo continuo) que se lleva a cabo
en el biorreactor.
Produccin.
BIBLIOGRAFA
Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. (1983), Bioreactors for Submerged Culture,
Adv. Biotech, Process, 1: 1-30.
Charles, M. (1985). Fermentation Scale-Up: Problems and Possibilities, Trends in
Biotech, 3: 80-84.
Schegerl, K. (1982), New Biorreactors for Aerobic Processes, Int. Chem. Eng., 22:
591-610.
Schegerl, K. (1985), Nonmechanical Agitated Biorreactor Systems en Comprehensive
Biotechnology, M. Moo-Young, Pergamon Press, 2: 99-118.
Sitting, W. (1983), Fermentation Reactors, Chem. Tech., 13: 606-613.
Zlokarnik, M. (1985), Tower-Shaped Reactors for Aerobic Biological Waste Water
Treatment, en Biotechnology, Rehm, H. J. y G. Reed, 2: 537-569.
PRCTICA 2
Instrumentacin para el
seguimiento y control
de la biorreaccin
INTRODUCCIN
Los biorreactores estn equipados con distintos instrumentos que se utilizan para
facilitar el registro y anlisis de las variables de operacin y de parmetros especficos
que sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de
operacin de la biorreaccin con el fin de maximizar la productividad y garantizar el
xito de la biorreaccin.
La instrumentacin ha sido definida como una ventana al proceso y su objetivo es
mantener al mnimo la diferencia entre el valor medido y un valor deseado. El control de
un parmetro particular se lleva a cabo a travs de un sistema que consta de un sensor
(o electrodo), un medidor y un controlador:
Sensor: dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir
en otra que facilita su medida.
Del resultado de la comparacin, el controlador toma una decisin enviando una seal
(generalmente elctrica) a algn dispositivo que ajustar el valor medido de la
propiedad hasta el valor predeterminado o de control (set point). La seal usualmente
implica la modificacin del estado de una vlvula, el encendido o apagado de una
bomba dosificadora, la modificacin de la velocidad de giro de un motor de algn
equipo, etctera.
Si, por ejemplo, se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el
estado de una vlvula se requerir de un transductor y de un actuador.
Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo
con la masa lquida o slida de fermentacin), en cuyo caso se dice que estn en
lnea, si no estn conectados directamente al biorreactor, entonces se dice que estn
fuera de lnea.
10
Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos es fcil concluir que los sensores en
lnea son mucho ms adecuados para controlar el valor de una propiedad en una
biorreaccin.
Temperatura.
pH.
Flujo de aire.
11
Presin.
Intensidad de agitacin.
Espuma.
Concentracin celular.
Concentracin de sustrato.
Concentracin de producto.
Medicin y control de pH
El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H+) en una disolucin acuosa
y est definida por la siguiente ecuacin:
pH = - log10 [H+]
(1)
Para la medicin y control del valor del pH se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en
forma asptica, en el biorreactor y que est directamente en contacto con el caldo de
fermentacin. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un
medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set
Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medicin.
12
Dicho electrodo comnmente se construye como una sola unidad con el sensor de
referencia construido en una parte anular del elemento sensor, tal como puede
apreciarse en la Figura 1.
13
Como el valor del pH del caldo de fermentacin puede cambiar despus de ser
esterilizado debido al drstico tratamiento trmico se recomienda recalibrar el electrodo,
para lo que se hace necesario tomar aspticamente una muestra del caldo de
fermentacin y medir su valor de pH con un medidor y un electrodo fuera de lnea. En
caso de que el valor del electrodo en lnea sea distinto del que marca el fuera de
lnea se ajustar el valor de aqul con el equipo de medicin empleado en el
biorreactor.
Una vez realizado todo lo anterior se est en posibilidades de medir y controlar el valor
del pH de una biorreaccin en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al
valor del Set Point, entonces el controlador emitir una seal elctrica con la que se
podr activar alguna bomba para adicionar cido o lcali, dependiendo de la
diferencia entre el valor medido y el Set Point.
14
E = VM -VSP
ACTUADOR
CONTROLADOR
VSP
VM
BIORREACTOR
MEDIDOR
SENSOR
Aunque no existe un consenso para establecer cul de todas las variables de operacin
es la ms importante de mantener y controlar en una biorreaccin, la temperatura se
cuenta entre las ms importantes. El control, la medicin precisa y adecuada de la
temperatura resultan esenciales para la biorreaccin. Un sistema de medicin de la
temperatura debe presentar una precisin menor a los 0.5 C respecto a la temperatura
de medicin y en muchos casos una variacin de 1 a 1.5 C durante la biorreaccin
puede dar lugar a grandes prdidas econmicas en el bioproceso, por lo que se
recomienda que la diferencia entre el valor medido y el de control se encuentre entre
0.5 y 1.5 C.
15
Para sensores RTD la relacin entre la temperatura y la resistencia est descrita por la
siguiente ecuacin:
RT
T
T
1 T
1
R0
1 0 0 1 0 0
(2)
Ecuacin en la que:
RT
R0
resistencia a 0C [=]
temperatura [=] C
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El oxgeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del
caldo de biorreaccin. Una parte del oxgeno contenido en el aire se disuelve en el
caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxgeno disuelto es el que
utilizarn los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformacin de
la materia prima a producto. Por esta razn es importante distinguir entre oxgeno
disuelto y oxgeno en el gas.
La medicin del oxgeno disuelto se realiza de forma amperomtrica, por la reduccin
del oxgeno en la superficie del ctodo y la formacin de cloruro de plata en el nodo.
Una solucin electroltica une al nodo establecindose un voltaje de polarizacin entre
ellos. Cuando un fluido que contiene oxgeno disuelto se pone en contacto con el
electrodo, el oxgeno se difunde a travs de una membrana semipermeable
establecindose la siguiente reaccin:
Ctodo:
O2 + 2H2O + 4e-
4OH-
nodo:
4Ag + 4Cl-
4AgCl + 4e-
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18
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
EQUIPO
19
REACTIVOS
INSTRUMENTOS
Sistema de medicin y control de temperatura.
Sistema de medicin y control de pH.
Sistema de medicin y control de oxgeno disuelto.
Sistema de medicin y control de espuma.
Medidor.
Controlador.
Sensor RTD.
Medidor.
Controlador.
Electrodo polarogrfico.
Medidor.
Controlador.
Electrodo.
Medidor.
Controlador.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ACTIVIDADES PREVIAS
Consultar los manuales de operacin tanto del biorreactor como de los equipos
de medicin y control que se utilizarn.
21
22
A travs de la chaqueta verifique que las vlvulas del circuito de circulacin del
agua de enfriamiento estn abiertas y encienda el equipo de medicin y control
de la temperatura, que consta de los elementos ya descritos.
23
Estando a 400 rpm incremente el flujo de aire hasta un valor de 0.75 vvm,
observe y anote lo que pasa con la formacin de espuma.
FORMULACIN DE RESULTADOS
Elabore un reporte por equipo en los que establezca sus conclusiones respecto a
las necesidades de instrumentacin y control en las biorreacciones.
24
BIBLIOGRAFA
Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
(1978), Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley and Sons.
25
PRCTICA 3
Servicios Auxiliares
INTRODUCCIN
AIRE
La eleccin del tipo de aire a utilizar depender del uso que se haga de l. El aire debe
ser seco y libre de aceite. Adems cuando se requiera que el proceso o producto no se
26
Los filtros constan de dos elementos principales: el cartucho que contiene el elemento
filtrante y la camisa en la que se coloca el cartucho. En el comercio especializado se
encuentran varios tipos de filtros absolutos. Algunos de los materiales utilizados para
los cartuchos son: steres de celulosa, polisulfonas, fluoruro de polivinilo y
politetrafluoroetileno, mientras que el material ms utilizado para la camisa es el acero
inoxidable (304, 316 o 316L) con mecanismos de sellado rpido y hermtico. El
dimetro de los cartuchos es de 2 a 2, con longitudes variables que van desde 10
(0.25 m) hasta 40 (1m).
Se recomienda que los filtros a emplear en los biorreactores sean del tipo de membrana
hidrofbica (que repele el agua). La naturaleza hidrofbica de estas membranas pueden
alcanzar 100% de remocin de bacterias y bacterifagos en condiciones de operacin
hmedas o secas. La esterilizacin de los filtros se realiza con vapor saturado que
circula en el sentido de la introduccin del aire al biorreactor.
27
Los compresores de aire para plantas biotecnolgicas son generalmente de dos tipos:
rotatorios y reciprocantes de accionamiento positivo, aunque tambin existen los
compresores de tipo centrfugo para grandes volmenes de aire a bajas presiones. El
aire es tomado directamente de la atmsfera. Independientemente del tipo de
preferencia debern ser especificados como libres de aceite.
Adems del aire comprimido algunos gases comprimidos tambin tienen aplicaciones
en biorreactores, los ms comunes son nitrgeno y oxgeno puros: el nitrgeno es til
para la formacin de atmsferas inertes y el oxgeno se usa para enriquecer el aire y
alcanzar una mayor velocidad de transferencia de oxgeno en el biorreactor. Estos
gases generalmente son suministrados en cilindros a una mayor presin que la
atmosfrica, de tal manera que se pueden transportar al lugar de uso. La tubera de
distribucin y suministro debe cumplir con las mismas caractersticas que la del aire.
VAPOR
28
El vapor es fcil de producir ya que se obtiene del agua, la cual puede ser
reutilizable.
29
Bomba de agua, que enva el agua a presin hacia el serpentn del generador.
Separador
de
vapor,
donde
por
medios
mecnicos
se
provoca
el
Trampa de vapor que desaloja los condensados removidos del vapor y los enva
de regreso al tanque de condensados para repetir nuevamente el ciclo.
Sistema de control y de seguridad, entre los que destacan: las vlvulas de alivio
y de seguridad, los manmetros, el control principal de temperatura con
termopar, los interruptores del termostato, el interruptor de presin de vapor y el
interruptor del nivel de aceite.
30
El agua que entra a una caldera requiere de un acondicionamiento previo para proteger
los equipos contra la incrustacin, la corrosin y otras complicaciones (ver Cuadro 1).
Por eso es necesario acoplar a sta un sistema de acondicionamiento previo del agua,
que generalmente incluye un suavizador y un tanque de salmuera.
El suavizador consiste en una columna empacada con una resina catinica depositada
sobre un lecho de grava que le sirve de soporte y a la vez de filtro. En la resina se lleva
a cabo el intercambio de los iones calcio y magnesio que son los responsables de la
dureza del agua por iones sodio que contiene la resina. El tanque de salmuera tiene
como funcin regenerar la resina a fin de que recupere su capacidad de intercambio
inico.
cero
cero
Sulfitos:
50 100 ppm
pH:
10.5 a 11.5
Slidos en suspensin:
cero
Slidos disueltos:
31
AGUA DE ENFRIAMIENTO
El agua como servicio auxiliar se utiliza como fluido de enfriamiento para el control de la
temperatura del caldo de fermentacin en los biorreactores. Esta agua, a diferencia del
agua de proceso, nunca entra en contacto con las materias primas o productos de la
biorreaccin, ni con las superficies en contacto con stos, circula a travs de las
chaquetas o serpentines segn el diseo del biorreactor.
32
Este tipo de agua se utiliza para las operaciones de lavado y limpieza del biorreactor y
del rea de proceso. Esta agua puede ser potable, debe estar libre de sedimentos, pero
no requiere ningn tratamiento adicional.
ENERGA ELCTRICA
33
Voltajes de distribucin
Corriente: la cual puede ser de dos tipos: la corriente alterna (AC), que es peridica con
pequeas oscilaciones, desde un valor mximo en un sentido hasta el mismo valor pero
en sentido contrario, de tal manera que su intensidad media es nula; y la corriente
continua o directa (DC o CC), que proporciona un valor constante todo el tiempo, como
la producida por dnamos, pilas y acumuladores.
Dispositivos de proteccin
Los circuitos y equipos deben ser protegidos por dispositivos que abran los circuitos
para que la corriente no fluya en condiciones de sobrecarga o falla, lo cual se hace a
travs de interruptores. Mediante los transformadores se obtienen voltajes reducidos
34
que alimentan los diferentes circuitos, cada uno de los cuales debe tener su interruptor
de desconexin.
Conductores
Los cables son canalizados en las instalaciones dentro de tuberas metlicas o canales
para protegerlos de agentes externos como la humedad, la corrosin los golpes,
etctera, que se sujetan al techo o paredes por medio de soportes. En algunos lugares
35
se entierran dichas tuberas bajo el piso, aunque esto lo hace de difcil acceso y
mantenimiento.
OBJETIVO
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno buscar, en todas las fuentes
posibles, informacin sobre los tipos de sistemas de compresin de aire, generacin de
vapor y agua de enfriamiento que se emplean en la industria biotecnolgica. Tambin
investigar los elementos bsicos de una instalacin elctrica industrial.
Se expondrn a los alumnos los diversos compresores con que cuenta la planta
piloto y los laboratorios, se les pedir que identifiquen y describan sus
componentes y los clasifiquen de acuerdo con los tipos encontrados en la
literatura.
36
FORMULACIN DE RESULTADOS
El alumno realizar un informe de las actividades desarrolladas que deber contener los
siguientes puntos:
Introduccin.
Objetivo.
37
BIBLIOGRAFA
38
PRCTICA 4
Prctica 4. Tiempo de mezclado en biorreactores
Tiempo de mezclado en
biorreactores
INTRODUCCIN
TANQUE AGITADO
En los biorreactores de tanque agitado, la agitacin del caldo de cultivo se lleva a cabo
mediante dos formas:
39
COLUMNA
40
El elemento estructural a travs del cual tiene lugar la dispersin del gas se llama
dispositivo de dispersin primaria. El gas dispersado inicialmente puede ser
redispersado. Esto se lleva a cabo por dispositivos de dispersin secundaria. En las
columnas de burbujas de una etapa y en las columnas de burbujas multietapa el aire se
introduce a travs de dispositivo de dispersin primaria, tal como un tubo perforado, un
plato perforado o un plato sinterizado, donde es dispersado finamente. Tambin las
burbujas de aire que aumentan de tamao debido a la coalescencia pueden ser
redispersadas al pasar a travs de dispositivos de dispersin secundaria, como mallas o
bandejas perforadas colocados a lo largo de la columna. En los biorreactores de
columna
de
burbujas
multietapa
la
dispersin
de
aire
se
lleva
cabo
AIRLIFT
Los biorreactores airlift tienen forma de columna o torre, en su interior tienen al menos
dos zonas, una de flujo ascendente y otra de flujo descendente. El movimiento del
lquido se debe a que en dichas zonas la densidad de la dispersin gas-lquido es
diferente porque hay mayor cantidad de aire en la zona de flujo ascendente que en la
de flujo descendente. La diferencia de las fracciones de gas retenido es una medida de
la diferencia de densidades entre las dispersiones gas-lquido en dichas zonas, la cual
es la fuerza motriz para la circulacin del lquido en el biorreactor.
Debido al movimiento del lquido, las burbujas de gas en la zona de flujo ascendente
subirn ms rpido, disminuyendo la fraccin de gas retenido y la diferencia de presin
hidrosttica. En contraste con las condiciones de una columna de burbujas, los
biorreactores airlift se caracterizan por tener fracciones de gas retenido menores y por
una distribucin ms uniforme de la fase gaseosa a travs de la seccin transversal de
la zona de flujo ascendente, con un mximo de la fraccin de gas retenido local cerca
de la pared de la zona de flujo ascendente. Tambin, en contraste con las columnas de
burbujas, los airlift muestran velocidades de lquido mucho ms altas. La velocidad del
lquido afecta decisivamente todos los parmetros que caracterizan el desempeo del
41
OBJETIVOS
TANQUE AGITADO
COLUMNA Y AIRLIFT
42
MATERIALES Y MTODOS
BIORREACTORES
Biorreactor airlift.
INSTRUMENTOS
1. Cronmetros.
2. Rotmetros.
3. Manmetros.
4. Termmetros.
REACTIVOS
43
El mtodo que se utilizar es del de adicin de trazadores tales como cidos y bases.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
ACTIVIDADES PREVIAS
CONDICIONES DE OPERACIN
El profesor puede seguir o cambiar las siguientes condiciones de operacin,
dependiendo del tipo y tamao del biorreactor a utilizar.
Tanque agitado
Columna y Airlift
44
FORMULACIN DE RESULTADOS
TANQUE AGITADO
45
DISCUSIN Y CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
TANQUE AGITADO
Aiba, S., Humphrey A. E., Millis, N.F. (1973), Biochemical Engineering, 2a edicin,
Edition Academic.
Hicks, R. W., Gates, L. E. (1976), How to Select Turbine Agitators for Dispersing Gas
Into Liquids en Chem. Eng., July 19: 141-148.
Moser, A. (1988), Bioprocess technology en Kinetics and reactors, Springer - Verlag.
46
Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D.
(1978), Fermentation and enzyme technology, John Wiley and Sons.
COLUMNA
Miyahara, T., Matsuba, Y., Takahashi, T. (1983), The Size of Bubbles Generated From
Perforated Plates en Int. Chem. Engng. 23. 3: 517-523.
Schegerl, K. (1982), New Bioreactors for Aerobic Processes en Int. Chem. Engng.,
22, 4: 591-610.
Schegerl, K., Lucke, J., Oels, U. (1980), Bubble Column Bioreactors, Adv. In
Biochem. Engng., 45. 7: 1-84.
AIRLIFT
Blenke, H. (1985), Biochemical Loop Reactors en Biotechnology 2, Rehm, H. J. y G.
Reed.
Joep, J. M. (1988), Gas Hold up Measurements in Bioreactors en Trends in
Biotechnology, 6: 19-22.
Weiland, P., Onken, V. (1981), Differences in the Behaviour of Bubble Columns and
Airlift Loop Reactors en Ger. Chem. Eng., 4: 174-181.
47
PRCTICA 5
Prctica 5. Determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno
Determinacin de la
Velocidad de Transferencia de Oxgeno
INTRODUCCIN
Las conversiones microbianas aerbicas son reacciones de oxidacin que requieren oxgeno
molecular disuelto. Una gran diferencia del oxgeno con respecto a otros nutrientes, es su
extremadamente baja solubilidad en agua. Consecuentemente, la transferencia de oxgeno puede
llegar a ser uno de los principales factores limitantes de la productividad celular y/o de
metabolitos, debido a la influencia de la concentracin del oxgeno disuelto sobre las actividades
metablicas de las clulas. La velocidad de transferencia de oxgeno de un biorreactor depende de
las condiciones de operacin (aireacin y/o agitacin) y de las propiedades fsicas del lquido. La
ecuacin que describe la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO) es:
VTO = kLa (C* - C)
(1)
donde:
kLa : coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno (h-1).
C*: concentracin de oxgeno disuelto en equilibrio con la fase gaseosa (g/L).
C: concentracin de oxgeno disuelto (g/L).
48
El kLa es un parmetro que sirve para tener una idea de la rapidez con la que se transfiere oxgeno
del aire al lquido contenido en un biorreactor. Existen diferentes mtodos para determinar la
velocidad de transferencia de oxgeno. Dos de ellos son el mtodo del sulfito y el mtodo
dinmico.
Otro parmetro importante que determina la velocidad de transferencia de oxgeno de un
biorreactor es la fraccin de gas retenido () o "gas holdup", definido como la fraccin de
volumen de la dispersin gas-lquido que es ocupada por la fase gaseosa. Cuando el tamao
promedio de las burbujas es constante, una mayor fraccin de gas retenido, implica una mayor
rea interfacial gas-lquido y en consecuencia una mayor transferencia de oxgeno.
suministro del oxgeno es por lo tanto un aspecto muy importante en el diseo de biorreactores
para procesos aerbicos.
El kLa es un parmetro que depende del grado de coalescencia del lquido. Por ejemplo, el kLa
empleando una solucin acuosa con una fuerza inica de I=0.4, es ms grande, por un factor de
seis, que el obtenido con agua. Esto es debido a un aumento del rea interfacial.
50
OBJETIVO
Determinar la velocidad de transferencia de oxgeno (VTO), el coeficiente volumtrico de
transferencia de oxgeno (kLa) y la fraccin de gas retenido global () en diferentes tipos de
biorreactores.
Reactivos
Sulfito de sodio
Sulfato de cobre pentahidratado
Solucin de Yodo 0.1 N.
Solucin de Tiosulfato de sodio 0.1 N.
51
2 Na2SO4
2 Na2SO3 + 2 I2 + 2 H2O
2 Na2SO4 + 4 HI
2 I2 + 4 Na2S2O3
4 NaI + 4 Na2S4O6
Preparacin de soluciones
Solucin de Sulfito de sodio 0.4 M.
Esta solucin se prepara justo antes de ser empleada. El volumen a preparar depende del volumen
de operacin del biorreactor que empleen.
52
(2)
En este mtodo el suministro de aire se reemplaza por un suministro de nitrgeno, que desplaza al
oxgeno presente en el seno del lquido, disminuyendo C. Despus se inicia la aireacin a una
velocidad constante y se mide el aumento de C. En esta etapa, el balance de oxgeno se describe
por la ecuacin (2), que al integrarla entre los lmites C1 y C2 obtenemos la ecuacin (3). Una
grafica de ln[(C*- C2)/(C* - C1)] vs tiempo produce una lnea recta con una pendiente que es
igual a kLa. La figura (1a) muestra el cambio de C y la figura (1b) muestra la lnea obtenida con
la ecuacin (3).
C * C2
ln
C * C1
Eliminacin
de oxgeno
C
k L a t 2 t1
(3)
C * C2
ln
C * C1
Inicio de
aireacin
kL a
Tiempo
Tiempo
(a)
(b)
53
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Determinacin del kLa por el mtodo del sulfito
1. Agregar al biorreactor la solucin de Sulfito de sodio 0.4 M.
2. Adicionar la solucin de Sulfato de cobre al biorreactor.
3. Ajustar el pH a un valor de 7.2 con HCl concentrado.
4. Poner a funcionar el biorreactor de acuerdo a las condiciones de operacin.
5. Tomar una muestra de 3 mL y verter inmediatamente 1 mL a cada uno de dos matraces
erlenmeyer de 250 mL, que contienen 10 mL de solucin de Yodo 0.1N.
6. Titular el exceso de Yodo con solucin de Tiosulfato de sodio 0.1N. Registrar el volumen
gastado de Tiosulfato de sodio.
7. Tomar otra muestra despus de 5 minutos de haber tomado la primera y repetir los pasos
5 y 6. Si el volumen gastado de Tiosulfato de sodio aumenta significativamente, mantener
5 minutos entre la toma de cada muestra, sino es as, modificar ese tiempo de acuerdo a la
capacidad de transferencia de oxgeno del biorreactor.
8. Hacer una grfica del volumen gastado de Tiosulfato de sodio en funcin del tiempo. Si al
graficar 3 puntos se obtiene una lnea recta con un coeficiente de correlacin mayor a 0.95
ya podr determinar la velocidad de transferencia de oxgeno. Si no es as, contine
tomando muestras hasta que obtenga una lnea recta.
9. Una vez que determine la velocidad de transferencia de oxgeno, cambie las condiciones
de operacin y repita este procedimiento.
54
o Despus de que el biorreactor alcance una operacin estable, suministrar nitrgeno para
que la C disminuya.
o Cuando la C sea baja, del orden de 0% a 10% de saturacin, suspender el suministro de
nitrgeno e iniciar el suministro de oxgeno a un flujo correspondiente a una condicin de
operacin, registrando el % de saturacin de oxgeno disuelto cada 15 s. Este tiempo
puede ser diferente de acuerdo a la capacidad de transferencia de oxgeno del biorreactor.
Despus del primer experimento usted establecer cada cuanto tiempo debe registrar % de
saturacin de oxgeno disuelto.
o Cuando el % de saturacin de oxgeno disuelto sea alto, del orden de 90% a 100% puede
terminar el experimento.
Condiciones de operacin
Las siguientes condiciones de operacin se sugieren, queda en el profesor seguirlas o cambiarlas
por otras, de acuerdo al tipo y tamao de biorreactor que se utilice.
55
RESULTADOS
Para el mtodo del sulfito
1. Elabore graficas del volumen de Tiosulfato de sodio (mL) gastado en las titulaciones vs el
tiempo (h).
VTO
V2 V1 N A
t 2 t1 V
(4)
Donde:
V1 y V2: volmenes de la solucin de Tiosulfato de sodio
5. Elabore una grafica de kLa en funcin de fraccin de gas retenido, velocidad de agitacin,
velocidad de aireacin, potencia de agitacin con aireacin y potencia de aireacin.
56
6. Obtenga la correlacin del kLa en funcin de cada una de las variables mencionadas en el
prrafo anterior.
2. Tabule los valores necesarios para que elabore una grafica que le permita obtener el kLa
(h-1)
3. Calcule la VTO, el kLa y la fraccin de gas retenido global para cada condicin de
operacin.
DISCUSIN
La discusin deber contener al menos la siguiente informacin:
57
4. Explicacin de los valores de kLa de los lquidos que promueven la coalescencia y de los
lquidos que la evitan.
BIBLIOGRAFA
TANQUE AGITADO Y COLUMNA
1. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
2. Wang, D .I .C ., Cooney, C. L, Demain, A. D., Dunill, P., Humphrey, A. E., Lilly, M. D. 1978.
Fermentation and enzyme technology. John Wiley and Sons.
3. Aiba, S., Humphrey, A. E., Millis, N. F. 1973. Biochemical engineering. Academic Press.
AIRLIFT
1. Chisti, M. Y. 1989. Airlift bioreactors. Elsevier Applied Science. England.
2. Vant Riet, K. 1991. Basic bioreactor design. Mercel Dekker, Inc. USA.
3. Weiland, P., Onken, U. 1981.Differences in the behaviour of bubble columns and airlift loop
reactors. Ger. Chem. Eng. 4: 174-181.
4. Merchuk, J. C. 1990. Why use airlift reactors. TiBTech. 8. 66-71.
58
PRCTICA 6
Prctica 6. Mantenimiento de asepsia en biorreactores
Mantenimiento de asepsia en
biorreactores
INTRODUCCIN
59
Una vez lavado el biorreactor y las tuberas, el biorreactor se llena con medio de cultivo
para proceder a la esterilizacin. Despus de la esterilizacin el biorreactor debe operar
aspticamente. Para lograrlo es necesario el buen funcionamiento del sello mecnico
para mantener una presin positiva que evite la entrada de microorganismos. Tambin
se requiere el ms alto aseguramiento posible de la integridad y eficiencia de remocin
del filtro para la esterilizacin del aire.
Existen diferentes mtodos para probar la integridad de filtros, uno de ellos es la prueba
de la intrusin del agua. Es una prueba prctica y validada que se puede considerar
para probar la integridad in situ de los filtros hidrofbicos para la esterilizacin del aire.
Otra prueba es la de mantenimiento de la presin.
OBJETIVO
60
El principio de esta prueba es que si el lado corriente arriba de un filtro hidrofbico seco
se llena de agua y se presuriza, la naturaleza hidrofbica de la membrana porosa
prevendr el flujo del lquido a travs del filtro hasta que se alcanza la presin de la
intrusin. A presiones por debajo de la presin de intrusin ocurre un flujo pequeo,
pero medible del agua a travs de la membrana. La presencia de poros ms grandes en
el filtro ser detectada por un flujo creciente debido al agua que atraviesa estos poros.
La Figura 3 muestra el principio de esta prueba.
Presin
Membrana
hidrofbica
Aire
Aire
Agua
Agua
Filtro:
Membrana
hidrofbica
Poro B
Poro A
Carcasa
Unidad de filtracin
61
AB1PFR7PVH4
Presin de prueba:
2500 mbar
0.33 mL/min
BIBLIOGRAFA
62
PRCTICA 7
Prctica 7. Esterilizacin del sistema de biorreaccin
INTRODUCCIN
Una esterilizacin adecuada del medio de cultivo es importante para garantizar el xito
de muchas fermentaciones industriales. Para lograr este propsito se emplea cualquier
mtodo capaz de destruir o separar a los microorganismos contaminantes indeseables.
La tcnica ms comn es la destruccin de los microorganismos contaminantes. El
trmino destruccin, en este caso, significa la prdida de viabilidad del microorganismo.
Agentes qumicos.
Radiaciones.
Vibraciones snicas.
El mtodo que se utiliza con mayor frecuencia para medios lquidos es el de calor
hmedo, ya que es simple, confiable y econmico.
63
dN
kN
dt
(1)
N
kt
No
(2)
N
exp(kt )
No
(3)
ln
64
NS
ND
(4)
Se propone que una espora resistente NR sufre inactivacin o muerte a un estado final
ND a travs de un intermediario sensible NS.
Se establecen las ecuaciones diferenciales:
dN R
kR N R
dt
(5)
dNS
kR NR kS NS
dt
(6)
N kR
exp k S t S exp k R t
N0 kR kS
kR
(7)
65
RT
(8)
No
E
ln
A exp dt
RT
N
0
t
TOTAL
(9)
Mantenimiento de temperatura
66
TIPO DE
RELACIN
TRANSFERENCIA DE
TEMPERATURA
CALOR
TIEMPO
Adicin de vapor al
at
T To1
1 bt
medio
ayb
hs
MToC
(Hiperblica )
Calentamiento con
T To1at
dispositivo elctrico
(lineal)
T TH 1 be at
(exponencial)
b
Enfriamiento
T T 1 be at
(Intercambiador de calor)
Ua
MC
To TH
TH
Ua
WC
1 e WC
MC
67
q
MToC
(intercambiador de calor)
s
M
To T
T
OBJETIVO
MATERIAL
Biorreactor de 12 litros.
Cronmetro.
Pipetas estriles.
Agar nutritivo.
Mechero.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Una vez montado el vaso conteniendo 12 litros de agua inocular con esporas de
Bacillus stearothermophilus.
Obtener el flujo del agua de enfriamiento para calcular el gasto masa (W).
68
Cuadro 4. Diluciones sugeridas a realizar para cada una de las muestras tomadas
durante el ciclo de esterilizacin.
MUESTRA
DILUCIONES
NO
10-1
10-8
N1
10-1
10-7
N2
10-1
10-6
N3
10-1
10-5
FORMULACIN DE RESULTADOS
69
Obtener
el
grado
de
destruccin
para
calentamiento,
BIBLIOGRAFA
Wang, I. C. D., y col. (1979), Fermentation and Enzyme Technology, John Wiley, N. Y.
70
ANEXO 1
NOMENCLATURA
a
rea de transferencia de calor: calcularla experimentalmente
A
Constante de Arrhenius, min-1.
C
Calor especfico del medio de cultivo, kcal/ kg C.
C
Calor especfico del elemento enfriador, kcal / kg C.
E
Energa de activacin, cal / g mol, kcal / kg mol.
h
Entalpa relativa al medio, kcal / kg (entalpa del vapor a la temperatura del
medio de cultivo).
k
Constante especfica de velocidad de muerte, min. -1.
kR
Constante especfica de inactivacin de esporas resistentes.
ks
Constante especfica de intermediarios sensibles.
M
Masa inicial del medio, kg.
N
Concentracin de microorganismos en el tiempo t.
No
Concentracin de microorganismos to.
N1
Concentracin de microorganismos t1.
N2
Concentracin de microorganismos t2.
N3
Concentracin de microorganismos t3.
ND
Concentracin de esporas inactivas.
NR
Concentracin de esporas resistentes.
NS
Concentracin de esporas sensibles.
q
Velocidad de transferencia de calor, kcal / s.
R
Constante universal de los gases, 1.98 cal / g Mol K.
s
Gasto masa de vapor, kg / s, kg / h, kg / min.
t
Tiempo, min, h.
T
Temperatura absoluta K.
T0
Temperatura inicial del medio K.
TH
Temperatura de la fuente de calentamiento K.
T
U
W
71
PRCTICA 8
Prctica 8. Produccin de biomasa en cultivo por lote
Produccin de biomasa en
Cultivo por lote
INTRODUCCIN
Hasta la fecha la gran mayora de las fermentaciones a nivel industrial se llevan a cabo
en cultivo por lote. ste consiste en agregar al biorreactor un medio de cultivo que
contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo y/o para la
produccin de un metabolito. El medio despus de ser esterilizado y enfriado a la
temperatura de fermentacin se inocular con el microorganismo para permitir su
desarrollo y produccin del metabolito, hasta un tiempo en el cual ocurre el agotamiento
de uno o ms nutrientes del medio de cultivo. Terminada la fermentacin se cosecha la
totalidad del volumen de mosto o medio agotado para recuperar el producto.
72
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
EQUIPO
Electrodo de pH esterilizable.
Estufa.
73
La cepa empleada se conserva en tubos con medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.
MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO PARA EL
MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
(g/L)
Glucosa
15.0
15.0
(NH4)2SO4
2.73
1.365
NaH2PO4
1.2637
1.2637
Extracto de levadura
0.990
0.990
FeSO4 7H2O
CuSO4 5H2O
ZnSO4 H2O
Na2MoO4 2H2O
MnSO4 H2O
*NOTA.- Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen
(en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
Vsales (mL) = 0.05 x conc. de glucosa (g/L) x volumen medio (L)
Todos los medios se ajustan a un pH=4.0 (excepto el medio para el inoculo).
74
MTODOS ANALTICOS
75
Curva tipo de glucosa: Elaborar una curva tipo de glucosa con volmenes de 0.1 a 1 mL
de solucin patrn de 1.0 g/L de glucosa.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
(Considerando un volumen de operacin de 2 L)
Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5 mL del mismo medio sobre la
cepa en tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora
(150 rpm) a una temperatura de 35C durante 18 horas.
76
Velocidad de agitacin
500 rpm
Aireacin
1 vvm
Temperatura
35 C
3.8
Antiespumante (PPG-10%)
se
harn
por
duplicado.
El
cultivo
por
lote
aproximadamente 10 horas.
Procesamiento de muestras.
(10mL)
Medir absorbancia
Determinacin de
concentracin celular
usando la curva tipo
correspondiente
MUESTRA
(3 mL)
(5 mL)
Centrifugacin
Filtrado
Determinacin de
glucosa residual
77
Paquete celular
durar
FORMULACIN DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFA
Dunn, I. J., Mor, J. R. (1975), Variable-volumen continuous cultivation en Biotechnol.
Bioeng.,17: 1805-1822.
78
Pirt, S. J. (1975), Principles of microbial and cell cultivation en Black Well Scientific
Publications, London.
Whitaker, A. (1980), Fed-batch culture en Process Biochem., 15:10-15.
Yaman, T., Hirano, S. (1977), Semibatch culture of microorganism with constant feed
of substrate: A mathematical simulation, J. Ferment Technol., 55:156-165.
ANEXO 2
Cuadro 6. Resultados del cultivo por lote
Da
Hora
Tiempo de
Concentracin celular
reaccin
(por absorbancia)
(h)
No. de tubo
As
Dilucin
Glucosa residual
g/L
Tubo
Lectura
Dilucin
g/L
pendiente (m) =
ordenada (b) =
79
ANEXO 3
CULTIVO POR LOTE
ACTIVIDADES
Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
biorreactor / esterilizacin del biorreactor con medio de cultivo y esterilizacin del
lcali y el antiespumante / enfriamiento / inoculacin con los matraces al
biorreactor / arranque de la fermentacin.
Toma de muestra cada hora del cultivo por lote / procesamiento de las muestras.
80
PRCTICA 9
Prctica 9. Produccin de biomasa en cultivo por lote alimentado
Produccin de biomasa en
Cultivo por lote alimentado
INTRODUCCIN
XIX,
Los cultivos continuos (principalmente simple etapa, con recirculacin y mltiple etapa)
pertenecen al segundo grupo, donde existe entrada (nutrientes) y salida de materiales
(nutrientes no consumidos, biomasa y metabolitos).
su vez, por la forma de suministro de los nutrientes pueden clasificarse en cultivos con
alimentacin a flujo variable o flujo constante. A este ltimo pertenece el cultivo objeto
de esta prctica: cultivo por lote alimentado a flujo cte. (o Feed batch Lineal).
Hasta antes de la dcada de los setentas, el cultivo Feed batch Lineal vena
emplendose empricamente, pero diseado, en principio, para ser ms productivo que
el cultivo por lote. Fue en 1975 cuando Pirt(2) report un tratamiento matemtico de este
sistema, el cual consiste en el conjunto de ecuaciones diferenciales del sistema que
describen a las velocidades volumtricas de acumulacin de materiales en el
biorreactor, es decir, la aplicacin de la ecuacin general de balance para biomasa,
sustrato y producto (Acumulacin = Entrada - Salida + Generacin).
Sin embargo, pueden encontrarse dos soluciones particulares a este sistema bajo las
siguientes condiciones:
Para el segundo caso, como la demanda es mayor que el suministro, todo (o casi todo)
el sustrato limitante suministrado es completamente consumido por el microorganismo,
por lo que la concentracin del sustrato residual durante el cultivo es muy baja. Bajo
esta condicin el microorganismo ajusta su maquinaria metablica al bajo suministro del
sustrato, ocasionando limitacin en su crecimiento que se ve reflejado en una baja
velocidad de crecimiento.
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
EQUIPO
Electrodo de pH esterilizable.
MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO PARA EL
INOCULO
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO POR LOTE
(g/L)
MEDIO PARA LA
ALIMENTACIN
(g/L)
Glucosa
15.0
15.0
40.0
(NH4)2SO4
2.73
1.365
3.64
NaH2PO4
1.2637
1.2637
3.37
Extracto de levadura
0.990
0.990
2.64
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua destilada
84
*NOTA.- Todas las sales ya estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen
(en mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
MTODOS ANALTICOS
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Se preparan 180 mL de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 mL) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 minutos. Se enfra. Se inoculan con 5 mL del mismo medio sobre la
cepa en tubo inclinado, en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una agitadora
(150 rpm) a una temperatura de 350C durante 18 horas.
Velocidad de agitacin
500 rpm
Aireacin
1 vvm
Temperatura
35 C
3.8
Antiespumante (PPG-10%)
Se tomarn muestras slo al inicio y al final del cultivo por lote, el cual durar 12
horas. A las muestras se les determinar concentracin celular y glucosa residual
por el mtodo del DNS.
Se preparan 900 mL de medio de cultivo para el cultivo Feed Batch Lineal y se ajusta el
pH a 4.0. El medio se prepara en un matraz de dos litros, y se esteriliza junto con la
manguera de adicin y el "medidor" de flujo (pipeta), a 15 lb/in 2 durante 15 min.
C) Una hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del matraz que
contiene el medio estril a la bomba peristltica y a la entrada del biorreactor en
condiciones aspticas. Al finalizar el cultivo por lote se inicia la alimentacin del medio
de cultivo. Esta adicin terminar cuando se agoten los 900 mL de medio de cultivo.
86
Este cultivo operar bajos las mismas condiciones de operacin del cultivo por lote:
velocidad de agitacin, aireacin, T, pH, etctera.
Se tomarn muestras cada hora, las cuales sern procesadas de acuerdo a la siguiente
figura.
(10mL)
Medir absorbancia
Determinacin de
concentracin celular
usando la curva tipo
correspondiente
MUESTRA
(3 mL)
(5 mL)
Centrifugacin
Filtrado
Determinacin de
glucosa residual
87
Paquete celular
FORMULACIN DE RESULTADOS
global)
global)
y el rendimiento
alimentado constantemente.
88
BIBLIOGRAFA
Dunn, I. J., Mor, J. R. (1975), Variable-volumen continuous cultivation en Biotechnol.
Bioeng., 17: 1805-1822.
Pirt, S. J. (1975), Principles of microbial and cell cultivation en Black Well Scientific
Publications, London.
Whitaker, A. (1980), Fed-batch culture en Process Biochem., 15:10-15.
Yaman, T., Hirano, S. (1977), Semibatch culture of microorganism with constant feed
ofsubstrate: A mathematical simulation, J. Ferment Technol. 55:156-165.
89
ANEXO 4
Tiempo
Volumen
Concentracin celular
(h)
Lquido
(por absorbancia)
(L)
No. de tubo
As
Dilucin
Glucosa residual
g/L
Tubo
Lectura
Dilucin
g/L
pendiente (m) =
ordenada (b) =
90
ANEXO 5
FEEDBATCH LINEAL
ACTIVIDADES
91
PRCTICA 10
Produccin de biomasa en
Cultivo continuo
INTRODUCCIN
93
OBJETIVO
MATERIALES Y MTODOS
EQUIPO
Electrodo de pH esterilizable.
La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 40C.
94
(g/L)
MEDIO PARA
EL CULTIVO
POR LOTE
(g/L)
MEDIO PARA EL
CULTIVO
CONTINUO
(g/L)
Glucosa
15.0
15.0
20.0
(NH4)2SO4
2.73
2.73
1.82
NaH2PO4
1.2637
1.2637
1.685
Extracto de levadura
0.990
0.990
1.32
COMPONENTE
MEDIO PARA
EL INOCULO
* FeSO4 7H2O
* CuSO4 5H2O
* ZnSO4 H2O
* Na2MoO4 2H2O
* MnSO4 H2O
Emplear agua destilada
*NOTA.- Todas las sales estn disueltas en una solucin concentrada, el volumen (en
mL) a emplear se calcula mediante la siguiente relacin:
MTODOS ANALTICOS
95
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Se preparan 200 mL de medio de cultivo para desarrollo del inoculo, los cuales se
reparten en dos matraces (de 500 mL) con 100 mL de medio cada uno. Se esterilizan a
15 lb/in2 durante 15 min. Se enfra. Se inoculan con 5 mL del mismo medio sobre la
cepa en tubo de medio inclinado en condiciones aspticas. Se dejan incubando en una
agitadora (110 golpes/minuto) a 350C durante 18 horas.
96
CONDICIONES
Velocidad de agitacin
500 rpm
Aireacin
1 vvm
Temperatura
35 C
3.8
Antiespumante
Polipropilenglicol al 10%
Se tomarn muestras al inicio y al final del cultivo por lote y ste durar 12 horas. A las
muestras se les debe determinar concentracin celular por peso seco (por filtracin) y
sustrato residual por el mtodo del DNS.
CULTIVO CONTINUO
97
Media hora antes de finalizar el cultivo por lote se conecta la manguera del
recipiente que contiene el medio estril a la bomba, y al puerto de suministro del
biorreactor en condiciones aspticas.
Al terminar el cultivo por lote se inicia el suministro continuo del medio de cultivo
al biorreactor. El fluido de salida se recibe en otro recipiente, el cual es marcado
con la hora a la cual se inici el suministro de medio (el fluido de salida sale a
travs del tubo capilar colocado previamente en el biorreactor).
El cultivo continuo operar en todas las velocidades de dilucin bajo las mismas
condiciones de agitacin (500 rpm), aireacin (1 vvm), temperatura (35 C), pH
(3.8) y control de la espuma.
Esto mismo se repite para cada una de las velocidades de dilucin restantes.
Tambin se deben tomar 2 mL del medio alimentado para determinar la
concentracin de glucosa.
FORMULACIN DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFA
1. Wang, D. I. C., Cooney, C. L., Demain, A. L., et al. (1978), Fermentation and enzyme
technology, John Wiley and Sons.
99
ANEXO 7
CULTIVO CONTINUO
ACTIVIDADES
Preparacin del medio de cultivo para el cultivo por lote / preparacin del
biorreactor / esterilizacin del biorreactor con medio de cultivo / enfriamiento /
inoculacin con los matraces a el biorreactor / desarrollo del cultivo por lote /
muestreo: inicio y al final.
100