INMUNODIAGNOSTICO

APLICACIONES.

EN

VETERINARIA.

PRINCIPIOS

Autores: Lic. Sandra Cuello Portal, MSc.* y Lic. Ileana Rosado Ruiz-Apodaca, DrC.**
* Grupo Virologa, ** Grupo Biologa Molecular-Bacteriologa, CENSA.
Prlogo.
Las enfermedades infecciosas de los animales continan siendo la principal amenaza a
las especies productoras de alimentos en nuestro pas y regin. La rapidez y calidad del
diagnstico de laboratorio condiciona el xito en la prevencin y control de las mismas.
Este documento rene las tcnicas serolgicas ms usadas en el diagnstico veterinario
compilando buena parte de la experiencia prctica disponible en la literatura cientfica
universal y las experiencias personales de los cientficos de nuestro centro que se
desarrollan en la actividad. Est dirigido a profesionales, tcnicos y estudiantes que se
inician en el diagnstico de laboratorio e investigacin en el rea veterinaria. Contiene
aspectos generales sobre inmunologa que permiten comprender el principio de las
tcnicas de diagnstico inmunolgico y la interpretacin de sus resultados, as como
elementos prcticos importantes a tener en cuenta en el uso de animales de laboratorio
para obtener de forma satisfactoria los inmunosueros.
En la ltima parte se hace referencia a tcnicas moleculares que a pesar de los
requerimientos tcnicos (equipos y reactivos) que limitan su uso de forma extensiva en los
laboratorios de diagnstico veterinario de la red nacional, ofrecen una especificidad y
sensibilidad mayor si se comparan con las tcnicas serolgicas.

INDICE
1. Elementos generales de Inmunologia.
1.1. La respuesta inmune
1.2. Antgenos. Caractersticas esenciales.
1.3. Molculas de anticuerpos.
1.3.1. Caractersticas respuesta primaria y secundaria.
1.4. Reaccin antgeno-anticuerpo.
2. Aspectos generales para el diagnstico inmunolgico.
2.1. Preparacin de inmungenos.
2.2. Produccin de anticuerpos.
2.2.1. Policlonales
2.2.2. Monoclonales. Su utilidad en el diagnstico.
2.3. Preparacin de conjugados.
3. Mtodos de diagnstico serolgico.
3.1. Tcnicas de aglutinacin.
3.1.1. Seroaglutinacin rpida en lminas
3.1.2. Aglutinacin en ltex.
3.1.3. Inhibicin de la hemoaglutinacin.
3.1.4. Hemoaglutinacin pasiva o indirecta
3.2. Tcnicas de precipitacin.
3.2.1. Inmunodifusin o difusin en gel de agar.
3.3. Tcnicas inmunoenzimticas.
3.4. Inmunoblotting o Western blot.
3.5. Inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa.
3.6. Neutralizacin.
3.7. Fijacin de complemento.
4. Mtodos de diagnstico molecular.
4.1. Hibridacin molecular.
4.2. Sondas de cidos nucleicos.
4.3. Reaccin en cadena de la polimerasa.
5. Referencias.

1.- Elementos generales sobre inmunologa

1.1.- La respuesta inmune.
La principal funcin del sistema inmune es proteger a los animales de organismos
infecciosos y sus productos txicos. Este sistema involucra un amplio rango de
mecanismos para localizar clulas extraas, virus o macromolculas, neutralizar estos
invasores y eliminarlos por medio de protenas y clulas que circulan, a travs del cuerpo.
Los diferentes mecanismos que constituyen esta vigilancia pueden ser divididos en dos
categoras: Inmunidad no adaptativa o inmunidad innata e Inmunidad adaptativa o
adquirida.
Los sistemas inmune innato y adaptativo estn formados por una serie de clulas,
distribuidas por todo el organismo cuyas funciones se enumeran a continuacin:

Factores solubles

Clulas

Inmunidad Innata
(inespecfica)
Resistencia no mejorada
por infeccin repetida
Lisozima, protenas de
fase aguda ejemplo:
interferon
Fagocitos, clulas NK

Inmunidad adaptativa
(especfica)
Resistencia mejorada por
infeccin repetida.
Anticuerpos

Linfocitos T

La inmunidad no adaptativa acta como una primera lnea de defensa frente a los agentes
infecciosos y la mayora de los patgenos pueden controlarse antes que produzcan una
infeccin declarada, es mediada por clulas que responden no especficamente a las
molculas forneas e incluye sistemas como la fagocitosis, secrecin de lisozimas y lisis
celular por las clulas NK (del ingls natural killer). La inmunidad no adaptativa no
aumenta por repetidas exposiciones a la molcula fornea.
La fagocitosis ocurre por clulas fagocitarias de la estirpe monocitos/macrfago. Estas
clulas son de diferentes tipos pero todas ellas se derivan de las clulas primordiales de la
mdula sea y su funcin es englobar partculas, fagocitarlas y destruirlas. Las clulas NK
(agresoras naturales) son leucocitos que pueden reconocer los cambios de la superficie
celular que se producen en algunas clulas infectadas y en ciertas clulas tumorales. Las
clulas NK se unen a estas clulas diana y las destruyen. Esta reaccin se denomina
citotoxicidad.

Si estas primeras defensas quedan superadas, se activa el sistema inmune adaptativo y

se elabora una reaccin especfica para cada agente infeccioso que puede ser
aumentada por reexposicin. El sistema inmune adaptativo guarda memoria del agente
infeccioso y puede impedir que cause enfermedad ms tarde; por lo tanto sus
caractersticas claves son la especificidad y la memoria.
La respuesta de este sistema es mediada por clulas llamadas linfocitos T o B. Los
linfocitos B secretan protenas que se unen especficamente a molculas forneas. Las
mismas son secretadas y conocidas como anticuerpos que forman parte de un grupo, el
de las inmunoglobulinas, muy relacionado entre s, englobado en las protenas sricas.
Para realizar su funcin se distribuyen en la sangre (respuesta inmune humoral) o
atraviesan las mucosas que llegan a la superficie de estas (respuesta inmune de las
mucosas). Los trminos inmunoglobulina y anticuerpos son usados indistintamente.
Los linfocitos T sintetizan receptores de superficie celular y juegan su papel destruyendo
clulas con alteraciones en la superficie y produciendo linfoquinas. Las linfoquinas son
sustancias, que entre otras cosas, activan a los macrfagos y mejoran la respuesta de los
linfocitos B.
Cualquier molcula que pueda unirse a un anticuerpo es conocida como antgeno.
Cuando una molcula es usada para inducir una respuesta adaptativa es llamada
inmungeno. Los trminos antgeno e inmungeno son usados para describir diferentes
propiedades de una molcula. Inmunogenicidad, no es una propiedad intrnseca de
cualquier molcula, est definida slo por su habilidad para inducir una respuesta
adaptativa. La antigenicidad tampoco es una propiedad intrnseca de las molculas sino
que esta definida por su habilidad a unirse a un anticuerpo.
1.2.- Antgenos. Caractersticas esenciales.
Pueden funcionar como antgenos, pptidos, microorganismos y molculas extraas como
protenas,
polisacridos o carbohidratos, pero deben de cumplir con algunas
caractersticas para garantizar su inmunogenicidad.
El tamao molecular es una de ellas; molculas de talla grande son mejores
inmungenos que las de talla pequea (menos de 1000 Da). La conjugacin o unin
covalente de estas ltimas, denominadas haptenos, con molculas de mayor peso
molecular, denominadas transportadores (carrier) puede provocar una respuesta inmune
en el animal, y una vez formados los elementos de respuesta (anticuerpo y linfocitos
sensibilizados) se unirn a ellos sin necesidad de estar acopladas a su acarreador.
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La complejidad de las molculas es otro elemento importante, mientras ms compleja

mejor antgeno resulta. Por ejemplo el almidn y otros polisacridos repetitivos son pobres
antgenos a diferencia de complejos lipopolisacridos de bacterias.
La estabilidad estructural o degradabilidad de una sustancia tambin define su
capacidad de estimular una respuesta inmune an siendo extraa compleja y de talla
adecuada. Molculas inestables y que se destruyen muy rpidamente tampoco son
buenas como inmungenos y deben ser aplicadas con adyuvantes.
Las regiones de un antgeno que interactan con un anticuerpo son definidas como
epitopos o determinantes antignicos. Estructuralmente estos son sitios definidos que
por lo general asocian aproximadamente 14 aminocidos.
Para una molcula determinada de antgeno, el nmero de sitios antignicos dispuestos
en la superficie de la molcula determina la valencia del antgeno, que crece con las
dimensiones de la molcula antignica.
1.3.- Molculas de anticuerpos.
Una de las principales respuestas del organismo contra un antgeno forneo es la
inmunidad humoral caracterizada por la produccin de anticuerpos por los linfocitos B.
Actualmente se sabe que en este proceso intervienen dos tipos diferentes de molculas:
las inmunoglobulinas y los receptores antgeno especficos de las clulas T. La diversidad
y la heterogeneidad son rasgos caractersticos de estas dos familias de molculas
capaces de reconocer a numerosos antgenos distintos. Estn presentes en el suero y
lquidos orgnicos y son producidos en grandes cantidades por las clulas plasmticas.
Los anticuerpos son glicoprotenas, que pertenecen a la familia de las globulinas, y
quizs la caracterstica ms sobresaliente de stas, es que actan como puente entre una
diversidad de antgenos prcticamente ilimitada (existen varios millones de antgenos
potenciales) y un nmero finito de mecanismos efectores destinados a la eliminacin fsica
del agente invasor.
Las inmunoglobulinas son protenas tetramricas compuestas por una o ms copias de
una unidad caracterstica que se visualiza en forma de Y. Cada molcula contiene cuatro
polipptidos: dos copias idnticas de un polipptido conocido como cadena pesada y dos
copias idnticas de uno conocido como cadena ligera, unidos entre ellos por enlaces
disulfuro inter e intracatenarios.
5

Para cumplir su doble funcin de unirse al antgeno, que puede ser muy variable, y a la
vez llevar a cabo su funcin biolgica de eliminarlo, las inmunoglobulinas deben tener una
estructura adecuada con una regin variable o sitios de combinacin con el antgeno
(paratopos) y una regin constante o efectora de las funciones biolgicas, que condiciona
la ocurrencia de ciertas reacciones secundarias, como la unin a los tejidos y molculas
del husped incluyendo diversas clulas del sistema inmunitario, clulas fagocticas y el
primer componente del sistema clsico del complemento, y la mayor efectividad de
algunos inmunoensayos.

Figura 1. Dominios inmunoglobulnicos. Cada asa de la cadena peptdica, formada por un

enlace disulfuro intracatenario, representa un solo dominio y estos se denominan VH y CH,
etc., como se indica.
El extremo aminoterminal de la molcula hasta el aminocido 110 constituye la regin
variable, dentro de la que se encuentran zonas hipervariables con una alta frecuencia de
variacin entre los aminocidos que aparecen en esta regin y son estos aminocidos los
que directamente se combinan con el antgeno.
Los anticuerpos estn divididos en 5 clases segn el nmero de unidades Y y el tipo de
cadena pesada que contengan, as existen los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Las
diferencias en este sentido determinan la participacin de cada clase en diferentes tipos
de respuesta inmune y un estado particular de la maduracin de la respuesta tal como se
muestra en la tabla siguiente:
6

Tabla 1. Principales clases de las inmunoglobulinas.

Caractersticas
Cadena pesada
Cadena ligera
Frmula
Molecular
Estructura Y

IgG

o
22 o 22

IgM

o
(22)5 o
(22)5

IgA

o
(22)n o
(22)n

IgE

o
2 2 o 2 2

IgD

o
22 o 22

Valencia para la
unin del
antgeno
Concentracin
en suero
Funcin

10

2, 4 o 6

8-16 mg/ml

0,5-2 mg/ml

1-4 mg/ml

Respuesta
secundaria

Respuesta
primaria

10-400 ng/ml 0-0,4 mg/ml

Proteccin Proteccin
en las
contra los
mucosas parsitos ()
de las
membranas

n = 1, 2 o 3
Las molculas de inmunoglobulinas de estas clases difieren tambin unas de otras en
tamao, carga, composicin de aminocidos y contenido de carbohidratos. Cada clase de
inmunoglobulina tiene a su vez subclases determinadas tambin por el tipo de cadena
pesada.
1.3.1. Caractersticas respuesta primaria y secundaria.
Cuando un animal recibe un estmulo antignico las clulas de su sistema inmune
reconocen al antgeno y producen una reaccin inmunitaria. Esta reaccin inmunitaria
puede adoptar la forma de inmunidad mediada por clulas o implicar la produccin de
anticuerpos dirigidos contra el antgeno. El tipo de reaccin depender del modo como se
presenta el antgeno a los linfocitos y muchas reacciones inmunolgicas muestran ambas
clases de respuesta. En el segundo y subsiguientes contactos con el antgeno, el tipo de
7

respuesta depende en gran parte del resultado de la primera estimulacin antignica; pero
la cantidad y la calidad de las respuestas son diferentes. La capacidad para desarrollar
una respuesta secundaria se basa en la memoria inmunolgica y constituye el fundamento
del proceso de vacunacin.
La base celular de dicha memoria es la expansin de las poblaciones linfocitarias
antgeno especficas durante la respuesta primaria, de modo que exista el mayor nmero
de linfocitos B y T capaces de responder a ese antgeno. Las clulas B maduras difieren
cualitativamente de sus homnimas no preparadas (linfocito inmaduro) porque aquellos
son capaces de fabricar IgG con mayor rapidez y tienen generalmente una mayor afinidad
hacia los receptores antignicos a causa de la seleccin realizada durante la respuesta
primaria.
De forma general la respuesta de anticuerpos tiene las siguientes fases:
1. Fase de latencia durante la cual no se detectan anticuerpos.
2. Fase de incremento en la que el ttulo de anticuerpos se eleva de forma logartmica.
3. Fase de meseta, se estabiliza el ttulo de anticuerpos.
4. Fase de descenso en la que los anticuerpos son catabolizados o se unen al antgeno y
son eliminados de la circulacin.
El anlisis de las respuestas consecutivas a los contactos antignicos primario y
secundario demuestran que esas respuestas difieren en cuatro aspectos principales:
Evolucin cronolgica. La respuesta secundaria tiene una fase de latencia ms corta,
una meseta y una fase de descenso prolongadas.
Ttulo de anticuerpos. El nivel de anticuerpos durante la meseta es mucho ms alto en
la respuesta secundaria, generalmente 10 veces superior, al nivel alcanzado en la fase
de meseta de la respuesta primaria.
Clase de anticuerpos. En la respuesta primaria los anticuerpos IgM constituyen una
proporcin principal, mientras que la respuesta secundaria se compone casi por
completo de anticuerpos IgG.
Afinidad de los anticuerpos. La afinidad de los anticuerpos es por lo comn mucho
mayor en la respuesta secundaria. Esta es la denominada "maduracin de la afinidad".
Las caractersticas generales de las respuestas primarias y secundarias se resumen en la
tabla siguiente:

Tabla 2: Caractersticas generales de las respuestas primarias y secundarias.

Caractersticas
Intervalo despus de
la inmunizacin
Pico de respuesta
Isotipo
Afinidad

Respuesta primaria
5-10 das

Respuesta secundaria
1-3 das

Pequeo
IgM > IgG
Baja muy variable

Inducido por
Inmunizacin

Todos los inmungenos

Altas dosis, optimizado
por adyuvantes

Grande
IgG , IgA e IgE
Alta (maduracin de la
afinidad)
Slo antgenos proteicos
Bajas dosis, usualmente
no necesita adyuvante

1.4.- Reaccin antgeno anticuerpo

En la interaccin antgeno anticuerpo se basan todas las tcnicas inmunoqumicas.
Depende enteramente de interacciones no covalentes que incluyen puentes de hidrgeno,
fuerzas de Van der Waals, interacciones electrostticas y enlaces hidrofbicos.
La afinidad es una medida de la fortaleza de unin de un epitope a un anticuerpo. Por la
naturaleza no covalente y reversible de esta unin sigue termodinmicamente los
principios de una interaccin bimolecular reversible donde la constante de afinidad Ka se
describe como:
Ka = [ Ac - Ag] / [Ac] x [Ag]
[Ac] = concentracin molar de los sitios de unin no ocupados del anticuerpo.
[Ag] = Concentracin molar de los sitios de unin no ocupados del antgeno.
[Ac - Ag] = concentracin molar del complejo antgeno anticuerpo.
En trminos prcticos la afinidad describe la cantidad de complejos antgeno-anticuerpo
que pueden ser encontrados en el equilibrio. Anticuerpos de alta afinidad pueden unirse a
una gran cantidad de antgenos en un perodo de tiempo menor que los de baja afinidad;
lo que indica que en las interacciones de alta afinidad hay un buen reconocimiento de los
epitopes por los paratopes del anticuerpo.
9

La afinidad de la interaccin Ag-Ac puede ser afectada por cambios en la temperatura, el

pH y el solvente, elementos a observar en los ensayos inmnoqumicos. En funcin de la
afinidad del anticuerpo la formacin del complejo puede ser manipulada variando la
concentracin de antgeno o de anticuerpo. Pequeos cambios en la estructura del
antgeno pueden afectar profundamente la fortaleza de interaccin antgeno anticuerpo.
Se describe que la prdida de un simple puente de hidrgeno en la interfase puede reducir
la fuerza de interaccin mil veces. La avidez es una medida de la estabilidad de la unin
Ag-Ac, aspecto que determina el xito de los ensayos inmunoqumicos.
Como habamos visto, los anticuerpos por su estructura tienen ms de un sitio de unin
con el antgeno, es decir son multivalentes (tabla 1), por ejemplo las IgG y algunas IgA
son bivalentes y las IgM son decavalentes. Por su parte, los antgenos son multivalentes
cuando contienen varios epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos diferentes
o mltiples copias de un mismo epitopo como es el caso de los homopolmeros que se
usan en algunos ensayos.
Cuando los anticuerpos y antgenos forman complejos multivalentes la fuerza de
interaccin aumenta grandemente haciendo la reaccin prcticamente irreversible.
A continuacin ilustramos algunos ejemplos:

Fig. 2. Uniones bivalentes de anticuerpos a antgenos polimricos incrementan la avidez.

Este tipo de interaccin puede ocurrir en todas las tcnicas inmunoqumicas.

10

Fig. 3. Anticuerpos policlonales que se unen a un antgeno y tiene mltiples epitopos

formando un gran complejo multimrico. Esto ocurre en reacciones de
inmunoprecipitacin.

Fig. 4. Anticuerpos policlonales unidos a un antgeno que tiene mltiples epitopos creando
un buen blanco para uniones multimricas o reactivos secundarios. Es til en muchas
tcnicas inmunoqumicas que emplean reactivos secundarios.

Fig. 5. Antgenos inmovilizados sobre un soporte slido a altas concentraciones

promueven una alta avidez. Est presente en inmunoblotting y otros ensayos.
11

Como los anticuerpos pueden reconocer regiones relativamente pequeas de un antgeno,

ocasionalmente pueden reaccionar con epitopos similares en otras molculas. Esta es la
base de las reacciones cruzadas que pueden ocurrir en las tcnicas inmunoqumicas y
que por lo general resultan indeseables.
Aunque epitopes similares pueden encontrarse en molculas relacionadas esto no implica
una relacin funcional entre las mismas.
2.- Aspectos generales para el diagnstico inmunolgico.
2.1.- Preparacin de inmungenos.
Como habamos sealado, protenas, pptidos, carbohidratos, cidos nucleicos, lpidos y
otros compuestos sintticos o naturales pueden actuar como poderosos inmungenos,
pero resulta importante seleccionar la forma de presentacin de los mismos al animal para
lograr una fuerte y apropiada respuesta.
En la preparacin de un antgeno el primer aspecto a tener en cuenta es el grado de
pureza que debe tener el mismo en funcin del objetivo del anticuerpo resultante de la
inmunizacin. Si se quiere obtener un anticuerpo de alta especifcidad que slo reconozca
al antgeno apropiado entonces es esencial que el antgeno sea purificado o que la
preparacin de antgeno sea utilizada para obtener anticuerpos monoclonales.
La purificacin puede realizarse por extraccin diferencial, fraccionamiento subcelular o
por tcnicas de cromatografa. Cuando se usan antgenos proteicos si el polipptido de
inters puede verse como una sola banda en geles de poliacrilamida, la banda cortada del
gel puede ser utilizada como inmungeno con buena respuesta.
Cuando los anticuerpos que se quieren lograr no requieren de alta especificidad pueden
utilizarse preparados antignicos sin purificar. Debe tenerse en cuenta que en una mezcla
de antgenos la inmunogenicidad de los compuestos vara, as los anticuerpos producidos
contra algunos de los compuestos pueden dominar la respuesta. Esto puede determinarse
slo de forma emprica.
La fuente del antgeno determina en ltima instancia los procedimientos a emplear para la
extraccin del mismo y su purificacin de ser necesario. Diferentes mtodos han sido
empleados para la obtencin de antgenos y en la mayora de los casos se utilizan
combinaciones de los mismos. Es importante tener en cuenta que el mtodo o los
mtodos seleccionados para la obtencin del antgeno no produzcan alteraciones o la
12

desnaturalizacin del mismo porque esto se reflejar en la especificidad de los anticuerpos

inducidos por la protena alterada o desnaturalizada.
Diversos mtodos han sido empleados en la obtencin y purificacin de antgenos. De
forma general entre los mtodos ms empleados podemos citar:
Congelacin y descongelacin. Durante este proceso se forman cristales de hielo
que rompen la membrana de la clula, liberando su contenido al medio externo.
Sonicacin. El empleo de ondas snicas produce implosin y cavitacin de los
tejidos desintegrndolos. La sonicacin se lleva a cabo por debajo de 18 amplitudes.
Se debe de tener precaucin para evitar el exceso de calor y la formacin de
espuma en el material sometido a la sonicacin.
Maceracin. En este procedimiento los tejidos se maceran ejerciendo movimientos
de rotacin y hacia abajo en un mortero. En ocasiones para lograr una mejor
destruccin del tejido es necesario aadir al material a macerar arena de mar, polvo
de vidrio, etc.
Precipitacin con sulfato de amonio. Es muy utilizado en la separacin de la
inmunoglobulinas de los dems componentes del suero. Tambin es utilizado en la
obtencin de antgenos virales solubles.
Filtracin. Permite la separacin de restos celulares de las fracciones solubles, que
dependen del tamao del poro del filtro o de las membranas utilizadas que retienen
molculas de diferentes pesos moleculares.
Centrifugacin. Permite la separacin de restos celulares de las fracciones solubles
de acuerdo a las gravedades a las cuales se centrfuga la muestra.
Electroforesis en gel de poliacrilamida. Permite la migracin a travs de un gel de
las molculas de acuerdo a su tamao en presencia de un campo elctrico.
Los antgenos bacterianos de acuerdo con el lugar donde se localizan pueden clasificarse
en: antgenos capsulares, antgenos de la pared (somticos), antgenos flagelares y
toxinas de excrecin. La naturaleza qumica de los mismos es proteica y polisacardica en
el caso de los capsulares y gluco-lipoproteica para los somticos.
Como inmungenos bacterianos pueden ser utilizadas clulas completas, fracciones
celulares puras (cpsula, pared, flagelos, etc) o protenas especficas puras. Estos mismos
elementos pueden ser utilizados como antgenos en los ensayos inmunoqumicos
dependiendo de los propsitos y exigencias de la tcnica; por ejemplo los antgenos
somticos son utilizados en tcnicas de aglutinacin o precipitacin como es el caso de la
inmunofluorescencia e inmunotransferencia, mientras que los antgenos solubles son
empleados en tcnicas de inmunodifusin y el ELISA.
13

Los antgenos virales pueden ser preparados a partir de partculas virales purificadas o de
protenas especficas de la cpsida, tanto para ensayos inmunoqumicos como para
inmungenos. En la actualidad se emplean con frecuencia los antgenos y protenas,
obtenidos por va recombinante, los que ofrecen ventajas con respecto a los
convencionales debido a que es ms fcil su purificacin, se obtiene una buena respuesta
y se elimina el riesgo de trabajar con organismos vivos, sobre todo, en aquellos que tienen
alta patogenicidad.
De forma general los antgenos pueden ser vivos o inactivados. Los antgenos vivos son
partculas completas que se multiplican en el hospedero, son fciles de aplicar y confieren
tanto inmunidad humoral como celular y por lo general son aplicados cuando se requiere
obtener respuesta contra protenas internas de la partcula antignica. Tienen la
desventaja de que para inducir una buena respuesta se requiere del crecimiento o la
multiplicacin del mismo en los tejidos y mientras mayor sea la cantidad de antgeno
producida mejor ser la respuesta inmune, pero las lesiones provocadas en los tejidos
pueden ser ms graves.
Los antgenos inactivados causan menos respuestas adversas que los antgenos vivos
porque no se multiplican o crecen en el husped y por lo tanto la respuesta es a las
protenas externas de la partcula antignica. Para obtener una buena respuesta inmune
con el empleo de estos antgenos se requiere de un alto contenido del mismo y adems
del uso de adyuvantes, generalmente de tipo oleoso. Tienen la desventaja de que no
inducen respuesta inmune en mucosas (importante en la proteccin contra bronquitis
infecciosa) ni de tipo celular, determinante en la proteccin contra la enfermedad de
Marek.
Es conveniente sealar que en la prctica veterinaria de acuerdo al tipo de proteccin que
se desee obtener frente a diferentes enfermedades se utiliza tanto el uso de antgenos
vivos como inactivados o una combinacin de los mismos, es decir primero se realiza la
inmunizacin con el antgeno vivo y posteriormente se emplea en dosis de recuerdo el
antgeno inactivado y se obtiene una respuesta ms elevada y duradera en el tiempo.
2.2.- Produccin de anticuerpos.
La produccin de anticuerpos es el resultado final de la activacin de los linfocitos B por un
antgeno, el cual reacciona especficamente con el epitopo que estimula su produccin.
Los anticuerpos producidos en una respuesta humoral a un estmulo antignico son
heterogneos en especificidad y pueden incluir todos las clases de inmunoglobulinas. La
heterogeneidad de esta respuesta es debida a los mltiples determinantes antignicos que
14

activan las clulas B; por lo que el suero de cualquier animal contienen una mezcla
heterognea de molculas de inmunoglobulinas y la especificidad de estas molculas ser
reflejo de la historia y exposicin antignica del organismo en el pasado.
En la obtencin de antisueros intervienen diversos factores que deben conjugarse para
lograr buenos resultados. Entre ellos se encuentran la cantidad de antgeno, su forma
fsica y grado de pureza, el esquema de inmunizacin, uso de adyuvante, la va de
inoculacin y la especie animal entre otros. Por otro lado en la preparacin de antisueros
debe decidirse contra qu componente del antgeno se desea obtener el anticuerpo.
Tambin debe de tenerse en cuenta el tiempo en que se sangra el animal para obtener el
suero. Los antisueros adquiridos entre la segunda y tercera semana despus de la
inmunizacin, aunque sus ttulos son relativamente bajos, tienen menos reacciones
cruzadas o inespecficas con otros antgenos que los obtenidos tardamente.
Para hacer ms inmunognicos los antgenos y obtener ttulos elevados de anticuerpos,
es recomendable la utilizacin de adyuvantes. Los adyuvantes son compuestos que
generalmente se agregan al antgeno hacindolo ms inmunognico e inducen la
respuesta inflamatoria que atrae clulas inmunocompetentes que procesan
adecuadamente al antgeno, dependiendo del adyuvante, estimulan a las clulas para
liberar factores que activan la respuesta inmune como es el caso de los oleosos. Uno de
los adyuvantes ms utilizados es el adyuvante incompleto de Freunds (AIF), el cual es un
aceite mineral con un emulsificante para que los antgenos que se encuentran en fase
acuosa puedan integrarse a la fase oleosa. Una mejor respuesta se obtiene con este
adyuvante cuando se le aaden micobacterias muertas, que estimulan una fuerte
respuesta inflamatoria y provoca un granuloma en el sitio de aplicacin, y se denomina
adyuvante completo de Freunds (ACF). Tambin se usa como adyuvante el hidrxido de
aluminio que estimula la respuesta inmune en menor grado que los adyuvantes oleosos,
pero es relativamente inocuo y no provoca la inflamacin del ACF.
2.2.1. Anticuerpos Policlonales.
En las tcnicas de diagnstico comnmente empleadas se han utilizado durante muchos
aos las preparaciones policlonales de anticuerpos, obtenidas por inmunizaciones
repetidas en diversas especies animales entre las que se destacan conejos, cabras,
ovejas, caballos, aves, etc. con antgenos purificados o microorganismos vivos. Su
produccin es relativamente simple y de bajo costo, adems poseen buena estabilidad a
las variaciones de pH y las concentraciones de sales.
15

Frente a la inmunizacin con un antgeno completo la respuesta de anticuerpos est

formada por los productos de un nmero variable y siempre cambiante de clones de
linfocitos B (respuesta policlonal). Los epitopes reconocidos por cada clon (es decir, por
cada anticuerpo), la afinidad y la clase de los anticuerpos son diferentes y pueden cambiar
con el decursar del proceso de inmunizacin.
En una respuesta tpica se activan, proliferan y diferencian solo los linfocitos con
receptores especficos para los determinantes del antgeno, bajo la influencia de diversas
citocinas producidas por las clulas T auxiliadoras. Parte de cada clon expandido madura
hacia clulas plasmticas que producen inmunoglobulinas de tipo M especficas, de baja
afinidad. Durante la inmunizacin continua, parte de la poblacin activa comienza a
producir inmunoglobulina del tipo gamma (IgG), debido a un cambio de clase. Otra parte
se convierte en clulas de "memoria. La inmunizacin repetida (hiperinmunizacin) acta
como ciclos progresivos de seleccin de los clones con receptores de mayor afinidad.
Antgeno

Inmunizacin

Respuesta clonal
de linfocitos B

Preparacin
policlonal de
anticuerpos
Fig. 6. Produccin de Anticuerpos Policlonales. Al inmunizar un animal con el antgeno se
produce la activacin de varios clones de linfocitos B con receptores especficos para
diferentes determinantes antignicos. La proliferacin y diferenciacin de estos clones
lleva a la generacin de clulas plasmticas, secretoras de los respectivos anticuerpos
especficos. La sangre del animal contiene una mezcla de inmunoglobulinas de distintas
subclases, afinidad y especificidad fina (epitopo reconocido) para el antgeno.
16

Todo lo anterior nos indica que en la prctica es imposible controlar la composicin de las
preparaciones de anticuerpos policlonales que se obtienen de animales inmunizados.
Estas preparaciones son heterogneas para los anticuerpos que contienen en trminos de
isotipo, afinidad y epitopo reconocido. Adems de ser diferentes de animal a animal
inmunizado, e incluso, en un mismo animal a distintos tiempos del proceso de
inmunizacin.
Por lo tanto, una cuestin importante a tener en cuenta en los anticuerpos policlonales es
el problema de la reactividad cruzada frente a determinantes antignicos de otros
antgenos de diferente origen, lo que trae serias limitaciones a los ensayos. Las
reacciones cruzadas se pueden reducir realizando absorciones apropiadas, pero ello
frecuentemente ocasiona una prdida de ttulo.
Cuando el ensayo requiere que el anticuerpo producido sea slo contra un determinante
antignico y que sea de un solo tipo es decir, con especificidad, afinidad y clase
conocidos, tendra que ser elaborado a partir de un solo clon de clulas B, un anticuerpo
monoclonal, lo que nos proporcionara una preparacin estable y reproducible de
anticuerpos uniformes.
2.2.2. Anticuerpos Monoclonales. Su utilidad en el diagnstico.
La posibilidad de obtener preparaciones especficas, repetibles e inagotables de
anticuerpos con funciones predefinidas (anticuerpos monoclonales) se hizo realidad entre
1974-1975 como resultado de los experimentos realizados por Kohler y Milstein.
Estos investigadores aprovecharon la existencia de mielomas murinos y realizaron
fusiones entre ellos y linfocitos provenientes de ratones BALB/c inmunizados con antgeno
definidos, y obtuvieran hibridomas de crecimiento continuo en cultivo capaces de secretar
una variedad de anticuerpos reactivos contra el antgeno empleado para inmunizar los
ratones.

17

Antgeno

Mielomas en cultivo

Inmunizacin

Respuesta clonal
de linfocitos B

Mielomas
Linfocitos B
Hibridomas
Clonaj

Anticuerpos monoclonales
Fig. 7. Produccin de anticuerpos monoclonales. Las clulas esplnicas del ratn
inmunizado se fusionan con clulas de mieloma adaptadas a cultivo. Los hibridomas
resultantes se clonan, y se obtienen de esta forma lneas celulares que secretan al
sobrenandante del cultivo anticuerpos monoclonales de subclase, afinidad y especificidad
fina idnticas.
La produccin de hibridomas de ratn productores de anticuerpos monoclonales es una
tecnologa noble que funciona en laboratorios con un equipamiento muy diverso,
condiciones y experiencia y consta de forma general de los siguientes pasos o etapas:
1.- Seleccin de la cepa y condiciones del ratn a inmunizar.
18

2.- Definicin del esquema de inmunizacin.

3.- Desarrollo de un mtodo analtico adecuado para el tamizaje de anticuerpos
especficos.
4.- Inmunizacin, titulacin y seleccin de los animales donantes.
5.- Preparacin del mieloma parental.
6.- Fusin.
7.- Tamizaje de los anticuerpos y seleccin de los hibridomas.
8.- Clonacin de hibridomas. Retamizaje. Cultivo y congelacin de clones.
9.- Caracterizacin inicial de los anticuerpos.
10.- Produccin y purificacin de anticuerpos para la caracterizacin y aplicacin.
Gracias a las caractersticas de la tcnica de generacin de hibridomas los anticuerpos
monoclonales resultantes no slo pueden ser seleccionados para su especificidad, sino
tambin para aquellas funciones efectoras deseadas o propiedades tiles para el
investigador (isotipo, afinidad, capacidad de aglutinacin neutralizacin captura, etc.).
Los anticuerpos monoclonales permiten obtener la especificidad, reproducibilidad e
inagotabilidad, imposibles de lograr por tcnicas convencionales de inmunizacin y
preparacin de antisueros y los ha convertido rpidamente en uno de los elementos
bsicos para el desarrollo de la biomedicina moderna. En el campo del diagnstico tiene
una enorme aplicacin ya que son reactivos ideales por su especificidad, estabilidad y
produccin ilimitada, que permiten la diferenciacin de cepas de gran similitud, imposibles
de ser diferenciadas por los anticuerpos policlonales como ocurre, por ejemplo, entre el
virus de la peste porcina clsica y el de la diarrea viral bovina.
2.3.- Preparacin de conjugados.
Con el amplio uso de las tcnicas ms avanzadas en la serologa se ha incrementado el
uso de anticuerpos o antgenos marcados con una enzima (conjugados) para poder
visualizar la reaccin antgeno-anticuerpo. Los conjugados resultantes deben de tener
tanto actividad inmunolgica como enzimtica y la reaccin es cuantificada por el
desarrollo de color despus de la adicin de sustrato.
Generalmente las enzimas son conjugadas a los anticuerpos, otros sistemas usan la
conjugacin de enzimas a reactores seudoinmunes como la protena A de Staphylococcus
que se une al fragmento Fc de la IgG de la mayora de las especies de mamferos. Otro
sistema utilizado es el de biotina-avidina por su alta afinidad de unin. Tambin para
incrementar la sensibilidad del ensayo se han utilizado sustratos de alta energa como los
fluorescentes, quimioluminiscentes o radioactivos.
19

Las enzimas y sus respectivos sustratos ms comnmente utilizados se muestran en la

siguiente tabla:

Tabla 3. Enzimas y sustratos ms utilizados en la produccin de conjugados.

Enzima

Sustratos

Peroxidasa

Ortofenilendiamina (OPD)
cido azinodietilbenzotiazolinesulfnico (ABTS)
cido 5-aminosaliclico (5-AS)
Tetrametilbenzidina (TMB)
Hidroximetilbenzidina

Fosfatasa alcalina p-nitrofenil fosfato

-Galactosidasa

o-nitrofenil galactopiransido

Ureasa

cambio de pH en presencia de un indicador (prpura

de bromocresol)

La ms utilizada en el diagnstico es la peroxidasa debido a que es la ms sensible.

Muchas firmas comerciales producen conjugados antiespecies pero se debe de tener
cuidado en seleccionar exactamente el antisuero requerido para el ensayo particular. El
conjugado debe de ser titulado en el sistema de eleccin, as como tambin contra el tipo
de antgeno particular. Un buen conjugado debe ser usado como mnimo en una dilucin
de 1/1000 y un buen ttulo de conjugado oscila entre 1/5000 y 1/10000.
En nuestro laboratorio han sido producidos conjugados enzimticos antiespecies,
fundamentalmente con las enzimas peroxidasa y la fosfatasa alcalina, con resultados
satisfactorios. Un elemento importante a tener en cuenta para el buen funcionamiento y
mayor utilizacin de los mismos es su conservacin, la cual debe de ser a -20C. Para
ello es imprescindible aadir glicerol volumen a volumen para evitar las congelaciones y
descongelaciones repetidas del conjugado enzimtico que pudieran afectar la actividad
inmunolgica del mismo.
3.- Mtodos de diagnstico serolgico.
20

La serologa es la disciplina que estudia la respuesta humoral frente a las enfermedades y

vacunaciones. El desarrollo de la biologa molecular y la utilizacin de los anticuerpos
monoclonales ha permitido disponer en los ltimos aos de reactivos de diagnstico de
gran sensibilidad, especificidad, de fcil y sencilla realizacin e interpretacin.
En la mayora de las enfermedades infecciosas, las tcnicas serolgicas constituyen la
base del diagnstico de laboratorio para los programas de control y erradicacin. Estas
pruebas son de gran utilidad cuando se cuenta con una historia completa del rebao, sin
embargo, pueden tener poco o ningn valor por s solas y confundir con frecuencia a quin
trata de interpretarlas.
Cuando realizamos una simple determinacin de anticuerpos, cualitativa o cuantitativa, lo
nico que podemos deducir es que los animales estuvieron en contacto con el antgeno,
pero difcilmente podremos determinar, bajo condiciones prcticas, si fue en forma de
vacuna, si fue un brote de campo o en el caso de animales muy jvenes si se trata de
anticuerpos maternos. En cambio un diagnstico serolgico con una buena historia clnica
y seguimiento de las pruebas puede ayudarnos a corroborar un diagnstico clnico, as
como la evolucin de la respuesta a la vacunacin, el estado inmunolgico, en general del
rebao y en algunos casos la resistencia que podemos esperar de un grupo determinado.
Para corroborar el diagnstico generalmente se requieren dos muestras: una tomada
antes o en el momento de la aparicin de los signos, la que se denomina suero de fase I, y
otra muestra obtenida en la convalescencia, denominada suero fase II, alrededor de cuatro
semanas despus. En aquellos casos en que no se vacuna contra la enfermedad la
presencia de anticuerpos en una muestra ser suficiente para diagnosticar la presencia de
la enfermedad.
Cuando se piensa establecer pruebas de diagnstico inmunolgico para reconocer un
agente es recomendable analizar:
1.
2.
3.
4.

Caractersticas del agente para determinar los antgenos importantes.

La patogenia de la enfermedad que provoca.
Posible tipo de respuesta inmune de acuerdo con la especie animal que afecta.
Las caractersticas de las diversas pruebas, tales como funcionamiento, sensibilidad,
clases de anticuerpos que reconocen as como sus ventajas y desventajas.

Tambin se deben de tener en cuenta las siguientes consideraciones para seleccionar la

tcnica a utilizar:
21

a)- El volumen de reactivos (antgeno y antisuero) debe ser pequeo porque en pocas
ocasiones se cuenta con gran cantidad de los mismos.
b)- El ensayo debe ser lo suficientemente sensible para detectar niveles bajos de
anticuerpos y adems ser especfica para los anticuerpos que se buscan. Cunto ms
purificado sea el antgeno menores sern las reacciones cruzadas y la prueba resultar
ms especfica.
c)- La prueba debe ser reproducible, sencilla de aprender y llevarla a cabo.
d)- La tcnica no debe ser afectada por factores inespecficos y estos deben ser fciles de
eliminar.
e)- El ensayo de eleccin debe ser validado con una prueba que ya est establecida y que
sea confiable.
Si no se aplican estos criterios, en muchos casos las pruebas pueden fallar o no tener la
eficiencia necesaria.
Las tcnicas serolgicas se pueden dividir en tres categoras:
Las pruebas de unin primaria. Son las ms sensibles en trminos de cuantificar los
anticuerpos detectados. Miden la interaccin entre el antgeno y el anticuerpo por la
cantidad de complejo inmune formado. La reaccin no se puede reconocer a simple
vista por lo que se usan mtodos en los que se marca el antgeno o el anticuerpo
con una molcula como los istopos en los radioinmunoensayos, con enzimas como
en las pruebas inmunoenzimticas, con fluorocromos que pueden ser detectados en
el microscopio de fluorescencia, con sustancias opacas al microscopio electrnico
como la ferritina, etc.
Las pruebas de unin secundaria. Miden los resultados de la interaccin antgeno
anticuerpo in vitro y se observa una reaccin notoria a simple vista. La formacin de
complejos inmunes se mide indirectamente y aqu cambia el estado de dispersin
del antgeno o se modifica el anticuerpo. Si el antgeno es soluble se observa
precipitacin, si es particulado se presenta aglutinacin o puede haber lisis de un
sistema indicador como con los glbulos rojos en la fijacin de complemento. Por lo
general, estas pruebas son menos sensibles que las pruebas de unin primaria pero
son fciles de realizar.
Las pruebas de unin terciaria. Miden el efecto protectivo de los anticuerpos in vivo.
En estas reacciones pueden presentarse manifestaciones visibles generalmente de
tipo inflamatorio. Estas reacciones se denominan de hipersensibilidad y pueden ser
de tipo temprano o tardo, segn el tiempo que tardan en aparecer.
Los reactivos ms empleados en las pruebas serolgicas son:
22

Suero: Es la fuente comn de anticuerpos. Puede ser guardado en congelacin y utilizado

cuando sea necesario. La actividad del complemento puede ser inactivada en los casos
que sea requerido por calentamiento del suero a 56C por 30 minutos. En general se
aconseja obtener los sueros de forma individual, evitando hacer mezclas, porque al
hacerlo se diluyen los sueros mutuamente y un solo suero positivo en una mezcla de cinco
o diez, puede convertir la prueba en positiva, enmascarando, por ejemplo, animales que
no respondieron a una vacuna.
Complemento: Es un complejo de enzimas interactuantes, las cuales al ser activadas
reaccionan en cascada tendiendo a la disrupcin de las membranas celulares y la
destruccin de clulas infectadas o microorganismos invasores. Es una parte esencial de
las defensas del organismo pero debe ser cuidadosamente regulado debido a que la
activacin no controlada puede tender a una masiva destruccin celular.
Es un constituyente normal del suero fresco y el complemento del suero de curiel es muy
eficiente en las pruebas hemolticas. El suero utilizado como fuente de complemento para
las tcnicas serolgicas debe ser guardado en congelacin en pequeos volmenes y una
vez descongelado debe ser usado rpidamente.
Antiglobulinas: Las inmunoglobulinas son molculas complejas por lo que funcionan
como antgeno cuando son inyectadas en un animal de diferente especie. Son esenciales
en muchas pruebas inmunolgicas.
Anticuerpos monoclonales: Debido a su pureza y especificidad pueden ser usados
como reactivos qumicos estndares. Son frecuentemente usados en el inmunodiagnstico
sustituyendo el antisuero.
Las tcnicas serolgicas muestran la reactividad entre el antgeno y el anticuerpo. Estos
dos componentes tienen un propsito principal en el diagnstico:
a)- Identificar un aislado desconocido con un antisuero conocido.
b)- Para la deteccin en el suero de anticuerpos contra un antgeno determinado.
Los mtodos serolgicos deben de tener una sensibilidad y especificidad apropiada y un
incremento en la sensibilidad reduce la especificidad del mismo y viceversa. La rapidez es
una consideracin secundaria: la sensibilidad y la especificidad no deben de ser
sacrificadas en funcin de la velocidad. Adems las diferentes tcnicas serolgicas varan
en las concentraciones de anticuerpos (tabla 4) y en las diferentes clases de
inmunoglobulinas (tabla 5) detectadas por ellas.
23

Tabla 4. Sensibilidad aproximada de algunas pruebas inmunolgicas.

Tcnica
Radioinmunoensayo
ELISA
Inmunodifusin
Aglutinacin bacteriana
Inhibicin de la hemoaglutinacin
Fijacin de complemento
Virus neutralizacin

Protena (g/mL)
0,0001
0,0005
30
0,05
0,005
0,05
0,00005

Tabla 5. Papel de las inmunoglobulinas en las diferentes pruebas diagnsticas.

Aglutinante
Fijadora de complemento
Precipitante
Neutralizante
Tiempo de aparicin
despus de la exposicin al
antgeno
Tiempo para alcanzar pico

Clases de Inmunoglobulinas
IgG
IgM
IgA
+
+++
+
+
+++
+++
+

+
++
+
3-7 das
2-5 das
3-7 das

IgG (T)

+
3-7 das

7-21 das

7-21 das

5-14 das

7-21 das

3.1.- Tcnicas de aglutinacin.

Las reacciones de aglutinacin son causadas por el agrupamiento de partculas de
antgenos recubiertos por los anticuerpos que los reconocen en presencia de ciertos
electrolitos.
Los procedimientos de aglutinacin son ampliamente usados en el diagnstico
bacteriolgico para detectar antgenos y cuantificar anticuerpos. Se caracterizan por su
sencillez y gran sensibilidad. En estas pruebas son particularmente eficientes las
24

inmunoglobulinas del tipo M, por lo que la prueba es positiva desde las primeras etapas
del desarrollo de los anticuerpos.
Las inmunoglobulinas G que se desarrollan posteriormente no son tan eficientes en la
aglutinacin, se requiere una alta concentracin de ellas para que la reaccin sea positiva,
por lo que frecuentemente esta prueba resulta negativa en la fase crnica de la
enfermedad.
Las aplicaciones prcticas de esta prueba son pruebas de aglutinacin en placas para
detectar anticuerpos contra Salmonella pullorum, S. gallinarum, Mycoplasma gallisepticum,
M. synovae, etc.
3.1.1.- Seroaglutinacin rpida en lmina:
Es corrientemente empleada en la deteccin de niveles de anticuerpos contra
enterobacterias, brucellas y rickettsias y en la deteccin directa de las mismas con
anticuerpos monoclonales reactivos. Se basa en el principio de que la bacteria puede
agregar en presencia de anticuerpos contra sus determinantes antignicos. Es necesario
emplear antgenos bacterianos como controles positivos.
Actualmente esta tcnica se encuentra entre los mtodos ms empleados para la
deteccin de anticuerpos contra la micoplasmosis en las aves pero por su baja
especificidad no permite diferenciar la especie de micoplasma por lo que debe ser usada
como una prueba de tamiz.
3.1.2.- Aglutinacin en ltex:
Es muy empleado en el diagnstico actual. Las partculas de ltex son pequeas esferas
de poliestireno, todas con dimetro y superficie qumica uniforme, suspendidas en agua en
gran cantidad por mililitro dando un aspecto lechoso. Estas partculas pueden unirse con
anticuerpos u otras protenas mediante interacciones hidrofbicas entre sitios de la
protena y la superficie de poliestireno de las partculas. Cuando tiene lugar esta unin se
dice que las partculas estn sensibilizadas y constituyen as una herramienta para el
diagnstico que puede ser sensible, con capacidad para detectar concentraciones
inferiores a 5 g/ mL.
El procedimiento operacional para esta tcnica es tambin muy simple y puede ser
realizado en condiciones de campo por cualquier persona entrenada. El principio de la
misma consiste en poner a reaccionar una gota de reactivo de ltex sensibilizado con
25

inmunoglobulinas especficas, con una gota de muestra (orina, suero, etc.) que se mezclan
con la ayuda de un agitador y movimientos de rotacin de la placa de reaccin. Si la
muestra contiene el antgeno que las IgG reconocen en pocos segundos el ltex comienza
a aglutinar, se forman grandes grumos visibles y el aspecto lechoso del reactivo
desaparece
3.1.3.- Inhibicin de la hemoaglutinacin.
La hemoaglutinacin es la propiedad biolgica que tienen algunos virus y bacterias para
unirse a los receptores de membrana (formados por residuos del cido N-acetilmurmico)
de los glbulos rojos de mamferos y aves, siendo los ms utilizados los de pollos. Para
poder hacer visible la hemoaglutinacin son necesarias 106 partculas de antgeno por lo
que no es una tcnica de alta sensibilidad.
Los anticuerpos pueden unirse de forma cruzada con antgenos particulados los cuales
provocan su aglutinacin, que puede ser producida mezclando una suspensin de
antgeno con su antisuero. La capacidad para producir la aglutinacin es diferente para
cada clase de anticuerpo y los de tipo IgM son considerados los ms eficientes.
Los anticuerpos dirigidos contra estos antgenos pueden inhibir la hemoaglutinacin al
bloquear los sitios de unin del antgeno con los glbulos rojos y esta prueba serolgica es
la llamada inhibicin de la hemoaglutinacin o IH. Es un mtodo altamente sensible y
especfico. Adems de ser un mtodo rpido, sencillo y barato ha sido histricamente la
prueba serolgica a elegir para la identificacin de virus hemaglutinantes.
Aunque con esta prueba se determinan solo anticuerpos circulantes y no es posible
relacionar el ttulo directamente con la proteccin, resulta de gran utilidad para saber si los
animales estn infectados o si ha reaccionado adecuadamente a la vacuna. Cuando se
conoce bien el esquema de vacunacin, es posible asumir que los animales estn
protegidos al encontrar cierto ttulo, un ejemplo en la vacunacin contra la enfermedad de
Newcastle se conoce que cuando hay ttulos de anticuerpos inhibidores de la
hemaglutinacin iguales o superiores a 1/8 los animales estn protegidos.
La determinacin en el suero de anticuerpos contra la hemoaglutinina se realiza
aadiendo el mismo volumen de 4 u 8 unidades hemoaglutinantes de antgeno a cada
dilucin de suero y mediante la adicin de eritrocitos se evidencia la presencia o no de
anticuerpos en el suero. Si el suero es positivo, es decir tiene anticuerpos contra el
antgeno, los eritrocitos descienden y forman un precipitado (botn) en el fondo del tubo o
microplaca; por el contrario si el suero es negativo se observar la presencia de un
26

enrejado formado entre los glbulos rojos y el antgeno. El ttulo del suero ser el inverso
de la ms alta dilucin del suero que inhiba la aglutinacin de los glbulos rojos.
Existen dos procedimientos para realizar esta prueba:
Mtodo alfa o suero constante -virus variable. Se utiliza para la identificacin de
antgeno utilizando un suero conocido.
Mtodo beta o suero variable -virus constante. Ampliamente utilizado para la
deteccin de anticuerpos en el suero de animales infectados o vacunados.
Es importante sealar que el suero puede contener inhibidores no especficos de la
hemoaglutinacin (mucoprotenas), los cuales deben ser removidos por tratamiento de los
sueros con la enzima destructora de receptores (EDR) de Vibrio cholerae, peryodato de
potasio, kaolin o por inactivacin a 56C durante 30 minutos antes de realizar la tcnica. Si
estos inhibidores inespecficos no son removidos se obtienen resultados falsos positivos.
En la rutina de trabajo diaria de nuestro laboratorio al utilizar esta tcnica en el diagnstico
serolgico encontramos que el suero tambin puede contener aglutininas no especficas,
las cuales pueden ser fcilmente removidas por adsorcin de los sueros con los eritrocitos
que sern usados en la prueba o con eritrocitos del animal al cual se le est realizando el
diagnstico. La no eliminacin o no tratamiento de sueros heterlogos con los eritrocitos
nos dar resultados falsos negativos.
Varios ejemplos de la aplicacin prctica de esta prueba en nuestro laboratorio los
tenemos en:
- En el diagnstico serolgico as como la identificacin de Mycoplasma gallisepticum
un patgeno importante de las aves que ocasiona considerables prdidas
econmicas en la avicultura.
- En el diagnstico serolgico de la bronquitis infecciosa aviar contra el cual las aves
son vacunadas pero que est presente en la enfermedad respiratoria crnica de
etiologa complicada.
3.1.4. Hemoaglutinacin pasiva o indirecta.
Debido a que las pruebas de precipitacin son poco sensibles, algunas veces es deseable
convertir los sistemas de precipitacin en sistemas de aglutinacin porque estos ltimos
son muy sensibles para detectar anticuerpos. A esto se le denomina aglutinacin pasiva o
indirecta y consiste en absorber antgenos solubles a una partcula grande e insoluble por
27

ejemplo poliestireno, ltex, bentonita o eritrocitos. Cuando se utilizan glbulos rojos la

tcnica se llama hemoaglutinacin pasiva o indirecta.
Al tratar los glbulos rojos de carnero con cido tnico, adquieren la propiedad de
adsorber protenas sobre su superficie, de forma tal que dichos eritrocitos cubiertos con
protena son aglutinados en presencia de anticuerpos especficos contra la protena
adsorbida. En esta prueba se debe tener cuidado para controlar las reacciones
inespecficas, por lo que se hace necesario utilizar los controles adecuados. Por otra parte,
esta tcnica es poco empleada en el diagnstico de rutina pues no tiene una sensibilidad
elevada y su realizacin es laboriosa para evaluar grandes nmeros de muestras.
En nuestro pas esta tcnica se utiliz en el monitoreo de la respuesta a la vacuna de la
bronquitis infecciosa aviar en poblaciones de aves sometidas al programa de vacunacin y
para determinar la inmunidad materna en progenie de estas aves. Como resultado de este
trabajo se encontr una baja proporcin de reactores positivos en las aves vacunadas y no
se detectaron anticuerpos maternos en la progenie de estas aves. Esto es debido a la
baja sensibilidad que posee esta tcnica y a que detecta fundamentalmente anticuerpos
despus de una infeccin reciente.
3.2. Tcnicas de precipitacin.
Las tcnicas de precipitacin son aquellas, en las cuales, al mezclar una cantidad
adecuada de una solucin transparente de antgeno soluble con antisuero y ser incubada
a 37C, la mezcla comienza a opacarse, en unos minutos se vuelve fluculenta y finalmente
precipita.
La relativa proporcin de los reactantes determina la cantidad de precipitado que se forma,
por ello cuando los reactivos estn en sus concentraciones ptimas ocurre la formacin de
un enrejado el cual se hace insoluble y precipita.
3.2.1. Inmunodifusin o difusin en gel de agar.
La inmunodifusin en gel de agar se puede definir como una reaccin de precipitacin en
un medio semislido, en que la difusin de un antgeno y de su anticuerpo homlogo da
como resultado la formacin de lneas o bandas de precipitacin visibles, en el lugar
donde se encuentran las concentraciones ptimas del antgeno y el anticuerpo. Es un
mtodo simple de demostracin de la precipitacin de antgeno por anticuerpos.

28

Las tcnicas de difusin en gel pueden clasificarse en difusiones simples o dobles. En la

difusin simple un reactante, generalmente en solucin lquida, difunde en una solucin
gelificada del reactante complementario. En la doble difusin tanto la solucin de antgeno
como la de anticuerpo se separan inicialmente por una zona de gel en la que
posteriormente ambos reactantes difunden.
En este tipo de reacciones intervienen las propiedades fsicas e inmunoqumicas del
sistema. As tenemos que la velocidad de difusin para un antgeno o anticuerpo
depender de:
La concentracin de molculas, ejemplo en la inmunodifusin doble cuando las
concentraciones de los reactantes son equivalentes y sus pesos moleculares son
similares las bandas de precipitacin tienen forma recta y se encuentran
equidistantes de los pozos. Si no hay equivalencia en la concentracin el sistema o
los sistemas precipitantes se forman ms cerca del pozo con aquel reactante cuya
concentracin sea menor, es decir, la velocidad es proporcional a la concentracin.
La temperatura, una elevada temperatura acelera la difusin.
Tamao de las molculas. La velocidad de difusin es inversamente proporcional al
peso molecular.
La viscosidad del medio. La velocidad de difusin de las molculas decrece al
aumentar la viscosidad del medio.
La presencia de ms de una banda de precipitacin significa la existencia de varios
sistemas antgeno-anticuerpo.
Este ensayo permite identificar fcilmente mltiples sistemas antgeno anticuerpo y puede
usarse tambin para hacer una estimacin cualitativa de la pureza del antgeno o del
anticuerpo. Es muy utilizada en el anlisis semicuantitativo de la concentracin de
antgeno o para conocer el ttulo precipitante de un antisuero. Tambin puede utilizarse
para determinar la presencia y relaciones entre antgenos.
De forma general esta prueba es de tipo cualitativa y cuando es empleada en los sistemas
aviares se requiere usar cloruro de sodio al 8%.
Esta tcnica es de utilidad cuando queremos conocer si los animales se han infectado o
no. Cuando la prueba es positiva podemos estar seguros del resultado, sin embargo, un
resultado negativo no es confiable, puesto que los animales pueden haber estado
infectados hace tiempo y los sueros ya no precipitan, adems su principal desventaja es
su baja sensibilidad.
29

Es empleada en el diagnstico de Encefalomielitis aviar; con el virus de influenza es

utilizada para determinar antgeno de grupo, enfermedad de Marek, en el diagnstico de la
anemia infecciosa equina, leucosis bovina etc. Es una prueba sencilla y fcil de realizar,
adems otra de sus ventajas es que el antgeno no tiene necesariamente que estar
purificado, puede ser una preparacin relativamente cruda.
La tcnica se realiza sobre una placa petri o portaobjeto con una capa de agar en la cual
son realizadas perforaciones de aproximadamente 5 mm en dimetro y a una distancia de
1 cm. Uno de los pocillos es llenado con antgeno y otro con antisuero y los reactantes
difunden radialmente, formando un gradiente circular de concentracin para cada uno de
los reactantes. En la zona donde el gradiente se sobrelapa, se forma una lnea de
precipitacin blanca opaca.
Si la solucin usada contiene varios antgenos y anticuerpos diferentes, cada componente
alcanza la proporcin ptima de reaccin en posiciones distintas por lo que una lnea
separada de precipitado es producido por cada unin antgeno-anticuerpo presente.
Si las lneas de precipitacin son confluentes los dos antgenos son considerados
idnticos. Si las lneas se cruzan, los dos antgenos son diferentes, mientras que si las
lneas se unen con formacin de una punta existe una parcial identidad entre los antgenos
lo cual indica que uno de ellos posee epitopos que no estn presentes en el otro (Fig. 8 ).

Anti A

Anti A
Anti B
No identidad de antgenos

Completa identidad de antgenos

A+B

AB

Anti A
Anti B

Anti

Completa identidad y no identidad

cuando A y B son molculas diferentes.

Parcial identidad cuando los epitopos A y

B estn en la misma molcula

30

Fig. 8. Determinacin de las relaciones antignicas entre dos antgenos por

inmunodifusin.

3.3. Tcnicas inmunoenzimticas.

Los ensayos inmunoenzimticos se utilizan desde que en 1971 fuera descrito el marcaje
enzimtico efectivo. Por definicin son pruebas inmunolgicas que utilizan la reaccin
entre una enzima y su sustrato como sistema indicador para visualizar la reaccin
antgeno anticuerpo. Por regla general la enzima es conjugada al anticuerpo.
Estos ensayos han provisto de una metodologa altamente sensible y precisa para la
estimacin de parmetros biolgicos con la ventaja de poder manipular grandes nmeros
de muestras, las cuales pueden ser analizadas rpidamente; son muy verstiles y tienen
un amplio rango de aplicaciones en distintos campos biolgicos ejemplo: virologa,
bacteriologa, micologa, parasitologa, etc. y han desplazado a los radioinmunoensayos
debido a que son menos costosos, no dainos y tienen un potencial similar de
sensibilidad. Son los ensayos serolgicos ms utilizados para la determinacin de
anticuerpos tanto de forma cualitativa como cuantitativa.
Mltiples aplicaciones del mismo se han publicado con respecto a la deteccin de
antgenos y anticuerpos para la investigacin y otros fines por lo que han sido utilizados en
la investigacin y el diagnstico fundamentalmente de:
Deteccin y cuantificacin de agentes infecciosos de forma total o parcial por
ejemplo: la tipificacin.
Discriminacin de agentes infecciosos por ejemplo: la subtipificacin.
Cuantificacin total o parcial de un agente infeccioso ejemplo: estimacin de una
protena inmunognica en vacunas.
Identificacin de anticuerpos especficos por ejemplo: serodiagnstico para estudios
epizootiolgicos.
Cuantificacin de isotipos de anticuerpos especficos por ejemplo: en la
determinacin de la proporcin IgM/IgG.
La propiedad que tienen las protenas y los carbohidratos de adsorberse a diversos
polmeros (fase slida) ha sido ampliamente explotada en el desarrollo de la mayora de
los ensayos inmunoenzimticos descritos. Los ensayos inmunoenzimticos que utilizan el
plstico como fase slida son conocidos comnmente como ELISA. Otras fases slidas
31

como papel, nylon, poliestireno, etc. han sido utilizadas. Los ensayos que separan los
reactantes libres de los unidos o fijados al soporte o fase slida son llamados ensayos
heterogneos.
Existen varios tipos de ELISA (Fig. 9 ):
Directo
Indirecto
Sndwich
Competitivo
sustrato
E

Anticuerpo antipollo
marcado

sustrato
E

Muestra
(suero de pollo)

Anticuerpo marcado
Muestra
(virus)

Antgeno
A

B
sustrato
E

Anticuerpo antiratn
marcado
Monoclonal
Muestra (virus)
Anticuerpo de
conejo especfico
C

Fig. 9. Ensayos inmuno enzimticos (ELISA). Mtodo directo (A), Indirecto (B), Sndwich
(C).
De forma general todos los ELISA tienen los siguientes principios comunes:

Adsorcin del antgeno o anticuerpo a la fase slida (recubrimiento).

Separacin de los reactivos libres de los unidos (lavados).
Adicin de reactivos.
Incubacin de los reactivos (tiempo, temperatura, bloqueadores).
Adicin del reactivo marcado con la enzima (conjugado).
32

 Adicin del sistema de deteccin de la enzima (cromgeno).

Lectura visual o espectrofotomtrica del color.
En el diagnstico veterinario son utilizados para la determinacin de anticuerpos los ELISA
indirecto y competitivos y cada da es ms frecuente utilizar exclusivamente las protenas
de inters como antgeno adsorbido a la placa.
En la actualidad es uno de los mtodos ms usados para el diagnstico serolgico de
diferentes enfermedades de inters veterinario debido a su alta sensibilidad y
especificidad, a que permite realizar en un corto espacio de tiempo estudios sobre grandes
poblaciones de manera sencilla y econmica. Esta tcnica presenta adems una buena
reproducibilidad, repetibilidad y facilidad en la interpretacin de los resultados.
En la prctica diaria en nuestro laboratorio esta tcnica se ha utilizado entre otros trabajos:
-

Para la determinacin de la respuesta humoral al virus de la peste porcina clsica

(PPC) en cerditos provenientes de unidades con diferentes regmenes de
vacunacin.
En la determinacin de la inmunidad materna frente a la enfermedad de Gumboro
en pollitos progenies de reproductoras vacunadas.
En la determinacin de la respuesta a la vacunacin en aves vacunadas y en la
deteccin de la inmunidad materna en progenie de las mismas.

3.4. Inmunotransferencia o Western blot.

Esta tcnica combina la resolucin de la electroforesis en geles de poliacrilamida con la
especificidad de la deteccin inmunoqumica. Es un mtodo tanto altamente sensible
como especfico y es frecuentemente usado para verificar resultados positivos obtenidos
por ELISA as como para estudiar los patrones de respuesta frente a patgenos, protenas
inmunodominantes, etc.
Es una tcnica inmunoenzimtica que utiliza como soporte antignico filtros de
nitrocelulosa, donde las protenas son previamente transferidas, que mantienen total o
parcialmente sus propiedades antignicas.
Para la obtencin de los filtros antigenados, las protenas son separadas previamente por
electroforesis en geles de poliacrilamida y transferidas a continuacin mediante corriente
elctrica al filtro de nitrocelulosa, el cual es recortado en pequeas tiras, que constituirn
el soporte de tiras antigenadas sobre las que se desarrolla la reaccin inmunoqumica.
33

Puede ser usada para determinar la presencia y cantidad de un antgeno, el peso

molecular relativo de una cadena polipeptdica y la eficiencia de la extraccin de un
antgeno. Permite el anlisis de antgenos insolubles, difciles de marcar o fcilmente
degradables y los antgenos ms analizados por la misma son lisados de clulas
completas, preparados de tejidos de rganos, etc.
Es tambin una tcnica particularmente poderosa para determinar la presencia, cantidad y
especificidad de anticuerpos de diferentes muestras de un suero policlonal. Un aspecto
muy importante en esta tcnica que siempre debe tenerse presente es que si en la
electroforesis se aplican condiciones de desnaturalizacin slo podrn unirse anticuerpos
que reconozcan epitopos resistentes a la desnaturalizacin, es decir que los epitopos que
sean de tipo conformacional no reaccionaran con el antisuero debido a la prdida de su
estructura conformacional. Muchos sueros policlonales contienen anticuerpos de este tipo,
pero los anticuerpos monoclonales en su mayora no reaccionan con antgenos
desnaturalizados.
Para esta tcnica no se requieren anticuerpos de alta afinidad debido a la exposicin de
diferentes epitopos por la desnaturalizacin y a la alta concentracin local de antgenos
sobre la membrana. De ah que anticuerpos que no funcionan en tcnicas de
inmunoprecipitacin lo hagan adecuadamente en el inmunoblotting.

Electroforesis

El procedimiento del inmunoblotting puede ser dividido en seis pasos:

1. Preparacin de las muestras de antgeno
2. Resolucin de la muestra por electroforesis en gel de poliacrilamida.
3. Transferencia de los polipptidos separados a una membrana soporte.
4. Bloqueo de los sitios de unin no especficos de la membrana.
5. Adicin del anticuerpo.
6. Deteccin.

1. Separacin de
protenas

2. Transferencia de protenas

34

3. Deteccin

Fig. 10. Inmunoblotting para la deteccin de anticuerpos.

3.5. Inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa.

La inmunofluorescencia fue desarrollada despus de la II Guerra Mundial como un mtodo
rpido para la deteccin de antgeno in situ, como tejidos y clulas infectadas y es
considerada una prueba de unin primaria. Los avances de la inmunologa y la qumica
fueron decisivos en el desarrollo de esta tcnica, ya que protenas sricas pudieron ser
marcadas con colorantes por medio de uniones qumicas estables.
El principio de esta tcnica es el mismo que para otros procedimientos inmunolgicos que
incluyen reacciones antgeno-anticuerpo. En este caso las molculas de anticuerpo se
conjugan a los fluorocromos sin destruir su especificidad inmunolgica y cuando se ponen
en contacto con el antgeno homlogo se produce la reaccin. Al observar en el
microscopio de luz ultravioleta, el complejo emite un color fluorescente que depender del
fluorocromo empleado para conjugar los anticuerpos.
Los colorantes ms utilizados en la inmunofluorescencia son:
Los derivados de la fluorescena.
Isocianato de fluorescena (ICF).
Isotiocianato de fluorescena (ITCF)
Son los nicos empleados con xito como marcadores de protenas. Otros derivados
como la aminofluorescena diazotizada y los cloruros cidos de fluorescena no
producen conjugados ptimos. El ICF se emplea muy raramente debido a su
inestabilidad y a que su preparacin requiere condiciones especiales.
Derivados de la rodamina. Isocianato e isotiocianato.
Cloruro de 1dimetilaminonaftaleno 5 sulfnico (DANSC).
Otros colorantes. No han sido ampliamente aceptados por no estar disponibles
comercialmente y ofrecer un color pobre.
Para la realizacin de esta tcnica existen dos mtodos:
Directo: Los anticuerpos son conjugados con el isotiocianato de fluorescena
directamente. Es utilizado para la deteccin de antgenos y se realiza de forma
35

general de la siguiente manera: el conjugado es adicionado sobre el portaobjeto que

tiene la muestra de corte de tejido o frotis, es incubado, lavado y al realizar la lectura
en el microscopio se observa en las muestras positivas que los anticuerpos
especficos depositados sobre los antgenos aparecern con fluorescencia amarilloverdosa bajo la luz ultravioleta del microscopio (Fig. 11A).

Indirecto: Se utiliza una inmunoglobulina antiespecie conjugada con el isotiocianato

de fluorescena. Es usado para la deteccin de anticuerpos en muestras de suero y
se aade sobre el portaobjeto que contiene la muestra con el antgeno y el antisuero
problema, se incuba, se lava y se aade el conjugado. Posteriormente se lava y se
lee en el microscopio. La apariencia del antgeno teido por este mtodo es muy
semejante a la observada por el mtodo directo (fig. 11B).

F
F

Antgen

Anticuerpo
marcado
A
F

Antgeno fijado

Anticuerpo de
carnero anticonejo

Anticuerpo de
conejo anti-antgeno
B

Fig. 11. Inmunofluorescencia. (A) Directa, (B) Indirecta.

Ventajas.
1. Obteniendo los conjugados anti inmunoglobulinas de diferentes especies no es
necesario conjugar inmunoglobulinas especficas contra distintos antgenos.
2. Se aumenta la sensibilidad porque la capa intermedia de anticuerpos sin conjugar
multiplica el nmero de sitios a los cuales los marcadores fluorescentes pueden unirse.
36

Tiene la desventaja que requiere de un microscopio fluorescente para su lectura y de que

las preparaciones no deben de ser expuestas a la luz ultravioleta por mucho tiempo
porque pierden la fluorescencia.

Aplicaciones.
Sus aplicaciones principales han sido ampliamente explotadas en aspectos
microbiologa y patologa. Con frecuencia se dirigen sobre todo a aspectos de estudios
replicacin, patognesis y diagnstico. Numerosos ensayos sobre aplicaciones
bacteriologa, micologa, virologa y parasitologa han sido publicados. Tambin se
cubierto la patologa, enfermedades autoinmunes, enzimologa y neoplasmas.

de
de
en
ha

Ha sido muy empleada para detectar secuencias de formacin de antgenos, bsicamente

en estudios de replicacin viral. Sin embargo, los aspectos de diagnstico en virologa han
sido los ms espectaculares, detectando antgenos virales en muestras de animales
enfermos o identificando virus aislados de los mismos, por demostracin de anticuerpos
especficos contra ciertos virus ejemplo: diagnstico de la rabia.
En nuestro laboratorio actualmente es utilizada en el aislamiento de cepas del virus de la
PPC que no producen efecto citoptico en cultivo de tejidos. Tambin ha sido utilizada en
la identificacin de colonias de micoplasmas obtenidos de cultivos primarios.
Inmunoperoxidasa
Los anticuerpos unidos a la peroxidasa pueden ser utilizados para la deteccin de
antgenos especficos en cortes de tejidos. Muestras de clulas teidas con
inmunoperoxidasa son durables y pueden ser ledas en un microscopio ptico ordinario.
Una desventaja de esta tcnica es la presencia de peroxidasa endgena en las
secreciones y clulas inflamatorias de algunos mamferos, lo cual causa tinciones
inespecficas. Para eliminar las reacciones inespecficas debido a la peroxidasa endgena
las muestras son tratadas con perxido de hidrgeno previo a la realizacin de la tcnica.
Es realizada generalmente por el mtodo indirecto. Esta tcnica se ha empleado en
nuestro grupo de trabajo en el diagnstico de la enfermedad de Gumboro en cortes
criostticos de la bolsa de Fabricio.
En los ltimos aos se ha desarrollado una tcnica que combina la sensibilidad de la
neutralizacin con la deteccin de antgenos virales por inmunoperoxidasa. Esta tcnica
denominada neutralizacin de la peroxidasa (en ingls, Neutralization Peroxidase Linked
37

Assay, NPLA) ha sido empleada con xito en aquellos virus que no producen efecto
citoptico en cultivos celulares. En nuestro laboratorio ha sido utilizada para la
determinacin de ttulos de anticuerpos neutralizantes en clera porcino as como en la
demostracin y titulacin de esta entidad en cultivos celulares infectados.

3.6. Neutralizacin.
La tcnica de neutralizacin es la que demuestra la capacidad del anticuerpo para
neutralizar la actividad biolgica del antgeno cuando son mezclados in vitro. Esta prueba
puede ser usada para identificar toxinas bacterianas como la de Clostridium perfringens
que causa una zona blanca opaca alrededor de la colonia de este microorganismo cuando
crece en agar conteniendo suero o yema de huevo. El antisuero a esta toxina previene la
formacin de esta zona. Una prueba similar es usada para identificar la presencia de la
toxina de estafilococos por la inhibicin de su actividad hemoltica con el antisuero
especfico.
La infectividad de los virus sobre las clulas tambin es neutralizada despus de
mezclarlos con su antisuero especfico, el cual bloquea los sitios de unin a la clula. El
efecto puede ser producido por una sola molcula de anticuerpo de las clases IgG, IgM o
IgA.
La neutralizacin viral para medir de manera cuantitativa los anticuerpos en el suero es
utilizada frecuentemente en los laboratorios de investigacin y diagnstico virolgico. En
general esta prueba es la ms especfica de todas las reacciones virus anticuerpos y otros
tipos de pruebas serolgicas son evaluadas con relacin a esta y constituye el estndar de
oro para el diagnstico serolgico en la virologa.
El mecanismo de la virus neutralizacin requiere combinaciones de los anticuerpos con la
protena de la cubierta viral. Los anticuerpos pueden prevenir la adsorcin y penetracin
del virus probablemente, a travs, de un cambio en estructura conformacional de la
superficie viral o un bloqueo de receptores.
En el caso de los virus envueltos, el complemento puede aumentar la capacidad de
neutralizacin del anticuerpo. El mecanismo de este aumento puede variar, segn el virus,
en algunos casos rompe la cubierta lipoproteca y pierde la infectividad, en otros casos el
complemento puede aumentar los cambios estructurales en la cubierta inducidos por
anticuerpos. La IgA no fija el complemento y esta clase de anticuerpos no acta en
reacciones de neutralizacin dependiente del complemento.
38

La neutralizacin requiere del conocimiento previo de la infectividad del virus (ttulo) antes
de realizar la tcnica. La titulacin se realiza en cultivos de tejidos, huevos embrionados o
animales y se calculan las dosis infectivas medias. El principio de la misma consiste en
mezclar un virus infeccioso con su antisuero homlogo y posteriormente revelar mediante
la inoculacin de esta mezcla en cultivo de tejidos, en un animal susceptible o en huevos
embrionados si la infectividad del virus fue neutralizada. Si el virus es citopatognico no se
desarrollar efecto citoptico y si el animal es susceptible no se enfermar. Si el virus no
es citopatognico la demostracin de la neutralizacin de su infectividad slo puede ser
realizada de forma indirecta, por ejemplo, a travs, de la ausencia de inmunofluorescencia
en los cultivos inoculados con la mezcla virus-suero. La reaccin ocurre lentamente si se
realiza a 0C, si se efecta a 37C se produce con rapidez. En el caso del pH, se observa
el mejor efecto cuando es neutro.
Esta prueba puede realizarse de varias maneras, que varan en funcin de la duracin de
la incubacin de la mezcla virus-suero (1 hora a 37C o 24 horas a 4C) y de la presencia
o ausencia de complemento. La mayora de los laboratorios se inclinan por un perodo de
reaccin de 1 hora a 37C en ausencia de complemento, dada la sencillez y rapidez que
ofrece esta variante. Sin embargo, un perodo de incubacin de 24 horas a 4C facilita la
deteccin de niveles de anticuerpos entre 10 y 15 veces menores que los que pueden
detectarse tras una incubacin de slo 1 hora.
El complemento presente en las muestras de suero debe ser destruido por calor, mediante
la inmersin del suero en un bao de mara a 56C durante 30 minutos.
Existen dos mtodos fundamentales de realizacin de la tcnica:
Mtodo alfa (suero constante-virus variable). Muy utilizado en la identificacin de
antgenos con un antisuero conocido. En este mtodo se puede calcular el ndice de
neutralizacin de un suero.
Mtodo beta (suero variable-virus constante). Se utiliza en el diagnstico de la
respuesta de anticuerpos en sueros de animales inmunizados o enfermos. Se realiza
mezclando una cantidad constante de virus (100 Dosis infectivas) con diluciones
logartmicas de la muestra de suero (base 2 o base 10). El ttulo neutralizante del
suero ser el inverso de la ms alta dilucin que proteja a la clula de la infeccin
viral.
La deteccin de la reduccin de la actividad viral se valora de la siguiente manera (Fig.
12):
39

1.
2.
3.
4.
5.

Neutralizacin del efecto del virus en animales de laboratorio o embriones.

Inhibicin del efecto citoptico.
Inhibicin de las unidades formadores de placas (UFP).
Inmunofluorescencia (IF) o inmunoperoxidasa (IP).
Hemadsorcin.

La neutralizacin tiene un alto grado de sensibilidad y especificidad pero es una tcnica

que consume mucho tiempo y necesita de laboratorios de cultivos de tejidos. Es una
tcnica muy importante en el diagnstico serolgico de las enfermedades virales y en la
mayora de los casos existe una buena correlacin entre sus resultados y los niveles de
VIRUS
proteccin "in vivo".

INOCULACIN

CULTIVO CELULAR CON

EFECTO CITOPTICO

MORBILIDAD/MORTALIDAD
A

VIRUS

ANTICUERPOS
ESPECFICOS

NEUTRALIZACIN
VIRAL

INOCULACIN

NO EFECTO CITOPTICO

NO MORBILIDAD/MORTALIDAD
B

40

Fig. 12. Neutralizacin viral. Inoculacin del virus en cultivo celular y animal de laboratorio
(A). Adicin de anticuerpos especficos a la suspensin viral e inoculacin en cultivo
celular y animal de laboratorio (B).
3.7. Fijacin de complemento.
La disrupcin de membranas celulares por el complemento es posible cuando ste es
activado por la unin de un antgeno con un anticuerpo. Si el anticuerpo es unido a la
superficie de un eritrocito ocurre la hemlisis. Esta reaccin es usada para medir niveles
de anticuerpos en el suero, es una de las ms ampliamente utilizadas de todas las
tcnicas serolgicas y es comnmente usada en el diagnstico de enfermedades virales.
Se utiliz por primera vez en 1906 en el diagnstico de la sfilis y es tambin llamada
reaccin de Wasserman. Tambin se utiliza para la identificacin y titulacin de antgenos,
as como para caracterizarlos, compararlos (subtipificacin) y clasificarlos (relaciones y
parentescos serolgicos).
Tiene la desventaja de que es una prueba compleja, particularmente con respecto a la
estandarizacin y preparacin de los reactivos requeridos, los cuales deben ser
cuidadosamente chequeados antes de realizar la tcnica. La hemolisina debe ser
calentada a 56C durante 30 minutos para destruir su complemento. La adicin de la
cantidad adecuada de complemento es fundamental debido a que cantidades menores
provocan lisis incompleta mientras que cantidades excesivas de complemento pueden no
ser completamente fijados por el complejo inmune y dar resultados falsos negativos.
La adicin de cantidades superiores de antgeno interfiere con la fijacin de complemento,
mientras que cantidades mnimas de antgeno pudieran no fijar el complemento en
cantidades demostrables.
La fijacin de complemento puede ser realizada en dos versiones:
Utilizando un antgeno conocido para la deteccin de anticuerpos homlogos en el
suero.
Usando un antisuero conocido para determinar la presencia de antgeno en una
muestra, ejemplo: identificacin de subtipos de fiebre aftosa.
El ms utilizado es el primer procedimiento y ambos se realizan de forma general en dos
fases:
41

1ra. Fase: Diluciones crecientes de los sueros problemas (previamente inactivado a 56C
por 30 minutos) son aadidas a una cantidad de antgeno conocida. Una cantidad
determinada de complemento en forma de suero de curiel, es entonces adicionada. Si los
anticuerpos en el suero son homlogos al antgeno, se unen al mismo y se forma el
complejo antgeno--anticuerpo. Este complejo activa el complemento unindose al mismo
y por lo tanto es consumido. Si en el suero no hay anticuerpos el complemento permanece
libre y disponible para la fijacin en la segunda fase.
2da. Fase: Comienza con la adicin de un sistema hemoltico constituido por eritrocitos de
carnero y suero de conejo con anticuerpos contra los eritrocitos de carnero (hemolisina).
Los eritrocitos de carnero y la hemolisina forman el complejo antgeno-anticuerpo y el
complemento libre de la 1ra. Fase se une a este complejo y provoca la hemlisis. Si todo
el complemento fue fijado en la primera fase no ocurre hemlisis por lo tanto el sistema
hemoltico indica la presencia o ausencia de anticuerpos en el suero.
Ambas fases de la reaccin ocurren a 37C y todos los reactivos antes de ser utilizados
deben de ser titulados, chequeados y usados dentro de los valores lmites especficos.
A pesar de su engorrosa realizacin y a que detecta anticuerpos fundamentalmente de
tipo IgG es una tcnica sensible y especfica. En la actualidad es usada como tcnica de
referencia en el diagnstico de las enfermedades vesiculares, brucellosis, psitacosis, etc.

Ag

GR

Ac

GR

Ag

Ac

Ac

Ac

Fig. 12. Representacin esquemtica del principio de la prueba de fijacin de

complemento. El complemento (C), si es fijado por la unin antgeno (Ag)- anticuerpo (Ac),
no est disponible para lisar las clulas del sistema indicador, glbulos rojos, (Gr). En
42

ausencia de anticuerpo el complemento no es fijado y est disponible para lisar el sistema

indicador.

4.- Mtodos de diagnstico molecular.

Los procedimientos para el diagnstico molecular estn disponibles desde los aos 70
cuando por primera vez se usaron sondas de cido desoxirribonucleico (ADN) para
detectar cidos nucleicos virales. Los proponentes de estos nuevos mtodos de
diagnstico molecular pronosticaron un rpido reemplazamiento de las pruebas
tradicionales de deteccin de virus por los nuevos desarrollados. Sin embargo, a pesar de
este pronstico optimista estos procedimientos diagnsticos no fueron ampliamente
adoptados por los laboratorios de diagnstico clnico debido a que estas pruebas usan
sistemas de deteccin radioisotpica, son muy caros y ms laboriosos que los mtodos de
deteccin tradicionales.
Aunque algunas de estas tcnicas se estn utilizando solamente en laboratorios de
investigaciones, muchas han sido simplificadas y se usan de manera rutinaria en los
laboratorios de diagnstico, y se consideran entre las ms utilizadas, las tcnicas de
hibridacin molecular y la reaccin en cadena de la polimerasa (RCP). El ensayo de
anlisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin se usa
frecuentemente junto con la RCP para obtener informacin adicional sobre la cepa o tipo
de agente infeccioso y los estudios de epidemiologa molecular.
Para apreciar el potencial de las pruebas de diagnstico molecular es necesario tener un
entendimiento bsico de la bioqumica de los cidos nucleicos (AN).
Los AN son clasificados como cido desoxirribonucleico (ADN) y cido ribonucleico (ARN)
y constan de cuatro bases conocidas como Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) y
Timidina (T) o Uracilo (U) en el caso del ARN. Las cuatro estn unidas entre s para formar
una larga cadena y la secuencia de las bases vara y es nica para cada organismo
identificado. La identificacin de la exclusividad es la base de la mayora de las pruebas de
diagnstico moleculares. Los AN pueden ser de simple o doble cadena de bases. Las
cadenas dobles se forman por la unin especfica de las bases porque A siempre se une a
T (o U) y G siempre se une a C por lo que la secuencia de la segunda cadena podra ser
predecida por la secuencia de la primera cadena.
43

4.1. Hibridizacin molecular.

La hibridizacin es la unin de dos AN de cadena sencilla por medio de puentes de
hidrgeno para formar una molcula de doble cadena.
Si una de las cadenas sencillas de los AN contiene una secuencia conocida y est
marcada para ser identificada, esta va a encontrar su secuencia de bases
complementaria, se hibridizar con la misma.
Este AN marcado es conocido comnmente como sonda y su presencia indica la
presencia de la secuencia complementaria conocida como blanco, que es desconocida,
puede ser ARN o ADN y de doble o simple cadena. Si la molcula blanco es de doble
cadena debe ser desnaturalizada, por calor o mtodos qumicos, en la forma de cadena
sencilla para que las bases estn disponibles para la sonda.
La hibridizacin puede realizarse despus de la inmovilizacin de la molcula blanco en un
soporte slido o en solucin. La hibridizacin utilizando AN inmovilizado es usualmente
ms fcil y ms prctica para ensayos de diagnstico.
Las formas ms comunes de hibridizacin son:

Hibridizaciones puntuales (dot blot hybridization).

Hibridizacin northern blot (para virus ARN).
Hibridizacin southern blot (para virus ADN).
Hibridizacin in situ.

Las hibridizaciones puntuales slo detectan la presencia o ausencia del AN en la muestra.

Las hibridaciones northern o southern sirven para obtener informacin acerca de los
tamaos de los fragmentos genmicos, ya que estas pruebas utilizan electroforesis la cual
separa las molculas del genoma de acuerdo a su tamao. Despus de colocar los
fragmentos genmicos en un soporte slido se utilizan las sondas para detectar su
presencia.
La hibridizacin in situ se utiliza como una herramienta de diagnstico para detectar la
presencia de un virus en algn tejido especfico. En muchos casos el tipo de clula
infectada puede ser determinada y los investigadores pueden seguir el curso de la
enfermedad a nivel celular.
4.2. Sondas de cidos nucleicos.
44

Las sondas de AN usadas solas pueden no ser muy sensibles pero el uso de los
procedimientos de hibridizacin cuando se combinan con la RCP proveen una poderosa
herramienta en el diagnstico de enfermedades bacterianas, virales y parasitarias por el
uso de secuencias de ADN altamente conservadas. Las sondas de ADN poseen una
especificidad extraordinaria ejemplo: Anaplasma marginale fue detectado incluso en
garrapatas vectores empleando sondas de ADN; Babesia equi fue identificada en glbulos
rojos de caballos experimentalmente infectados.
Para hacer una sonda el AN tiene que ser separado en dos cadenas y marcado con
istopos radioactivos, usualmente fsforo 32 (P32), el cual es revelado por exposicin a
rayos X. La muestra es positiva para el patgeno si el marcador es detectado. Aunque las
sondas radioactivas son muy sensibles ellas tienen desventajas porque el tiempo de vida
media de los istopos es corto y son perjudiciales para el operador.
Para facilitar el uso prctico de las sondas de ADN, los marcadores radioactivos son
reemplazados con marcadores sensibles, de larga vida media no radioactivos como la
biotina, la peroxidasa, la digoxigenina y la citisina sulfonada.
La molcula de biotina se detecta mediante un conjugado que contiene estreptoavidina
unida a la fosfatasa alcalina o a la peroxidasa las cuales en presencia de su sustrato
desarrollan color de forma similar a una prueba ELISA. Tambin la estreptoavidina puede
ser conjugada con fluorescena. Esta combinacin sufre de interferencia si la muestra que
se est analizando contiene biotina endgena. La digoxigenina y la citosina sulfonada se
detectan utilizando un anticuerpo monoclonal conjugado a enzimas (fosfatasa alcalina o
peroxidasa) o a la fluorescena.
La peroxidasa se detecta directamente utilizando quimio-luminiscencia. La luminiscencia
qumica es una de las nuevas tcnicas de deteccin no radiactiva y se revela usando
rayos X o tomando una fotografa en una pelcula Polaroide por la emisin de un fotn de
luz cuando la enzima se pone en contacto con su sustrato.
4.3. Reaccin en cadena de la polimerasa (RCP).
El procedimiento de la RCP es usado para amplificar repetidas veces fragmentos de un
AN. La prueba es especfica porque pequeos fragmentos de AN llamados cebadores
(primers), complementarios a ciertas regiones del AN que se quiere amplificar, se
requieren para comenzar la reaccin en cadena.
45

La amplificacin del ADN por la RCP es acompaada por una sucesin de pasos de
incubacin a diferentes temperaturas. El proceso de desnaturalizacin, alineacin de los
iniciadores y sntesis de la nueva molcula de ADN se considera un ciclo de prueba que
son repetidos entre 20 y 40 veces. Con los virus ARN previo a la RCP tiene que ser
sintetizada una copia de ADN complementario mediante la enzima reverso transcriptasa.
La identificacin del producto de la RCP debe ser confirmado por el uso de sondas de
ADN o por el anlisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin
(RFLP).
El producto de la RCP tambin puede ser secuenciado para la ulterior caracterizacin del
genoma. Un procedimiento alternativo es usar un segundo set de iniciadores para
amplificar un subfragmento del producto de la RCP de la primera reaccin. Esto
incrementa la especificidad del procedimiento.
La RCP juega un papel importante en la deteccin de contaminantes porque es un
procedimiento altamente sensible para detectar agentes infecciosos en el hospedero aun
cuando solo un pequeo nmero de clulas estn infectadas. Esta no diferencia entre
organismos viables o no y puede amplificar una secuencia de genes integrada o no al
genoma de la clula hospedero. Adems ha demostrado su utilidad en el diagnstico de
infecciones crnicas-persistentes como las causadas por retrovirus ejemplo virus de la
leucosis bovina y las infecciones latentes causadas por herpesvirus ejemplo el virus de la
rinotraquetis infecciosa bovina y el virus de la enfermedad de Aujeszky`s. Estas
enfermedades presentan serios problemas en el diagnstico y la prevencin debido a que
los animales infectados frecuentemente no presentan signos clnicos hasta estados
avanzados de la enfermedad constituyendo reservorios y una fuente potencial para la
diseminacin del agente.
Cuando es usada para el diagnstico se requiere de gran cuidado para evitar la
contaminacin de las muestras debido a la alta sensibilidad de la tcnica que puede dar
resultados falsos positivos. Para solucionar estos problemas han sido desarrollados
sistemas en forma de juegos disponibles comercialmente que usan una reaccin
enzimtica para degradar especficamente los productos de la amplificacin de la RCP sin
degradacin del AN nativo.
De forma general, hasta aqu hemos visto el fundamento y las aplicaciones de las
tcnicas convencionales y de avanzada que son empleadas en el diagnstico serolgico
de las enfermedades infecciosas que afectan a los animales. A continuacin les
mostramos una tabla resumen con las diferentes tcnicas y su objetivo de aplicacin en el
diagnstico.
46

Tabla 6. Objetivos de aplicacin y caractersticas de los mtodos de diagnstico

Objetivo

Mtodo

Muestra/Resultado

Caractersticas
Rpida, sensible y especfica.

Suero/ Las muestras

Ampliamente usada para

evaluadas para la

estudios epidemiolgicos

Deteccin de

Inhibicin de la

presencia de anticuerpos

retrospectivos y propsitos

anticuerpos

hemoaglutinacin

especficos indican una

regulatorios. Muy utilizada en

infeccin reciente o

el diagnstico de

pasada.

enfermedades virales aviares y

de mamferos.

Suero/ Las muestras

evaluadas para la
Inmunodifusin

presencia de anticuerpos
especficos indican una

Rpida, pero poco sensible.

infeccin reciente o
pasada.
Suero/ Las muestras

Rpido, sensible y especfico.

evaluadas para la

Frecuentemente utilizada para

Ensayos

presencia de anticuerpos

el diagnstico retrospectivo con

inmunoenzimticos

especficos indican una

propsitos clnicos y

infeccin reciente o

epidemiolgicos.

pasada.

Inmunoblotting

Suero/ Las muestras

Lento, costoso y requiere de

evaluadas para la

personal tcnico. Es otras de

presencia de anticuerpos

las tcnicas considerada como

especficos indican una

estndar de oro debido a que

infeccin reciente o

identifica anticuerpos a

pasada.

protenas virales especficas.

47

Suero/ Las muestras

Inmunofluorescencia
e Inmunoperoxidasa
indirecta

evaluadas para la
presencia de anticuerpos
especficos indican una

Rpida y sensible.

infeccin reciente o
pasada.
Suero/ Las muestras
evaluadas para la

Neutralizacin viral

presencia de anticuerpos
especficos indican una
infeccin reciente o
pasada.

Fijacin de

Suero/ Las muestras

complemento

evaluadas para la
presencia de anticuerpos
especficos indican una
infeccin reciente o
pasada.

Lenta y costosa. Requiere de

personal tcnico y de cultivo de
tejidos. Es el estndar de oro
de la serologa debido a que
los anticuerpos neutralizantes
correlacionan bien con la
proteccin inmune.
Sensible y especfica pero su
realizacin es laboriosa y
requiere de una cuidadosa
estandarizacin de los
reactivos.

Secreciones, excreciones,
clulas, tejidos/

Deteccin e
identificacin

Aglutinacin en ltex

de antgeno

Identificacin del antgeno

por reaccin con el
antisuero de especificidad

Simple, pero poco sensible y

sujeto a reacciones no
especficas.

conocida
Extractos celulares,
Inhibicin de la
hemoaglutinacin

secreciones, excreciones /
Identificacin del antgeno

Rpida, sensible y especfica.

por reaccin con el

antisuero conocido
Extractos celulares,
secreciones, excreciones/

Inmunodifusin

Identificacin del antgeno

por reaccin con el
antisuero conocido

48

Muy simple, poco sensible

Extractos celulares,
Ensayos
inmunoenzimticos

secreciones, excreciones/

Rpido, sensible y especfico.

Identificacin del antgeno

El ms utilizado es el mtodo

por reaccin con el

captura de antgeno de

antisuero conocido
Tejidos, clulas,
Inmunofluorescencia

secreciones, excreciones/

Rpido, sensible y especfico.

e Inmunoperoxidasa

Identificacin del antgeno

Localizacin del antgeno en

directa

in situ por reaccin con el

clulas especficas.

antisuero conocido
Tejidos, clulas,
Neutralizacin

secreciones, excreciones/

Lenta, sensible y especfica.

Identificacin del antgeno

Requiere de personal

in situ por reaccin con el

especializado

antisuero conocido

Deteccin

Hibridizacin

directa e

Rpida y simple de montar,

secreciones, excreciones/

muy sensible y especfica.

Identificacin del cido

Daina para el operador por el

nucleico por reaccin con

marcaje radioactivo.

una sonda especfica.

identificacin
de cidos
nucleicos

Tejidos, clulas,

Reaccin en cadena
de la polimerasa

Tejidos, clulas,

Es ampliamente utilizado

secreciones, excreciones/

debido a su alta sensibilidad y

El cido nucleico es

especificidad pero est sujeto a

amplificado e identificado

contaminaciones.

por diferentes mtodos.

En la red de laboratorios veterinarios de nuestro pas, la mayora de estas pruebas son

utilizadas en el diagnstico aunque no siempre son empleadas las recomendadas en el
manual de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE). A continuacin en la tabla
mostramos las tcnicas utilizadas en el diagnstico de algunas enfermedades, en las
especies animales de mayor inters econmico para nuestro pas as como las
recomendadas por la OIE.
Tabla 7. Principales tcnicas utilizadas en el diagnstico de enfermedades de importancia
veterinaria.
ENFERMEDADES QUE AFECTAN A LAS AVES
PRUEBA

METODO

49

CUBA

RECOMENDADA

ALTERNATIVO

POR LA OIE
Bronquitis infecciosa

VN, HI, ELISA

ELISA

AGD

VN, ELISA

ELISA

AGD, ELISA

HI, ELISA

Influenza tipo A

AGD, HI

HI, ELISA

Encefalomielitis aviar

ELISA, AGD

ELISA

Viruela aviar

AGD

AGD, VN, ELISA

AGD

AGD

ELISA

aviar
Enfermedad de
Gumboro
Reovirus
Enfermedad de
Newcastle

Laringotraqueitis
infecciosa
Enfermedad de
Marek
Leucosis aviar
Clera aviar

Cultivo e
-

identificacin del
agente

Coriza aviar

Cultivo e
-

identificacin del
agente

Salmonelosis aviar

Cultivo e
-

SAR

identificacin del
agente

Mycoplasma
gallisepticum

Aglutinacin, HI

HI, HAN, IP

ENFERMEDADES QUE AFECTAN A LOS CERDOS

Peste Porcina
Clsica
Peste Porcina
Africana
Enfermedad de
Aujeszkys
Salmonelosis

NPLA, IF, ELISA, RT-

NPLA, FAVN, ELISA

ELISA

IF

IF

ELISA, VN

VN, ELISA

50

PCR

Cultivo e
identificacin del

agente
Disentera porcina

IF

Leptospirosis

MAT

Seroaglutinacin

Brucelosis porcina

BBAT

R. Bengala, CF
Cultivo e

Erisipela porcina

identificacin del
agente
ENFERMEDADES QUE AFECTAN AL BOVINO

IBR/IPV

VN, ELISA,IP

Blue tongue

AGD, ELISA

VN

AGD

Leucosis bovina

AGD, ELISA, HAN,

enzotica

Actividad RT

Rabia

Brucelosis bovina

BBAT, CF, ELISA

Antrax (Carbunco
sintomtico)

Identificacin agente,

IF

FAVN
-

ELISA, R.Bengala,
CF, SAL
Cultivo e

identificacin del
agente,IF

Pasterellosis

Cultivo e

(Septicemia

identificacin del

hemorrgica)

agente

Tuberculosis bovina

Identificacin del

Prueba de la

tuberculina

tuberculina
Cultivo e

Identificacin del

Trichomonas

Aglutinacin

agente

Anaplasmosis bovina

Babesiosis bovina

agente, Prueba de la

identificacin del
agente

CF, Aglutinacin en

Aglutinacin en

tarjeta

tarjeta, Frotis

ELISA, IF

IF, IP, ELISA, Frotis

ENFERMEDADES QUE AFECTAN A LOS EQUINOS

Anemia infecciosa
equina
Rinoneumonitis
equina

AGD

AGD

VN

VN

51

Influenza

HI

HI

Leyenda
VN - Virusneutralizacin

RT-PCR - Reverso transcriptasa asociada

IF- Inmunofluorescencia

a la reaccin en cadena de la polimerasa

NPLA - Neutralizacin de la peroxidasa

ELISA

Ensayos

inmunoenzimticos

AGD - Agar gel difusin

FAVN - Neutralizacin de la fluorescencia

SAL - Seroaglutinacin lenta

HI - Inhibicin de la hemoaglutinacin

IP- Inmunoperoxidasa

MAT- Prueba de microaglutinacin

SAR- Seroaglutinacin rpida

HAN - Hibridacin de cidos nucleicos

BBAT- Antgeno bufereado de brucella

RT - Actividad reverso transcriptasa

CF- Fijacin de complemento

No quisiramos terminar este trabajo sin antes citar un ejemplo de la utilizacin de

forma combinada de algunas de estas tcnicas en el diagnstico de algunas
enfermedades, por ejemplo:
La Peste porcina clsica (PPC) es ocasionada por un virus de la familia
Flaviviridae gnero Pestivirus, es una de las enfermedades rojas del cerdo
reportada en la lista A de la OIE que transcurre con un curso clnico agudo con
mortalidad cercana al 100%. Nuestro pas, recientemente estuvo afectado por
una epizootia y durante el programa de control y lucha se estableci un
algoritmo para el diagnstico de la enfermedad, realizando los siguientes pasos
ante la sospecha de la PPC.
1. Realizar Inmunofluorescencia directa (IFD) o inmunoperoxidasa directa (IPD) en
cortes por congelacin de muestras de rganos para la deteccin de antgenos
de pestivirus in situ.
2. Si es negativo por IFD-IPD debe realizarse el ensayo RT-PCR. Adems si se
considera necesario debe realizarse el diagnstico diferencial de Peste Porcina
Africana (PPA) cuyo cuadro clnico y lesional resulta indistinguible de PPC.
3. Si se obtiene un resultado positivo frente a pestivirus por IFD-IPD y se requiere
un diagnstico diferencial debe realizarse a travs del ensayo RT-PCR a partir
de extractos de rganos.
4. Si se mantiene el resultado negativo por RT-PCR, se debe de intentar el
aislamiento del virus en cultivos celulares para su deteccin por
inmunofluorescencia indirecta.
52

5. Si se obtiene el aislamiento del virus y es necesario el diagnstico diferencial de

pestivirus, se debe de realizar a travs del ensayo RT-PCR.
6. Se requieren tres pases por cultivos celulares para informar un resultado
negativo.

5.- BIBLIOGRAFIA.
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