Introduo

A doena de Chagas, descrita em 1909, uma parasitose causada pelo protozorio Trypanosoma cruzi (T.
cruzi). Esse parasita transmitido ao homem por um inseto conhecido popularmente pelos nomes de barbeiro,
chupo, procot, e outros.
O sanitarista brasileiro Carlos Justiniano Chagas descreveu sozinho, fato indito na histria da medicina, o
ciclo completo da doena. Ele identificou o parasita, o transmissor, o reservatrio animal dos parasitas e as manifestaes clnicas da doena que levou o seu nome. Chagas denominou o parasita de T. cruzi, em homenagem a
Oswaldo Cruz.
Alm da transmitida pelo barbeiro, a infeco pelo T. cruzi trasmitida tambm por via sangnea.
A doena freqente na Amrica Central e na Amrica do Sul. No Brasil, a ocorrncia dessa enfermidade,
que acomete cerca de trs milhes de brasileiros, particulamente elevada em alguns estados como Minas Gerais,
Gois, Rio Grande do Sul, Bahia e Piau.
Recentemente casos de doenas de Chagas tm sido descritos em outros pases no endmicos, como Espanha e Estados Unidos. Nesses pases a transmisso est sendo realizada por transfuso sangunea, transplante de
rgos ou transmisso vertical.
O primeiro teste utilizado para deteco da infeco pelo T. cruzi foi a reao de Fixao do Complemento,
desenvolvida por Guerreiro e Machado, em 1913. Hoje, esse teste apresenta apenas valor histrico, em razo da
existncia de testes sorolgicos mais simples e mais precisos.
A utilizao rotineira dos testes sorolgicos em unidades hemoterpicas tem contribudo, de forma decisiva,
para reduo do nmero de casos ps-transfusionais da infeco pelo T. cruzi.
Neste manual esto apresentados os testes recomendados, tanto em unidades hemoterpicas, para triagem
sorolgica de doadores de sangue, quanto em laboratrios de sade pblica, para diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi, atendendo a critrios tcnicos, de controle de qualidade e de biossegurana.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

A doena de Chagas e os mtodos de diagnstico

Qual o agente causador da doena de Chagas?

Como voc j sabe, o Trypanosoma cruzi o parasita causador da doena de Chagas. Esse parasita transmitido
aos mamferos (homens e animais) por insetos hematfagos como o Triatoma infestans, popularmente chamado barbeiro.

Ateno
Inseto hematfago: inseto que se alimenta de sangue.
Em condies naturais, o barbeiro ingere formas sanguneas do T. cruzi ao se alimentar em um hospedeiro infectado. Essas formas sangneas diferenciam-se e multiplicam-se no trato digestivo do inseto, dando origem aos tripomastigotas metacclicos que so eliminados nas fezes do barbeiro. Como o inseto tem o hbito de defecar no momento
da picada, as fezes contendo os parasitas infectam os seres humanos por meio de leses na pele, pelo orifcio da picada
ou pelas mucosas. Na figura 1, voc pode ver o barbeiro e uma forma sangunea do T. cruzi.

Figura 1 Triatoma infestans e forma sangunea do T. cruzi.

Quais as principais formas de contaminao pelo T. cruzi?

O T. cruzi transmitido por:
- transfuses com sangue contaminado;
- transplantes de rgos e tecidos.
- de me para filho (transmisso vertical);
- infeco acidental em laboratrio;
- via oral, pela ingesto de alimentos contaminados pelo T. cruzi.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Quais os testes utilizados para o diagnstico laboratorial da infeco

pelo T. cruzi?
Para o diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi so utilizados os seguintes testes:
parasitolgicos diretos (exame a fresco do sangue, tcnicas de concentrao do parasita, etc.). Esses testes
so indicados na fase aguda da doena, quando a parasitemia elevada;
sorolgicos, so testes imunolgicos que detectam, no soro, antgenos ou anticorpos em vrios tipos de infeco.
Esses testes so utilizados para deteco da infeco pelo T. cruzi na fase crnica da doena.
Antgeno - Ag - qualquer substncia que o organismo identifica como estranha e que induz produo
de protenas especficas

Ateno
Anticorpo - Ac - tambm chamado imunoglobulina (Ig), uma protena
produzida pelo sistema imune em resposta a um determinado antgeno.
O anticorpo se liga de maneira especfica ao antgeno.
A ligao especfica entre o antgeno e o anticorpo constitui a base dos testes sorolgicos.
No caso da doena de Chagas, esses testes baseiam-se na identificao de anticorpos anti-T. cruzi da classe
IgG, predominantes na fase crnica da doena.
H laboratrios que, alm dos testes sorolgicos, utilizam, na fase crnica, reaes de amplificao dos cidos
nucleicos do parasita.

Ateno
Amplificao de cido nucleico - seqncia de reaes que promove o
aumento de cpias de uma molcula de DNA ou RNA.

Essas reaes so utilizadas em laboratrios de pesquisa, mas ainda no esto disponveis para a rede de
laboratrios. Por isso, a partir daqui, sero enfocados os testes sorolgicos que so rotineiramente empregados na
deteco da infeco pelo T. cruzi.

Quais os testes sorolgicos mais utilizados para a deteco da infeco pelo T.

cruzi?
Devido sua elevada sensibilidade e especificidade, os testes sorolgicos mais utilizados para a deteco da
infeco pelo T. cruzi so:
1. Hemaglutinao Indireta (HAI);
2. Imunofluorescncia Indireta (IFI);
3. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado.

A especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado negativo quando o indivduo no est
infectado.

Outros testes sorolgicos so comercializados no Brasil, como por exemplo testes rpidos e western blot.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Como diagnosticar a infeco pelo T. cruzi

Quais os testes utilizados para o diagnstico laboratorial da infeco

pelo T. cruzi?
Para o diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi so utilizados os seguintes testes:
parasitolgicos diretos (exame a fresco do sangue, tcnicas de concentrao do parasita, etc.). Esses
testes so indicados na fase aguda da doena, quando a parasitemia elevada;
sorolgicos, so testes imunolgicos que detectam, no soro, antgenos ou anticorpos em vrios tipos de infeco. Esses testes so utilizados para deteco da infeco pelo T. cruzi na fase crnica da doena.
Antgeno-Ag - qualquer substncia que o organismo identifica como estranha e que induz produo
de protenas especficas (anticorpos) pelo sistema imune.

Lembre-se
Anticorpo - Ac - tambm chamado imunoglobulina (Ig), uma protena
produzida pelo sistema imune em resposta a um determinado antgeno.
O anticorpo se liga de maneira especfica ao antgeno.
A ligao especfica entre o antgeno e o anticorpo constitui a base dos testes sorolgicos.
No caso da doena de Chagas, esses testes baseiam-se na identificao de anticorpos anti-T. cruzi da classe
IgG, predominantes na fase crnica da doena.

H laboratrios que, alm dos testes sorolgicos, utilizam, na fase crnica, reaes de amplificao dos
cidos nucleicos do parasita.

Amplificao de cido nucleico - seqncia de reaes que promove o aumento de cpias de uma molcula de DNA ou RNA.

Essas reaes so utilizadas em laboratrios de pesquisa, mas ainda no esto disponveis para a rede de
laboratrios. Por isso, a partir daqui, sero enfocados os testes sorolgicos que so rotineiramente empregados na
deteco da infeco pelo T. cruzi.

Quais os testes sorolgicos mais utilizados para a deteco da infeco pelo T.

cruzi?
Devido sua elevada sensibilidade e especificidade, os testes sorolgicos mais utilizados para a deteco da infeco pelo T. cruzi so:
1. Hemaglutinao Indireta (HAI);
2. Imunofluorescncia Indireta (IFI);
3. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).

Lembre-se
A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado. A
especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado
negativo quando o indivduo no est infectado.

Outros testes sorolgicos so comercializados no Brasil, como por exemplo testes rpidos e western blot.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Diagnstico em Laboratrios de
sade pblica
Como registrar a entrada das amostras em laboratrios de sade pblica?
voc:

O registro pode ser feito por um sistema manual ou informatizado. De qualquer modo, importante que
1. Verifique se a identificao no rtulo da amostra a mesma da solicitao do(s) teste(s):
2. Copie da solicitao e registre numa planilha de resultados os seguintes itens bsicos:
nmero de registro da amostra;
nome;
procedncia da amostra (unidade que solicitou);
data da coleta;
sexo;
idade;

Lembre-se
Os dados devem sempre ser conferidos por duas pessoas.
Erros de identificao podem levar troca de resultados.

preciso distribuir em alquotas as amostras para anlises nos laboratrios de

sade pblica?
Nos laboratrios de sade pblica no existe a obrigatoriedade da alquota para contraprova. No entanto,
recomenda-se que a amostra seja distribuda, no mnimo, em duas alquotas:
Uma para realizar os testes solicitados;
Outra para atender necessidades relacionadas, por exemplo, execuo de testes complementares.

Lembre-se
Para acondicionar e armazenar as amostras, utilize os mesmos
procedimentos j apresentados para amostras de triagem sorolgica.

Como feito o diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi em laboratrios

de sade pblica?
Veja, na Figura 1 o fluxograma para o diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi em laboratrios de
sade pblica.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Figura 1 - Fluxograma para diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi

que:

Para a compreenso do fluxograma do diagnstico sorolgico da infeco pelo T. cruzi, importante observar
No teste 1 e 2:
a amostra deve ser testada em dois testes (1 e 2) de princpios metodolgicos diferentes, escolhidos de
acordo com a disponibilidade do servio: ELISA e HAI, ELISA e IFI ou HAI e IFI. Recomenda-se o ELISA como
uma das escolhas, sempre que possvel;
a amostra no reagente nos dois testes tem o seu resultado definido como amostra negativa para a infeco pelo T. cruzi;
a amostra reagente, indeterminada ou com resultados discordantes deve ser retestada pela repetio dos Testes 1 e 2, sendo que:
para o ELISA deve ser feita repetio em duplicata e com o mesmo conjunto diagnstico;
para o HAI deve ser feita a titulao (teste quantitativo) com o mesmo conjunto diagnstico utilizado

na HAI qualitativa;

para o IFI deve ser feita a titulao (teste quantitativo) com os mesmos reagentes utilizados na IFI quali-

tativa.

Na retestagem:
a amostra no reagente nos dois testes tem o seu resultado definido como amostra negativa para a infeco pelo T. cruzi;

Ateno
Em caso de amostras reagentes na testagem inicial (Teste 1 e Teste
2) e no reagentes na retestagem no libere nenhum dos resultados
obtidos com as outras amostras testadas no mesmo protocolo. Isto
porque possvel que tenha havido erro de transcrio no protocolo
ou troca de amostras. Se o protocolo estiver correto, faa novamente
o teste de todas as amostras seguindo o fluxograma.
A amostra reagente nos dois testes tem seu resultado definido como amostra positiva para infeco pelo
T. cruzi;
A amostra indeterminada ou com resultados discordantes deve ser encaminhada a um laboratrio de
referncia.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Infeco pelo T. cruzi

Triagem sorolgica de doadores de sangue em unidades hemoterpicas
Que tipo de amostra deve ser utilizada?
O soro ou plasma so as amostras mais indicadas para deteco de anticorpos anti-T. cruzi.
As amostras no podem estar turvas, lipmicas ou hemolisados. Em qualquer desses casos elas devem ser
descartadas e novas amostras devem ser solicitadas.

Ateno
A experincia de alguns pesquisadores tem demonstrado que quando se utiliza plasma nos testes sorolgicos, ele deve ser centrifugado
para separar e retirar fibrina.
A testagem do plasma contendo fibrina pode levar a resultados tanto
falso-positivos quanto falso-negativos.

Como registrar a entrada das amostras para a triagem sorolgica de doadores

de sangue?

As informaes contidas nos rtulos e etiquetas devem ser legveis, impressas ou escritas mo com tinta
indelvel, atxica e prova d'gua.

obrigatrio o controle de rotulagem de cada unidade por duas pessoas diferentes. Deve, obrigatoriamente, ser utilizado a tecnologia de cdigos de barras.

Os laboratrios de triagem sorolgica devem trabalhar com tubos primrios, colhidos diretamentedo doador de sangue, at a fase de pipetagem da amostra nas placas ou tubos das estantes para realizao das reaes
(RDC n 153 /ANVISA/2004).

Em quantas alquotas devem ser distribudas as amostras, antes dos testes,

para a triagem sorolgica de doadores de sangue?
Antes da testagem, as amostras de soro ou plasma devem, obrigatoriamente, ser distribudas em, no mnimo,
duas alquotas:
Uma para os testes de rotina; e
Outra para a contraprova.
Recomenda-se que a alquota de contraprova tenha um volume de aproximadamente 1 mL.
A alquota da contraprova deve ficar armazenada em temperatura igual ou inferior a -20C durante
pelo menos 6 meses aps a doao.
A distribuio em um nmero maior de alquotas e o volume das mesmas fica a critrio de cada servio.

Como acondicionar e conservar as alquotas, antes de fazer os testes para a

triagem sorolgica de doadores de sangue?

Caso a triagem sorolgica no possa ser executada no momento do seu recebimento os tubos primrios, os

mesmos podem ser conservados em geladeira, entre 4 C +/- 2 C por 48 horas.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

 Distribua em frascos prprios para congelamento a alquota da contraprova e demais alquotas a serem
congeladas;
Acondicione esses frascos em caixas de papelo ou plstico rgido, identificadas com informaes que
facilitem a localizao dessas alquotas.

Como feita a triagem sorolgica de doadores de sangue para doena de Chagas?

Veja o fluxograma recomendado para realizao dessa triagem.

Ateno

Nas unidades hemoterpicas, a triagem sorolgica de doadores
de sangue obrigatria e visa proteo do receptor e no o diagnstico da doena de chagas.

Mais informaes sobre triagem sorolgica em unidades hemoterpicas, consulte a RDC n153/ANVISA/2004).

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Para compreenso deste fluxograma, importante observar que:

O teste a ser utilizado deve ser imunoenzimtico (ELISA) seguindo recomendaes da Organizao Mundial
da Sade (OMS) no ano de 2000, que tambm recomenda o controle de qualidade externo para permitir que apenas os servios de hemoterapia possam utilizar um teste nico. Esta recomendao foi adotada pelo Ministrio da
Sade, por meio da RESOLUO-RDC N 153, DE 14 DE JUNHO DE 2004.
Na Testagem:
A amostra reagente tem seu resultado definitivo como amostra reagente para infeco pelo T. cruzi:
A amostra no reagente tem seu resultado definido com a amostra amostra no reagente para infeco
pelo T. cruzi;
A amostra indeterminada com resultados na regio cinza* definida pelo fabricante;
Amostras reagentes ou indeterminadas devem ser retestadas com o mesmo conjunto diagnstico, agora
em duplicata;
Na retestagem:
A amostra reagente nas duas duplicatas tem seu resultado definido como amostra reagente para a infeco pelo T. cruzi;
A amostra no reagente em ambas as dulpicatas tem seu resultado definido como amostra negativa
para a infeco pelo T. cruzi;
A amostra indeterminada (duplicatas com resultados na regio cinza) ou com resultados discordantes (uma
duplicata positiva e outra negativa) definida como amostra indeterminada para a infeco pelo T. cruzi;
A definio do resultado de cada amostra, testada de acordo com este fluxograma, deve obedecer aos
critrios apresentados no quadro a seguir:
Critrios para definio do resultado final da triagem sorolgica de doadores de sangue para a doena de Chagas

(-)
(+)

(+)(+)
(-) (-)
(+)(+)

(+
-)

(-) no reagente

(+
- ) (+
-)
(+
)
(
-)
(+
- ) (+)
(-) (+)

(+) reagente

+
(-)
(regio cinza)

Ateno

A liberao dos hemocomponentes s pode ser feita quando
todos os testes sorolgicos obrigatrios apresentarem resultados negativos, conforme normas vigentes do Ministrio da Sade.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

Quais os procedimentos com os doadores que apresentarem resultados reagentes ou indeterminados?

Os doadores com resultados reagentes ou indeterminados para a infeco pelo T. cruzi devem ser encaminhados aos servios de referncia, para diagnstico.
As unidades hemoterpicas devem notificar os casos reagentes para infeco pelo T. cruzi junto vigilncia epidemiolgica local.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

10

Teste de Hemaglutinao Indireta - HAI

Em que se baseia a reao de HAI?

A reao de HAI se baseia na aglutinao de hemcias sensibilizadas com antgeno T. cruzi, em presena de
soro contendo anticorpos contra esse parasita. Veja na figura abaixo.

Representao esquemtica de uma reao de hemaglutinao indireta (HAI).

Observe que:
Na etapa 1, adiciona-se a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos anti-T. cruzi. O suporte, em
geral, uma placa de microtitulao;

Ateno
Placa de microtitulao produzida, geralmente, em poliestireno transparente
com 96 cavidades ou em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo em V
ou em U.
Na etapa 2, adiciona-se hemcias sensibilizadas com antgeno de T. cruzi;
Na etapa 3, a reao antgeno visualizada pela aglutinao das hemcias.

Como feita a leitura da reao e quais os critrios para se considerar uma
amostra reagente, no reagente ou indeterminada no teste de HAI?
A leitura feita, a olho nu, com a placa de microtitulao colocada contra a luz ou em espelho prprio. Veja no Quadro
1, os critrios para a leitura.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

11

Quadro 1 - Critrios para definir amostra reagente, no reagente ou indeterminada no teste de HAI
Amostra reagente

hemcias distribudas de maneira homognea,

em forma de tapete ou manto, ocupando rea
maior do que 50% do fundo da placa.

Amostra no reagente

hemcias acumuladas em forma de boto

no fundo do poo.

Amostra indeterminada

qualquer padro diferente dos anteriores.

Confira esses critrios na figura abaixo:

Visualizao de amostra reagente, no reagente e indeterminada na reao de HAI.

Ateno
O teste HAI pode ser qualitativo ou quantitativo.

Quando se utiliza o teste de HAI qualitativo e o HAI quantitativo ou para
titulao?
O teste de HAI qualitativo utilizado para definir se uma amostra reagente ou no reagente. A amostra
de soro para a realizao de HAI qualitativa diluda uma nica vez;
O teste de HAI quantitativo, ou para titulao, utilizado para confirmar os resultados das amostras reagentes
ou indeterminadas no HAI qualitativo e para definir o ttulo das amostras reagentes. Para a titulao feita a
diluio seriada das amostras do soro.

Como so feitas as diluies da amostra para o teste da HAI qualitativo e
quantitativo?
O fabricante do conjunto diagnstico fornece o diluente especfico e define a diluio inicial da amostra para
o teste qualitativo. As diluies da amostra para teste quantitativo so preparadas, em geral, na razo 2 a partir da
diluio do teste qualitativo. Acompanhe um exemplo:

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

12


Uma amostra foi reagente no HAI qualitativo na diluio nica de 1/20 de acordo com as orientaes do
fabricante. Para o teste HAI quantitativo foram feitas cinco diluies da amostra a partir da diluio 1/20 como apresentado na figura.

10L

50L da
diluio
1/20

50L da
diluio
1/40

50L da
diluio
1/80

50L da
diluio
1/160

50L da
diluio
1/320

190L
50L

50L

50L

50L

50L

Exemplo de diluio seriada da amostra para o teste de HAI quantitativo

Ateno
preciso hamogeneizar cada diluio antes de fazer a seguinte.

Depois de diluir, preciso determinar o ttulo da amostra.

Como determinado o ttulo de uma amostra no teste de HAI?

Para determinar o ttulo voc testa cada uma das diluies da amostra em um poo da placa de microtitulao. O ttulo corresponde ltima diluio em que a amostra ainda foi reagente, desde que a diluio seguinte
tenha um resultado negativo ou indeterminado. Continuando o exemplo do item interior, veja, na figura 5, o resulta
do obtido com cada uma das diluies da amostra:

Representao das reaes de cada uma diluio da amostra no HAI

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

13

Observe que o ttulo foi de 160, porque a diluio 1/160 foi a ltima onde a amostra ainda foi reagente.

Quais os materiais necessrios para realizar o teste de HAI qualitativo ou
quantitativo?
No quadro 2 esto os materiais geralmente fornecidos pelo fabricante e os materiais necessrios mas no
fornecidos.
Quadro 2 - Materiais utilizados para execuo do teste de HAI
Materiais geralmente fornecidos pelo fabricante
placas de microtitulao com fundo em V ou em U
diluente para os soros ou plasmas
soro-controle negativo
soro-controle positivo
hemcias sensibilizadas com antgeno T. cruzi
2 mercaptoetanol (2-ME)
Ateno: o 2-ME recomendado por alguns fabricantes e includo no conjunto diagnstico. Essa substncia quando misturada ao soro elimina a reatividade inespecfica
diminuindo a possibilidade de se obter resultados falso-positivos e indeterminados.

Materiais no fornecidos pelo fabricante

pipetas manuais de volume ajustvel (de 5 a 50 l, de 50 a 200 l e de 200 a 1.000 l)
ponteiras descartveis para as pipetas de volume ajustvel
pipetas graduadas de 1ml, 5 ml e 10 ml e pra de borracha
soro-controle positivo (CP) e negativo (CN) produzido em seu prprio laboratrio
fita adesiva transparente para selar a placa
espelho para leitura de placas de microtitulao (opcional)
agitador de placas (opcional)
protocolo de trabalho (vide bloco Anexos)
equipamentos de proteo individual: luvas, mscaras, avental ou jaleco
recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2%

Siga as orientaes do fabricante para conservar e armazenar os reagentes.

Como realizar um teste de HAI qualitativo e quantitativo ou para titulao?
O teste de HAI, qualitativo ou quantitativo (titulao), deve ser realizado de acordo com as orientaes do
fabricante. No entanto, alguns procedimentos gerais devem ser observados:
1. Confira o conjunto diagnstico (componentes, materiais, diluente e reagentes), verificando se ele est sob
condies adequadas de conservao e dentro do prazo de validade;

Ateno
Homogeneize as hemcias sensibilizadas com antgeno, verificando se esto
sem grumos. Se voc observar a presena de grumos, significa que houve
autoglutinao das hemcias o que torna o antgeno imprprio para o uso.

2. leia todas as instrues do conjunto diagnstico antes de iniciar o teste;

Ateno
Separe uma ponteira descartvel para cada amostra e para cada tipo
de reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

14

3. providencie os outros materiais, no fornecidos pelo fabricante, necessrios para realizao dos testes;

4. utilize exatamente os volumes indicados para o preparo de todas as solues. No faa qualquer alterao com o intuito de economizar reagentes;
5. deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar
a reao;

Ateno
A temperatura ambiente em laboratrio deve estar entre 20C e 26C
6. inclua soros-controles positivo e negativo fornecidos pelo fabricante e produzidos em seu laboratrio;
7. faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles, as amostras e as diluies correspondentes.
Veja um exemplo de protocolo de HAI no Anexo 1 deste manual;
8. faa a diluio das amostras: a) para ao HAI qualitativo a amostra deve ser diluda em tubo, de acordo com
a recomendao do fabricante, e depois pipetada na placa de microtitulao; b) para o HAI quantitativo
a diluio seriada da amostra deve ser feita na razo 2, e a partir da diluio do HAI qualitativo. Faa cada
uma das diluies diretamente em um poo da placa de microtitulao, de acordo com as instrues do
fabricante;
Lembre-se: homogeneize o contedo de cada diluio da amostra antes de fazer a diluio seguinte.
Utilize uma ponteira para cada diluio.

Ateno
Se o conjunto diagnstico utilizar- 2-ME, antes das diluies, as amostras devero ser preparadas do seguinte modo:

* dilua o 2-ME 1/100 em salina. Por exemplo: 10 L de 2ME + 990 L de soluo 0,85% NaCI (cloreto de sdio isotnico, ou seja, soro fisiolgico);
* dilua cada amostra (soro puro) com 2-ME j diludo. Faa essa diluio em volumes iguais, por
exemplo: para diluir 0,1 ml de soro utilize 0,1 ml de 2-ME j diludo;
* incube por 30 minutos a 37C. fundamental que o tempo de incubao seja exatamente 30
minutos.

9. Homogeneize suavemente o antgeno e pipete em cada poo da placa de microtitulao o volume indicado pelo fabricante;
10. Cubra a placa com fita adesiva transparente de modo que fique totalmente vedada;
11. Agite, suavemente, a placa de microtitulao, de preferncia com o agitador de placa, para homogeneizar
todos os componentes;
12. Incube a placa temperatura ambiente, em local sem vibraes, pelo tempo recomendado pelo fabricante;
13. Faa a leitura da reao verificando se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios
definidos pelo fabricante. Se os resultados dos controles no estiverem de acordo, inicie novamente o teste. S
considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios;
14. Registre os resultados no protocolo;
15. Despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico,
Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e
equipamentos necessrios.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

15

* Utilize sempre equipamentos de proteo individual e manipule as amostras como material potencialmente infectante.

Que medidas devem ser levadas em considerao para que voc possa
garantir a qualidade dos resultados do teste de HAI?
1. Leia atentamente todas as instrues do fabricante antes de iniciar qualquer reao;
2. Providencie todo o material necessrio execuo do teste e que no est contido no conjunto diagnstico;
3. no misture os controles, placas de microtitulao, hemcias sensibilizadas com antgeno e diluentes de diferentes lotes e/ou fabricantes;
4. homogeneize as hemcias observando se no houve aglutinao espontnea, antes de iniciar a reao; lembre-se: as hemceas autoaglutinadas formam grumos que as tornam imprprias para o uso;
5. verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso; no use reagentes com prazo de validade vencido;
6. execute as as diluies da amostra em diluente especfico fornecido no conjunto diagnstico e de acordo
com as orientaes do fabricante; lembre-se que fundamental homogeneizar cada diluio antes de
fazer a seguinte e trocar a ponteira.
7. incube a placa de microtitulao em local sem vibraes.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

16

Teste de imunofluorescncia indireta - IFI

Em que se baseia a reao de imunofluorescncia indireta (IFI)?

A reao de IFI baseia-se na interao do prprio T. cruzi (formas epimastigotas) com anticorpos contra esse
parasita presente no soro. Veja na figura abaixo.

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

Etapa 4

Representao esquemtica da reao de IFI positiva

Observe que:
na etapa 1, o prprio parasita T. cruzi fixado numa lmina de vidro com regies demarcadas;
na etapa 2, adicionada a amostra diluda que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se
ligam ao antgeno T. cruzi;
na etapa 3, adiciona-se o conjugado composto de uma anti-imunoglobulina humana ligada ao isotiocianato de fluorescena, que servir como revelador da reao antgeno e anticorpo;
na etapa 4, a interao antgeno/anticorpo evidenciada por meio da fluorescncia do parasita.
Assim como o HAI, o teste de IFI tambm pode ser qualitativo ou quantitativo:
* IFI qualitativo: define se a amostra reagente, no reagente ou indeterminada;
* IFI quantitativo: confirma os resultados das amostras reagentes e indeterminadas no IFI qualitativo e define o ttulo das amostras reagentes.

Como feita a leitura da reao e quais os critrios para se considerar
uma amostra reagente, no reagente ou indeterminada no teste de IFI?
Para leitura da reao, necessrio que voc utilize microscpio de fluorescncia. A interpretao dos resultados deve obedecer aos critrios descritos no quadro 3.
Interpretao de uma reao de IFI para diagnstico da infeco pelo T. cruzi
Amostra reagente
Amostra no reagente

Amostra indeterminada

Presena de fluorescncia uniforme em toda a

membrana dos tripanossomas
Ausncia total de fluorescncia nos tripanossomas
que se apresentam, geralmente, com colorao
vermelho tijolo
Qualquer padro diferente dos descritos anteriormente. Geralmente, os tripanossomas apresentam
fluorescncia inespecfica, ou seja, em vrias partes

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

17

O teste de IFI pode ser quantitativo ou qualitativo.

Como so feitas as diluies da amostra para realizar o teste de IFI qualitativo e quantitativo?
As diluies da amostra so feitas com PBS (Phosphate-Buffered-Saline), ou seja, soluo salina tamponada
com fosfatos, tambm chamada tampo fosfato.

Ateno
Vejas orientaes para preparar o PBS no bloco frmulas deste manual.

Para o teste de IFI, as diluies so realizadas de acordo com as orientaes definidas pela prtica dos laboratrios de referncia, ou seja:
Para o teste de IFI qualitativo recomenda-se a diluio 1/20, na triagem sorolgica de doadores em unidades hemoterpicas, enquanto que para diagnstico nos laboratrios de sade pblica essa diluio
deve ser de 1/40;
Para o teste de IFI quantitativo recomenda-se a execuo de pelo menos 5 diluies na razo 2 a partir da
diluio do teste qualitativo.
Na figura 7, voc pode conferir a seqncia de diluies da amostra para IFI quando for necessria a titulao
na triagem sorolgica de doadores de sangue.

Figura 7 Representao da seqncia de diluies da amostra no teste IFI quantitativo para triagem sorolgica de doadores de sangue

Agora, veja na figura 8, a seqncia de diluies da amostra no IFI quantitativo para diagnstico sorolgico.

Figura 8 Representao da seqncia de diluies na teste IFI quantitativo para diagnstico sorolgico.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

18


A opo dos laboratrios de referncia pela diluio inicial da amostra em 1/40 para diagnstico sorolgico
foi feita aps estudos epidemiolgicos. Esses estudos demonstraram que soros de indivduos verdadeiramente chagsicos apresentam reatividade em diluio igual ou maior que 1/40.

Os mesmos dados epidemiolgicos indicaram que, na populao no-chagsista, a presena de anticorpos na

turais responsvel por um grande nmero de resultados falso-positivos, quando esses soros so testados em diluies
menores do que 1/20.

Visando proteo dos receptores de sangue e hemocomponentes, foi estabelecida a diluio inicial da
amostra em 1/20, para evitar a ocorrncia de resultados falso-negativos na triagem sorolgica de doadores de
sangue.

Como determinado o ttulo de uma amostra no teste de IFI?

Para determinar o ttulo, cada uma das diluies da amostra e colocada em contato com antgeno, em uma demarcao da lmina de IFI. O ttulo, como voc j sabe, corresponde ltima diluio em que a amostra ainda foi reagente,
desde que a diluio seguinte tenha um resultado negativo ou indeterminado.
Na reao de IFI o conjugado tambm precisa ser titulado.

Por que necessrio o titular o conjugado na reao de IFI?

O ttulo de conjugado varia em funo das condies de trabalho e do operador. Alm disso, existem variaes tanto na qualidade dos reagentes de cada lote quanto na capacidade de resoluo dos diferentes microscpios
de fluorescncia. Portanto, mesmo que o fabricante indique o ttulo, a titulao dever ser feita:
a cada novo lote de conjugado ou de antgeno;
sempre que o controle positivo acusar perda da intensidade de fluorescncia.
Veja, no prximo item, quais os materiais necessrios para titular o conjugado e testar as amostras por IFI.

Quais os materiais necessrios para realizar o teste de IFI?

Para o teste de IFI, o antgeno e os reagentes so adquiridos separadamente ou juntos em um conjunto diagnstico.
Quadro 4 - Materiais necessrios para execuo do teste de IFI
Reagentes
Antgeno de T. cruzi (fixado na lmina, liofilizado ou em suspenso)
Ateno: os antgenos liofilizados e em suspenso devem ser preparados e fixados nas
lminas seguindo rigorosamente as instrues do fabricante.
Tampo fosfato PBS (phosphate buffer saline) pH 7,2 vide bloco Frmulas
Azul de Evans (AE) (vide bloco Frmulas)
Conjugado anti-imunoglobulina humana (total ou IgG) conjugada ao isotiocianato de
fluorescena
Glicerina tamponada pH (9,0 0,5) vide bloco Frmulas
Soros-controle (positivo e negativo) controle de qualidade interno da reao,

Equipamentos e materiais de laboratrio

Relgio despertador (timer)
Lminas demarcadas para IFI
Microscpio de fluorescncia
Pipetas manuais de volume ajustvel (5 l a 50 l, 50l a 200 l, 200 l a 1.000 l)
Ponteiras descartveis para as pipetas manuais
Balana semi-analtica e acessrios de pesagem
Agitador tipo Kline (opcional)
Estufa com temperatura regulvel a 37oC
Cmara mida
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

19

Cubas para lavagem de lminas (cuba de Koplin)

Lamnulas 24 x 50 mm
Provetas de 1.000 ml
Bquer de 2.000 ml
Recipientes de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2%
Luvas descartveis, culos, mscaras ou protetor facial e jaleco
Protocolo de trabalho (vide bloco Anexos)

Como armazenar os reagentes do teste de IFI?

As lminas j contendo o antgeno fixado devem ser armazenadas -20C. Aqueles laboratrios que utilizarem
antgeno liofilizado ou em suspenso devem ser conservados entre 2C e 8C, antes de fazer a fixao na lmina.
A anti-imunoglobulina humana (total ou IgG), glicerina tamponada e azul de Evans, devem ser mantidos
tambm entre 2oC e 8oC.
Agora que voc j conhece os materiais e a forma de armazen-los, veja no prximo item como titular o conjugado.

Como realizar a titulao do conjugado?

A titulao do conjugado deve ser feita do seguinte modo:
1. leia atentamente todas as instrues do fabricante;
2. deixe o soro-controle negativo, o positivo e os demais reagentes atingirem a temperatura ambiente. Utilize um soro positivo com o ttulo compreendido de 1/80 a 1/320;
3. deixe uma lmina com antgeno j fixado atingir a temperatura ambiente;

Ateno
Evite atrito na parte superior da lmina para no remover o antgeno fixado.

4. coloque a lmina em estufa a 37C at sua completa secagem. Cuidado: a lmina no pode ficar na estufa
alm de 10 minutos, que o tempo mximo necessrio para sua secagem;
5. faa a identificao da lmina e prepare um protocolo de trabalho, indicando as posies do soro controle
positivo (CP), do negativo (CN) e do PBS. Veja na figura 9.

Figura 9 Representao de uma lmina para titulao do conjugado

Ateno
A demarcao contendo PBS um controle para verificar se o conjugado
reage inespecificamente com os parasitas. Se houver fluorescncia no PBS, elimine a soluo, prepare uma nova e repita o teste.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

20

6. faa e homogeneize a diluio do soro CN a 1/20 (190 l de PBS + 10 l do CN);

7. faa a diluio do CP com PBS, de acordo com o ttulo do soro que voc estiver utilizando (1/80, 1/160 ou
1/320);
8. pipete nas dermacaes correspondentes da lmina (figura 9) 10 l do PBS, 10 l do CN j diludo e 10 l
do CP j diludo;
Lembre-se: providencie uma ponteira descartvel para cada tipo de controle e reagente a ser pipetado.
No reutilize as ponteiras.
9. coloque a lmina em cmara mida e incube em estufa a 37 C por 30 minutos;
10. faa a lavagem da lmina, aps incubao, do seguinte modo:
a)mergulhe-a, rapidamente, em um recipiente contendo PBS pH 7,2;
b)coloque a lmina na cuba e adicione PBS pH 7,2 at cobri-la completamente;
c)coloque a cuba em agitao durante 5 minutos. Caso voc no tenha um agitador tipo Kline, faa

sucessivas e cuidadosas agitaes manuais pelo mesmo espao de tempo;

d)repita o passo b e c mais 2 vezes, trocando o PBS a cada vez;

e)lave rapidamente a lmina em gua destilada;
f)coloque-a em estufa a 37C at a secagem completa

Lembre-se: a lmina no pode ficar na estufa alm de 10 minutos.

Enquanto aguarda a agitao e a secagem da lmina, voc pode executar os passos 11 e 12,
11. prepare a soluo PBS e azul de Evans (AE) a 0,01%, para diluir o conjugado, seguindo as orientaes do
bloco Frmulas deste manual.
12. faa as diluies do conjugado como apresentado na figura 10.

Figura 10- Diluies recomendadas para titular o conjugado

Ateno

fundamental homogeneizar cada tubo antes de fazer a diluio
seguinte e trocar a ponteira.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

21

13. pipete 10 l de cada diluio do conjugado nas demarcaes correspondentes da lmina. Confira na figura 11.

Figura 11 Lmina com PBS e soros positivo e negativo j diludos para titulao do conjugado

14. Faa a incubao e a lavagem da lmina seguindo os mesmos procedimentos descritos nos passos 9 e 10;
15. prepare a lmina para leitura aplicando 2 a 3 gotas de glicerina tamponada pH 9,0 ( 0,5) sobre a mesma;
16. cubra a lmina com uma lamnula 24 x 50 mm evitando a formao de bolhas. Mantenha a lmina ao
abrigo da luz e em local seco at a leitura;
17. faa a leitura da reao da lmina em microscpio de fluorescncia, utilizando objetiva de 40 vezes;
18. registre os resultados no protocolo.

Como interpretar os resultados para determinar o ttulo ideal do conjugado?

Considera-se como ttulo ideal do conjugado a maior diluio que apresentar:
fluorescncia uniforme em toda a membrana do parasita no soro controle positivo;
ausncia de fluorescncia no controle negativo e no PBS.
Para compreender melhor, veja, no Quadro 5, os resultados obtidos, para cada diluio do conjugado.
Quadro 5 - Exemplo 1 - resultados obtidos na titulao do conjugado

CP

Resultados
CN

1/50

Fluorescncia
uniforme em toda
a membrana do
parasita

Fluorescncia
descontnua na
membrana do
parasita

Ausncia de
fluorescncia

1/100

Fluorescncia
uniforme em toda
a membrana do
parasita

Ausncia de
fluorescncia

Ausncia de
fluorescncia

1/200

Fluorescncia
inespecfica ou fraca
em vrias partes
do parasita

Ausncia de
fluorescncia

Ausncia de
fluorescncia

1/400

Ausncia de
fluorescncia

Ausncia de
fluorescncia

Ausncia de
fluorescncia

Diluio do
Conjugado

PBS

CP - Controle positivo CN - Controle negativo PBS - Salina tamponada

Como voc pode ver, no exemplo, o ttulo ideal do conjugado foi encontrado na diluio 1/100, que a
maior diluio onde foi observada fluorescncia uniforme na membrana do parasita no controle positivo, sem
fluorescncia no controle negativo e no PBS.
Veja, agora, no Quadro 6, um outro exemplo.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

22

Quadro 6 - Exemplo 2 - resultados obtidos na titulao do conjugado

CP

Resultados
CN

1/50

Fluorescncia
uniforme em toda
a membrana do
parasita

Fluorescncia
descontnua na
membrana do
parasita

Ausncia de
fluorescncia

1/100

Fluorescncia
uniforme em toda
a membrana do
parasita

Fluorescncia
descontnua na
membrana do
parasita

Ausncia de
fluorescncia

1/200

Fluorescncia
uniforme em toda
a membrana do
parasita

Ausncia de
fluorescncia

Ausncia de
fluorescncia

1/400

Fluorescncia
uniforme em toda
a membrana do
parasita

Ausncia de
fluorescncia

Ausncia de
fluorescncia

Diluio do
Conjugado

PBS

CP - Controle positivo CN - Controle negativo PBS - Salina tamponada

Observe que, no exemplo 2, no foi encontrado o ttulo ideal e, neste caso, voc deve repetir os procedimentos de titulao com mais duas diluies do conjugado (1/800 e 1/1.600).

Ateno
preciso repetir os procedimentos at que o ttulo ideal do conjugado seja
encontrado para que voc possa testar as amostras.

Lembre-se que voc deve titular o conjugado:

a cada novo lote do conjugado ou do antgeno;
sempre que o controle positivo acusar perda de intensidade de fluorescncia.

Como realizar o teste de IFI qualitativo e quantitativo (titulao)?

1. Leia as instrues do fabricante de cada reagente antes de iniciar o teste;
2. Deixe os soros-controle e as amostras atingirem a temperatura ambiente. Inclua o controle de qualidade interno,
3. Deixe o conjugado, a glicerina tamponada e o azul de Evans atingirem a temperatura ambiente;
4. Faa o protocolo de trabalho. Voc encontra um exemplo desse protocolo no Anexo 2 deste manual;
5. Retire do congelador o nmero de lminas correspondentes quantidade de amostras a serem testadas e
deixe-as descongelar at atingirem a temperatura ambiente;

Ateno
As lminas j devem estar com o antgeno fixado

6. Coloque essas lminas em estufa a 37C at a sua completa secagem (no mximo 10 minutos )

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

23

7. Faa em PBS a diluio das amostras;

a)para o teste de IFI qualitativo;
faa a diluio a 1/20 nas unidades hemoterpicas;
faa a diluio a 1/40 nos laboratrios de sade pblica.
b)para o teste de IFI quantitativo (titulao), as diluies da amostra devem ser feitas na razo 2 a partir

da diluio do IFI qualitativo, seguindo as orientaes j apresentadas;

Lembre-se: homogeneize o contedo de cada diluio da amostra antes de fazer a diluio seguinte.
8. pipete, em cada demarcao da lmina, 10 L das diluies dos soros controles (CP e CN) e das amostras,
de acordo com seu protocolo de trabalho;
9. coloque as lminas em cmara mida e incube-as em estufa a 37C durante 30 minutos;
10. faa a lavagem das lminas, aps a incubao, seguindo os mesmos procedimentos descritos na titulao
do conjugado;
11. dilua o conjugado de acordo com a titulao j realizada, enquanto aguarda o tempo de incubao das amostras.
Calcule o volume do conjugado a ser diludo de acordo com o nmero de amostras a serem testadas. Em geral,
150 L so suficientes para testar cada lmina;
Prepare somente o volume de PBS-AE a 0,01% necessrio para diluir o conjugado.
Jamais utilize o conjugado diludo de um dia para outro.

12. pipete 10 L do conjugado diludo em cada demarcao da lmina:

13. faa a incubao e a lavagem das lminas, seguindo os mesmos procedimentos j descritos nos passos
9 e 10;
14. prepare as lminas para leitura, aplicando 2 a 3 gotas de glicerina tamponada pH 9,0 ( 0,5) sobre cada
lmina.
15. cubra cada lmina com uma lamnula de 24 x 50 mm, evitando a formao de bolhas. Mantenha as lminas ao abrigo de luz e em local seco at a leitura;
16. faa a leitura da reao em microscpio de fluorescncia, utilizando objetiva de 40 vezes. Inicie a leitura
pela demarcao que corresponde ao controle positivo; em seguida, leia a demarcao que corresponde
ao controle negativo; e, finalmente, leia as demarcaes correspondentes s amostras;

Ateno
Os controles devem apresentar padro reagente (CP) e no reagente (CN).
Caso contrrio, descarte a lmina e repita o teste a partir do primeiro passo,
procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S
considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles
estiverem de acordo com os critrios do fabricante.
17. registre os resultados no protocolo;
18. despreze as amostras, a sobra do conjugado e os resduos dos reagentes utilizados.

Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e
equipamentos necessrios.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

24


Que medidas devem ser levadas em considerao para que voc possa
garantir a qualidade dos resultados do IFI?
1. leia atentamente todas as instrues do fabricante antes de iniciar qualquer reao;
2. providencie todo o material necessrio execuo do teste;
3. homogeneize cada diluio antes de fazer a seguinte e troque a ponteira;
4. verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso. No use reagentes com prazo de validade vencido;
5. faa a titulao do conjugado a cada novo lote do conjugado e do antgeno e sempre que o controle positivo acusar perda de reatividade;
6. no utilize o conjugado diludo de um dia para o outro;
7. verifique as condies de funcionamento do microscpio.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

25

Teste de Elisa
Em que se baseia o ELISA?
O ELISA um teste imunoenzimtico que se baseia na interao antgeno-anticorpo evidenciada pela ao de
uma enzima e o substrato apropriado, e revelada por um cromgeno.
Cromgeno substncia que revela a ao de uma enzima sobre o substrato por meio de mudana
de cor.
So componentes do ELISA: fase slida, antgeno, enzima, substrato, cromgeno e soluo de bloqueio da
reao.
Fase slida: material capaz de adsorver o antgeno ou o anticorpo que ser empregado no teste.

Quais as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico

da infeco pelo T. cruzi?
Confira no quadro abaixo, as variaes encontradas nos componentes do ELISA para diagnstico da doena
de Chagas.
Variaes encontradas nos componentes do ELISA
Componentes

ELISA

Fase Slida

placas de microtitulao - produzidas, geralmente,

em poliestireno transparente com 96 cavidades ou
em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo
chato ou arredondado
prolas - pequenas esferas de poliestireno

Antgeno

fraes isoladas do parasita T. cruzi, preparadas

para reduzir a possibilidade de reao cruzada

Enzima

fosfatase alcalina ou
peroxidase

Substrato

perxido de hidrognio (H2O2)

Cromgenos

ortofenilenodiamina (OPD) ou
tetrametil benzidina (TMB)

Soluo de Bloqueio

H2SO4 ou
HCl

Qual o tipo de ELISA utilizado no diagnstico da infeco pelo T. cruzi?

Para a deteco de anticorpos anti-T. cruzi utiliza-se o ELISA indireto.

Qual a seqncia de um ELISA indireto?

A figura 12 apresenta a seqncia de um ELISA indireto para uma amostra reagente:

Figura 12 Seqncia esquemtica de um ELISA indireto para uma amostra reagente

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

26

Observe que:
Na etapa 1, os antgenos esto adsorvidos fase slida;
Na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam
fase slida;
Na etapa 3, com a adio de um conjugado, composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (antiimunoglobulina), ocorre a interao conjugado e anticorpo da amostra;
Na etapa 4, adicionam-se o substrato e o cromgeno;
Na etapa 5, a ao da enzima no substrato revelada pelo cromgeno, que sofre um processo de oxidao
dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A cor varia de acordo com o tipo de cromgeno
utilizado. Nessa etapa, adicionada uma soluo de bloqueio para interromper o processo de oxidao. Se
esse processo no for interrompido, haver aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados
falso-positivos.

Ateno
Se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for
no reagente, a reao no acontecer e consequentemente no haver
desenvolvimento de cor.
A cor resultante da ao da enzima deve ser lida em espectrofotmetro.

Como definir se um resultado de ELISA reagente, no reagente ou indeterminado?

No ELISA o resultado de uma reao definido pela leitura da absorbncia ou densidade tica (DO) em espectrofotmetro, utilizando um filtro com comprimento de onda indicado pelo fabricante do conjunto diagnstico.
Usualmente, cada conjunto tem sua forma de calcular o ponto de corte (cut-off-CO), acima ou abaixo do qual as
amostras so consideradas reagentes, no reagentes ou indeterminadas.
As amostras indeterminadas so aquelas cujos valores de DO esto includos na zona cinza (borderline). A zona
cinza compreende a faixa de valores em torno do cut-off, dentro da qual no se pode ter certeza do resultado.

Como definir a zona cinza no ELISA?

Em geral, o fabricante do conjunto diagnstico indica como definir a zona cinza.
Quando no existir a orientao do fabricante, recomenda-se que sejam consideradas indeterminadas as
amostras com valores de DO includas no intervalo de 10% a 20%, abaixo ou acima do valor do cut-off.
Acompanhe um exemplo do clculo do intervalo de 10% para definio da zona cinza:
ELISA com CO= 0,20
10% do CO = 0,20/10 = 0,02
Limite inferior da zona cinza = CO-10% = 0,20 0,02 = 0,18
Limite superior da zona cinza = CO +10% = 0,20 +0,02 = 0,22

Quais os materiais utilizados para execuo do ELISA?

No quadro abaixo esto os materiais geralmente fornecidos pelo fabricante e os materiais no fornecidos.
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

27

Materiais utilizados para execuo do ELISA

Materiais geralmente fornecidos pelo fabricante
placa de microtitulao ou prolas sensibilizadas com antgeno T. cruzi
selos ou tampas de cobertura
soro-controle negativo
soro-controle positivo
solues-tampo para a diluio das amostras e do conjugado
soluo-tampo para a lavagem
conjugado
substrato e cromgeno
soluo-tampo para diluir o substrato
soluo de bloqueio de reao

Materiais no fornecidos pelo fabricante

relgio (timer)
pipetas manuais de volume ajustvel (de 5 a 50 l, de 50 a 200 l e de 200 a 1.000 l)
mono e multicanal
ponteiras para pipetas manuais de volume ajustvel
pipetas graduadas de 5 ml e 10 ml
pra de borracha ou outro auxiliar de pipetagem
barquetes (reservatrios) para a utilizao de pipetas multicanal
bquer de 1.000 ml
provetas de 100 ml, 500 ml e 1.000 ml
frasco com tampa de 1.000 ml
basto de vidro
equipamentos de proteo individual: luvas, mscaras, avental ou jaleco
recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2%
protocolo de trabalho (vide bloco Anexos)

Siga as orientaes do fabricante, para conservar e armazenar os reagentes.

Alm dos materiais constantes do Quadro 8, o laboratrio deve estar equipado com banho-maria com termostato para regulagem de temperatura; estufa com termostato regulvel; sistema de lavagem e de leitura compatveis com os mtodos empregados e com as especificaes dos conjuntos diagnsticos disponveis.

Ateno
Antes de iniciar um procedimento, verifique se os equipamentos esto
em condies adequadas de uso.

Quais os procedimentos necessrios para executar o ELISA?

Os procedimentos variam de acordo com o fabricante do conjunto diagnstico. Alguns procedimentos gerais, no
entanto, devem ser observados:
1. confira o conjunto diagnstico, verificando todos os seus componentes, se eles esto sob condies adequadas de conservao e dentro do prazo de validade;
2. leia todas as instrues do conjunto diagnstico antes de iniciar a reao;
3. providencie os outros materiais, no fornecidos pelo fabricante, necessrios para a realizao dos testes;

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

28

Ateno
providencie uma ponteira descartvel para cada amostra e para cada tipo
de reagente a ser pipetado. No reutilize ponteiras.
4. utilize exatamente os volumes indicados para preparar as solues, no faa qualquer alterao com o
intuito de economizar reagentes;
5. deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar
a reao;
A temperatura ambiente em laboratrios deve estar entre 20C e 26C
6. Homogeneize as amostras;
7. inclua, alm dos controles fornecidos pelo fabricante, o controle de qualidade interno da reao, conforme orientao dos cursos TELELAB Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidade Hemotrpicas e Laboratrios de Sade Pblica
8. faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles e as amostras. Veja o exemplo de um protocolo
de ELISA no Anexo 3 deste manual;
9. siga rigorosamente os tempos de incubao e os ciclos de lavagem indicados pelo fabricante, tendo o
cuidado de evitar a contaminao cruzada das amostras;
10. Faa a leitura da absorbncia em espectrofotmetro, utilizando o filtro recomendado pelo fabricante;
Siga as orientaes do fabricante do conjunto diagnstico
para o clculo do cut-off.
11. Verifique se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Caso contrrio, faa novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados
inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de
acordo com os critrios do fabricante;
12. registre os resultados no protocolo;
despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado e, recipiente apropriado para material
infectante.
Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e
equipamentos necessrios.

Que medidas devem ser levadas em considerao para que voc possa garantir a qualidade dos resultados do ELISA?
Verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso. No use reagentes com prazo de validade vencido;
No misture controles, conjugados, prolas ou placas de diferentes lotes e/ou fabricantes;
Armazene os conjuntos diagnsticos de acordo com as recomendaes do fabricante;
No exponha o substrato luz durante o armazenamento ou incubao da reao, evitando assim a fotodecomposio do mesmo;
No coloque o substrato em contato com substncias oxidantes ou metais, para evitar sua degradao,
evidenciada pela alterao de cor;
Faa limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos de lavagem, evitando dessa maneira o acmulo de sais e outros compostos qumicos;
Verifique se o filtro usado para a leitura da absorbncia aquele indicado pelo fabricante.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

29

Anexo 1 - Exemplo de protocolo de Hai

para Doena de Chagas

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

30

Anexo 2 - Exemplo de protocolo de IFI

para Doena de Chagas

IFI n:
Antgeno:
Conjugado:
Tcnico responsvel:

Lote:
Lote:

Data: __ / __ / __
Validade: __ / __ / __
Validade: __ / __ / __ Diluio:

Observaes:

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

31

Anexo 3 - Exemplo de protocolo de Elisa

para Doena de Chagas

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

32

Referncias Bibliogrficas

Ferreira, A.W.; vila, S.L.M. Diagnstico laboratorial das principais doenas infecciosas e auto-imunes. Editora
Guanabara Koogan, 2a Edio, 443 p., Rio de Janeiro, 2001.
Gomes, Y.M. PCR and sero-diagnosis of chronic Chagas disease: biotechnological advances. Appl. Biochem. Biotechnol. 66:107-119, 1997.
Henry J. B. Diagnsticos clnicos e tratamento por mtodos laboratoriais. Barueri: Manole, 20 edio, 2008.
Luquetti A.O, Castro A.M. Captulo 6. Diagnstico sorolgico da doena de Chagas. In: Clnica e Teraputica da
doena de Chagas. Uma abordagem prtica para o clnico geral. Ed. JCP Dias, JRCoura. Editora Fiocruz, Rio de Janeiro.
p. 99-113, 1997. Disponvel em: http://books.scielo.org/id/nf9bn/pdf/dias-9788575412435.pdf
Luquetti, A.O.; Rassi, A. Diagnstico laboratorial da infeco pelo Trypanosoma cruzi. In Brener, Z.; Andrade, Z.;
Barral-Netto, M (org.), Trypanosoma cruzi e Doena de Chagas, Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, pp. 344348, 2000.
Luquetti A.O, Schmuis G.A. Diagnosis of Trypanosoma cruzi Infection. Chapter 28 In: Telleria J, Tibayrenc M.
American Trypanosomiasis Chagas Disease One Hundred Years of Research. Elsevier, Amsterdam (E-book). p. 743792, 2010.
Ministrio da Sade. Consenso Brasileiro de Doena de Chagas. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. V. 38, suplemento III, p.
1-29, 2005.
Vaz, A.J.; Takei, K.; Bueno, E.C. Imunoensaios Fundamentos e Aplicaes. 1 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

33

Crditos e autoria

2001 - MINISTRIO DA SADE

Lilian Amaral Inocnicio

Assessora Tcnica da Unidade de Laboratrio do PN DST/AIDS-MS
Mirian Franchini
Coordenadora Geral do Projeto TELELAB
Autores:
Alejandro Luquetti
Eliana Furtado Moreira
Maria de Ftima Sampaio Gadelha
Yara de Miranda Gomes
Maria Lcia Ricciotti Ribinik (pedagogia)
Maristela Arantes Marteleto (pedagogia)
Colaboradores:
Luiz Alberto Peregrino Ferreira
Maria Luiza Bazzo
Hlio Morais
Cludia Beatriz Oliveira
Simone Monzani Vivaldini
Coordenadoras do Telelab
Assessoria Pedaggica:
Maria Lcia Ricciotti Ribinik
Martistela Arantes Marteleto
Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade
pblica. - Braslia: Ministrio da Sade, Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. 1998.
88 p.: il. (Srie TELELAB)
1. Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade

Doena de Chagas - Triagem e diagnstico sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica

34