Microbiologa General

Facultad de Ciencias Exactas

UNLP
Laboratorios N10: Antimicrobianos
1. Prueba de difusin en gar: ANTIBIOGRAMA, tcnica de Kirby y Bauer.
Objetivo: Determinar el espectro de susceptibilidad a antimicrobianos de Escherichia coli,
Pseudomonas. sp. por la tcnica de difusin en agar.
Preparacin del medio de cultivo
gar Mueller-Hinton
Infusin de carne de buey 300 ml
Aminocidos de casena
15 g
Almidn
1.5 g
Agar
17 g
Agua destilada c.s.p.
1000 ml

pH final=7.4.

El medio de cultivo, agar Mueller-Hinton, se entuba a razn de 25 ml por tubo y se esteriliza

en autoclave, 120C por 15 min. Una vez esterilizado se vuelca en placas de Petri, sobre una
superficie horizontal y uniforme con el fin de obtener una profundidad aproximada de 4 mm.
Esto requiere unos 25 ml de medio en placas de 100 mm de dimetro. Antes de ser utilizadas
se secarn a 35C durante 20 a 30 min.
Preparacin del inculo
A partir de un desarrollo en agar nutritivo se realiza una suspensin directa a partir de 4 5
colonias con 18-24 hs. de incubacin en solucin fisiolgica ajustando la turbidez al 0.5 de la
escala de Mc Farland (aprox. 1.5 x 10 8ufc/ml). Dentro de los 15 minutos de estandarizado en
inculo, se siembra el medio de la siguiente manera: se sumerge un hisopo de algodn estril
en la suspensin estandarizada y el exceso de lquido se elimina presionando y rotando el
hisopo firmemente contra el interior del tubo por encima del nivel de lquido. Luego se pasa el
hisopo en franjas uniformes en tres direcciones cubriendo toda la superficie de la placa de
agar para obtener una siembra uniforme. Las placas se dejan secar de 3 a 5 minutos antes de
aplicar los discos. El inculo debe dar un desarrollo confluente (aplicar los discos dentro de los
15 min. posteriores a la inoculacin).
Aplicacin de los discos
Los discos de antimicrobianos se aplican sobre la superficie de las placas inoculadas con
pinza estril. Todos los discos deben presionarse suavemente sobre el agar para asegurar
contacto total con la superficie. Deben colocarse a una distancia igual o mayor de 15 mm del
borde de la placa y lo bastante separados para evitar la superposicin de los halos de
inhibicin. No usar ms de 6 discos por placa de 100 mm.
Dentro de los 15 min. de colocados los discos llevar a incubar con la placa invertida a 35C
durante 16 a 18 hs.
Lectura e interpretacin
Luego del perodo de incubacin se leen los halos de inhibicin utilizando un calibre o una
regla.
1

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El punto final es la inhibicin total del crecimiento, sin tener en cuenta las colonias diminutas
que puedan detectarse solo con una observacin muy minuciosa. Los dimetros de zonas
para antimicrobianos individuales se traducen a las categoras de susceptibles, intermedios o
resistentes con referencia a tablas interpretativas. Generalmente son aquellas recomendadas
por el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)
Control de calidad del ensayo
Para monitorear la exactitud y precisin del procedimiento y la calidad de los reactivos se
realiza un control de calidad peridico con cepas control de susceptibilidad conocida y
genticamente estable. Las cepas recomendadas para control de mtodos de difusin son:
Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC 35218), Staphylococcus aureus (ATCC 25923),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Enterococcus faecalis (ATC29212).
Cepa

Antibitico

Halo de inhibicin
(mm)

Criterio de corte
(mm)

Interpretacin

2. Prueba de dilucin en caldo: Determinacin de la C.I.M.

Objetivo: Determinar el valor de la concentracin inhibitoria mnima (C.I.M.) de ampicilina
sobre Escherichia coli por la tcnica de dilucin en caldo.
Preparacin del medio de cultivo
Caldo de Mueller-Hinton suplementado con Cl2Ca (25 mg/l) y Cl2Mg (50 mg/l).
Preparacin de la solucin del antibitico
Pesar 10 mg del antibitico ampicilina y llevar a volumen en matraz aforado de 10 ml con
agua destilada estril (solucin stock de 1000 g/ml). En el momento de usar se diluye 1/10
con agua destilada estril (solucin de trabajo de 100 g/ml).
Preparacin del inculo
A partir de un cultivo puro de E. coli en agar nutritivo se prepara una suspensin en solucin
fisiolgica ajustando la turbidez al 0.5 de la escala de Mc. Farland. Diluir esta suspensin
1/100 colocando 0.2 ml en 19.8 ml de caldo Mueller-Hinton.
Preparacin de las diluciones
Se preparan diluciones al doble a partir de la solucin de trabajo, directamente en los tubos
de la siguiente manera
2

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a- Disponer y enumerar 14 tubos estriles.
b- Comenzar colocando el caldo de Mueller-Hinton de acuerdo a lo indicado en la tabla.
c- A los tubos 1, 2 y 12 agregarles 0.5 ml de la solucin de antibitico 100 g/ml.
d- A partir del 2 tubo, luego de homogeneizar muy bien, extraer 0.5 ml y pasarlos al tubo
siguiente. Realizar esta operacin hasta el tubo 11, descartar de aqu 0.5 ml..
e- Agregar a todos los tubos que indica la tabla 0.5 ml de inculo.
Tubo 12: Control de esterilidad de la solucin de antibitico.
Tubo 13: Control crecimiento de la cepa.
Tubo 14: Control de esterilidad del caldo.
Incubar los tubos a 35C durante 18 a 20 hs.
Lectura
La menor concentracin de antimicrobiano que produce una inhibicin completa del desarrollo
visible representa la C.I.M.
Para la interpretacin de la lectura (S, I, R) se recurre a las tablas de C.I.M. para el antibitico
ensayado recomendadas por el CLSI.
Control de calidad
Para monitorear la exactitud y precisin del procedimiento y la calidad de los reactivos se
realiza un control de calidad en paralelo al ensayo con cepas control de susceptibilidad
conocida y genticamente estables. Las cepas recomendadas para control de mtodos de
dilucin son: Escherichia coli (ATCC 25922 y ATCC35218), Staphylococcus aureus (ATCC
25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Enterococcus faecalis (ATC29212) entre
otras.
Esquema para la realizacin de la C.I.M.
Dil. del antibitico
(ml)

Inculo

Conc. final
antibitico

100 g/ml

0.5 ml

50 g/ml

100 g/ml

0.5 ml

25 g/ml

0.5 del tubo 2

0.5 ml

12.5 g/ml

0.5 ml

0.5 del tubo 3

0.5 ml

6.25 g/ml

0.5 ml

0.5 del tubo 4

0.5 ml

3.12 g/ml

0.5 ml

0.5 del tubo 5

0.5 ml

1.56 g/ml
0.78 g/ml

Tubo

Caldo M-H

----

0.5 de

0.5 ml

0.5 de

0.5 ml

Resultado
(turbidez)

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7

0.5 ml

0.5 del tubo 6

0.5 ml

0.5 ml

0.5 del tubo 7

0.5 ml

0.39

0.5 ml

0.5 del tubo 8

0.5 ml

0.195 g/ml

10

0.5 ml

0.5 del tubo 9

0.5 ml

0.09

11

0.5 ml

0.5 del tubo 10

y retirar 0.5 ml

0.5 ml

0.045 g/ml

12

0.5 ml

0.5 de

100g/ml

--------

13

0.5 ml

--------------------------

0.5 ml

14

--------------------------

--------

ml

g/ml

g/ml

Control de
est. de dil.
Atb.
Control de
cepa
Control de
est. del caldo

CIM: ...................................... Interpretacin:.......................................................

3. Valoracin microbiolgica de antibiticos

Objetivo: Determinar la potencia de una muestra de ampicilina inyectable por la tcnica
microbiolgica de difusin en gar (3+3).
Ensayo aleatorizado en dosis (3+3), por la tcnica de difusin en agar.
En el trabajo prctico se realizar la valoracin de una muestra de ampicilina inyectable de 1000mg
por el mtodo cilindro-placa.
Previo a la valoracin de cualquier antibitico debe realizarse la curva de calibracin Dosis-Respuesta
para la seleccin de las diluciones de prueba en las condiciones del ensayo. En este caso el anlisis
de la curva log concentracin (g/ml) vs halo (mm) permiti seleccionar las siguientes tres
concentraciones de trabajo: 0,15 g/ml - 0,30 g/ml - 0,60 g/ml.
Realizacin del ensayo de valoracin
-Preparacin de las diluciones del estndar de referencia.
Utilizar un estndar de Ampicilina de 980 g/mg, Proceder de acuerdo a lo indicado en la USP-XXV
(Biological Test/ Antibiotics-Microbial Assays). Pesar exactamente alrededor de 20 mg del estndar.
Calcular el volumen de agua destilada estril para resuspender la pesada de forma de obtener una

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solucin de 5000 g/ml, teniendo en cuenta la potencia (g/mg). Realizar el siguiente esquema de
diluciones:
1:50
1:10
0.15: 10 ==> 0.15 g/ml
5000 g/ml 100 g/ml 10 g/ml 0.30: 10 ==> 0.30 g/ml
ADE
S3
S3
0.60: 10 ==> 0.60 g/ml
Solucin 3 (S3):

P04K2H -------16.73 g
P04KH2 ------ 0.523 g
AD
-------1000 ml

pH 8, 0.1M

-Preparacin de las diluciones de la muestra.

Preparar las diluciones de la muestra siguiendo el esquema utilizado para el estndar. Considerar
que la muestra tiene una potencia del 100% segn lo declarado por el fabricante.
-Preparacin del inculo.
El microorganismo utilizado como indicador es el Micrococcus luteus, ATCC 9341. Sembrar la cepa
en 3 tubos de gar para antibiticos N11 de Merck, e incubar 24 hs a 32 C. Resuspender los
desarrollos en solucin fisiolgica (0.85% NaCl), de forma de obtener un inculo denso y homogneo.
Finalmente calibrar el inculo al 25% de transmitancia leda a 580 nm. As preparado puede
conservarse a 4C durante 14 das.
Calcular el volumen de inculo a sembrar por placa sobre la base de la relacin propuesta por USPXXV: 0.5 ml cada 100 ml del medio.
-Preparacin de las placas.
Se utiliza el gar para antibiticos N11 de Merck, envasado a razn de 16 ml por tubo. Fundir 6
tubos del medio N11, enfriarlos a 45-50C y mantenerlos en Bao Mara. Inocularlos, homogeneizar
y volcar en las respectivas placas de Petri estriles. Dejar secar 10 minutos en flujo laminar.
-Reservorio del antibitico
Utilizar cilindros de vidrio o de acero inoxidable esterilizados en estufa. Sus dimensiones son:
dimetro externo: 8 mm; dimetro interno: 6 mm y longitud: 10 mm.
-Ensayo
Dibujar 4 esquemas de distribucin de las diluciones sobre papel asignndoles las letras A,B,C y
D. Cada esquema tendr las 6 diluciones: dosis baja (1), media (2) y alta (3) del estndar y dosis
baja (4), media (5) y alta (6).de la muestra

1
5

A
6

4
2

Colocar las placas rotuladas con una letra sobre las plantillas segn los esquemas.
Con pinza estril disponer 6 cilindros por placa.

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Cargar con pipeta automtica 25 l de cada una de las diluciones en los respectivos cilindros, de
acuerdo a la distribucin de cada esquema. Cambiar de la punta descartable (tip) en cada dilucin.
Dejar las placas sobre la mesada para permitir la predifusin del antibitico durante 20 minutos.
Llevar a incubar a 37 C durante 24 horas.
Retirar los cilindros y descartarlos en formol al 5%.
Rotular los halos de inhibicin y leer con calibre por el reverso de las placas.
Registrar los datos segn la planilla: placas vs. diluciones.

Placas

0,15
g/ml

Estndar
0,30
g/ml

S1

S2

0,60 g/ml

0,15 g/ml

S3

T1

Muestra
0,30
g/ml

0,60
g/ml

T2

T3

A
B
C
D
A*
B*
Prom.
(mm)

Luego de evaluar estadsticamente los datos mediante un anlisis de varianza, calcular la

potencia real del producto.
Graficar el logaritmo de las concentraciones ensayadas en funcin de los halos de inhibicin para
el estndar y la muestra.
De acuerdo al procedimiento realizado las dosis alta, media y baja del estndar son iguales a las
dosis alta, media y baja de la muestra, por lo tanto se esperara una respuesta coincidente entre
ambas. Esto equivale a decir que la potencia real de la muestra es igual a la potencia supuesta. La
diferencia real que pueda existir entre las dos respuestas lineales queda demostrada por la distancia
vertical que aparezca entre las dos lneas paralelas: M, de donde se estima la potencia real de la
muestra.
Deduccin de las ecuaciones en el ensayo 3 + 3.
Como puede observarse en la figura, para cada una de las dosis supuestas de la muestra, existe una
respuesta que puede traducirse en una dosis real si se interpola el dimetro en la curva
correspondiente al estndar. Tomando en cuenta lo que se acaba de enunciar podemos decir que:
Considerando que la relacin entre la dosis real y la dosis supuesta es idntica a la relacin entre
M log

Dreal (3)
Dreal ( 2)
Dreal (1)
log
log
D sup(3)
D sup(2)
D sup(1)

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la potencia real (de la muestra) y la potencia supuesta (del estndar) podemos escribir:
Si se logra determinar la relacin entre Preal y Psup (R) puede determinarse la potencia de la
M log

Pr eal
log R
P sup

muestra ya que la potencia supuesta es conocida. Para esto calculemos la pendiente de las rectas
teniendo en cuenta los datos de que disponemos. Hay dos maneras de hallarla que quedan claras si
se observa el Grfico -1.

Grafico-1: Relacin entre el log Dosis y el halo de inhibicin en un ensayo de valoracin

microbiolgica de un antibitico por el mtodo de difusin en gar, en tres niveles de dosis (3+3).

Log Dosis
Standard (S)
D real (3)
D sup (3)

Muestra (T)

D real (2)
D sup (2)

D real (1)

Pendiente

M
I

F
E

D sup (1)

F
E
S1

T1

S2

T2

S3

T3
Dimetro del halo

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Con
F T 1 S1) (T 2 S 2) (T 3 S 3)

1
3

(Ntese que se hace un promedio de tres distancias).

E S 2 S1) ( S 3 S 2) (T 2 T 1) (T 3 T 2)

1
4

(Ntese que se hace un promedio de cuatro distancias).

Simplificando
E ( S 3 S1) (T 3 T 1)

1
4

El valor de I tambin es conocido ya que es el logaritmo de la relacin entre dosis sucesivas

(usualmente log 2=0.301). Queda claro que

M F

I
E

Por lo tanto estamos en condiciones de calcular M y R a partir de los resultados de los halos de
inhibicin obtenidos. La potencia real de la muestra estar dada por
Pr eal R P sup

En este caso, como R>1, la potencia de la muestra es mayor que la del standard (Preal>Psup) lo cual
concuerda con el grfico. En el caso que la situacin real sea la inversa de la planteada para deducir
las ecuaciones, esto es cuando la potencia de la muestra sea menor que la del standard, las mismas
ecuaciones seguirn siendo vlidas pero el valor calculado para F ser negativo, el log M ser
negativo y el R<1 (Preal<Psup).
Cabe aclarar que todas estas ecuaciones slo podrn aplicarse si el ensayo cumple con el anlisis de
varianza que asegure, entre otros requisitos, que se cumplen las condiciones de linealidad y
paralelismo requeridas.
Potencia de la muestra:...................................................
Resultado (de acuerdo a USP XXV):

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CUESTIONARIO
1- Qu es y cules son las condiciones deseables en un antibitico?
2- Cmo pueden clasificarse los antibiticos?
3- a) Cmo explica el mecanismo de accin de las penicilinas?
b) En qu fase del crecimiento manifiestan su accin?
4- a) Cmo explica la toxicidad selectiva de los antimicrobianos que afectan la membrana
citoplasmtica de los procariotes?
b) En qu fase del crecimiento manifiestan su accin?
5- Cmo se explica la inhibicin microbiana por antimetabolitos?
6- a) Cmo se originan las cepas resistentes a los antimicrobianos?
b- Cmo manifiestan los microorganismos la resistencia a los antimicrobianos?
7- a) Qu es un antibiograma y con qu finalidad se realiza?
b) Qu es la CIM y cuando se aplica?
c) Qu es la CBM?
8- Cul es el objetivo del control de calidad del las pruebas de susceptibilidad?
9- Las siguientes frmulas explican la relacin entre el tamao de la zona de inhibicin y la
concentracin del antibitico ms la influencia de distintos parmetros, en el ensayo de difusin en
gar.
ln m' = ln m0 - y2 / 4DT'
y2

D = f ( temperatura/ viscosidad x radio molecular)

= 4DT [ln m0 /H - ln m' - ln ( 4 D T)]

y: Radio del halo de inhibicin.

m': Concentracin del antibitico en el borde del halo de inhibicin.
m0 : Concentracin del antibitico en el reservorio.
D : Coeficiente de difusin del antibitico.
T : Tiempo en que se forma el halo de inhibicin.
H : Espesor de la capa de gar.
Cmo afectara el tamao del halo de inhibicin la variacin de los siguientes parmetros?
a) Aumento de la concentracin del antibitico en el reservorio.
b) Aumento de la temperatura de incubacin.
c) Aumento del volumen de medio por placa.
d) Aumento de la cantidad de microorganismos inoculados por placa.
e) Cambio del medio de cultivo utilizado.
f) El antibitico A dio un halo de inhibicin mayor que el producido por el antibitico B bajo las mismas
condiciones de trabajo. Qu puede decirse respecto del grado de susceptibilidad de la cepa
testeada sobre cada antibitico?

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10- Ly11BB es un nuevo antibitico -lactmico de administracin oral, con un espectro de actividad
antimicrobiana similar a las cefalosporinas. Es resistente a -lactamasas y qumicamente ms
estable.
Con el fin de obtener una interpretacin confiable de la prueba de susceptibilidad por difusin se
realiz un difusograma (grfico que representa los valores de log CIM en funcin de los dimetros de
los halos de inhibicin) con 579 aislamientos clnicos tpicos de especies representativas y utilizando
discos con 30 g de Ly11BB.
Los resultados se muestran en la siguiente figura:
CIM g/ml >32 --

192

2 4

4 1 2 1 3 1 6 2 1

32 --

1 2

16 --

--

--

--

--

2 1 2 3 1

1 1 1 2
2
1

4 2

2 2 1 2

2 1
2

2 5

6 6

3 1 1 2 1 1 1

4 10

8 14 22 11 18 7 11 6 3 1 2 8

1
1

0.5 --

9 7 6 2 2 3

2 13 11 7 11 13 7 6

0.25 --

1 6
10

15

20

25

30

6 1 1

35 mm

Es importante considerar que en los ensayos de difusin hay tres tipos de errores: I) falsos
susceptibles (very major), II) falsos resistentes (major) y III) intermedios por uno de los mtodos y
sensibles o resistentes por el otro (minor).
Uno de los criterios utilizados para definir los "dimetros o puntos de corte" es mantener los falsos
susceptibles por debajo de 1% de la poblacin.
a) Explique claramente cmo definira los dimetros de corte para el ensayo de difusin en gar.
b) Cules seran los valores crticos recomendados para el ensayo de difusin del Ly11BB,
Agrguelos al grfico. Considere CIM 8 g/ml CIM 32 g/ml, como valores de corte. Para muchas
otras cefalosporinas se considera resistencia con d < 14 mm y sensibilidad con d > 18 mm.
c) Cmo se efectuaron las determinaciones de cada uno de los puntos de la figura 1?
d) Dibuje un grfico de log CIM en funcin de dimetro del halo de inhibicin y marque las zonas
donde se verifiquen los errores que se mencionan en el texto.
e) Podra aplicar el criterio de considerar sensibles a los microorganismos que presentan un d > 18
mm? Por qu?
11- En un ensayo realizado para determinar la susceptibilidad de Sthaphylococcus aureus a tres
antibiticos se obtuvieron los resultados de la tabla siguiente:

10

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Cepas
ensayadas
de S.
aureus

MSSA
(n =32)

MRSA
(n = 63)

Antibitico

Valores de corte
de CIM (g/ml)

Meticilina

Penicilina

0.12

0.25

Ciprofloxacina

Meticilina
Penicilina

8
0.12

16
0.25

Ciprofloxacina

16

Valor de
CIM
hallados

N de
cepas

0.5 a 4
0.08
0.4
0.5
2
> 64
> 128
8
0.5
2
>64

32
5
27
24
4
4
63
63
12
2
49

a) Complete la tabla segn % de cepas S, I, y R.

b) Defina que es la CIM y explique en forma de esquema como realizara el ensayo para
determinar uno de los casos de la tabla.
12- El antibiograma de la cepa Streptococcus thermophilus arroj los siguientes resultados:
Nitrofurantona (carga de disco: 300 g/ml): 19 mm y Kanamicina (carga de disco: 10 g): 25 mm. Si
las normas de interpretacin de halos y correlacin con la CIM son:

Halos de inhibicin (mm)

CIM

R
I
S
R
S
Nitrofurantona
15-16
14
17
100 g/ml
25 g/ml
300 g/ml
Kanamicina
14-17
13
18
25 g/ml
6 g/ml
10 g/ml
a) Cmo interpreta los resultados?
b) Cmo podra confirmar estos resultados y qu situaciones se podran presentar?
13- Los datos que se detallan a continuacin fueron extrados de una coleccin de cultivos de
referencia. Estas cepas son utilizadas peridicamente para verificar la interpretacin de los halos de
inhibicin en los ensayos de susceptibilidad a los antibiticos. El antibitico estudiado es vancomicina.
a) Grafique un difusograma con estas cepas de referencia e indique las normas de interpretacin de
los halos. Considere los valores de corte para CIM 8 g/ml y 16 g/ml.
b) El aislado fue ensayado en un test de susceptibilidad a este antibitico y el halo obtenido fue de
28 mm de dimetro. Indique de acuerdo al difusograma la sensibilidad de la cepa a este
anibitico.
c) Describa esquemticamente y fundamente el ensayo realizado al aislado en b).
d) Qu tipos de discrepancias entre CIM y dimetro de halo conoce? Indquelas en el grfico.

11

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Cepas
Shigella- 1
Shigella - 2
Shigella - 3
Shigella - 4
Pseudomonas 1- 2- 3- 4 y 5
Klebsiela- 1
Klebsiela- 2
Klebsiela- 3
Proteus- 1
Proteus- 2
Aerobacter- 1
Aerobacter- 2

CIM (g/ml)

Log2 CIM

Halo (mm)

0.250

-2

40

0.250
0.250
0.250
0.250
1
1
1
16
16
64
64

-2
-2
-2
-2
0
0
0
4
4
6
6

38
37
39
<8
22
29
32
16
15
9
8

14- En qu casos justificara una valoracin microbiolgica de un antibitico?

15- Un laboratorio farmacutico necesita controlar la materia prima para la elaboracin de
comprimidos de Gentamicina (sulfato). Para tal fin realiza la valoracin microbiolgica por difusin en
gar (3+3), obteniendo los siguientes resultados:
Placas
A
B
C

205
206
204

Standard
239
252
234

293
295
299

190
197
178

Muestra
228
230
220

283
281
290

Los halos fueron registrados como dcima de mm.

Dosis 1= 0,2 g/ml, Dosis 2 = 0,40 g/ml.
Los datos cumplen con las condiciones del anlisis de varianza.
a) Cul es la potencia de la materia prima valorada?
b) Grafique los resultados y deduzca la ecuacin que permite su clculo.
c) Cul es el fundamento del mtodo empleado?

12