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Facultad de Ciencias Qumicas

INGENIERIA EN ALIMENTOS

Dr. Enrique Flores Andrade


I.B.Q. Delia Araujo Morales

Agosto Noviembre 2011

NDICE

TEMA:

PGINA:

Introduccin

Seguridad en el laboratorio

Lineamiento de las prcticas

PRCTICAS:
1. Fermentacin alcohlica

12

2. Extraccin de ADN a partir de bazo bovino

15

3. Extraccin de ADN a partir de levadura

17

4. Elaboracin de yogurt y determinacin de cido lctico

19

5. Cultivo de hongos comestibles

22

6. Medio de cultivo y obtencin de cepas

25

7. Actividad enzimtica producto de microorganismos

27

8. Biotransformacin de la leche por accin enzimtica

30

9. Produccin de hongos comestibles

32

10. Biorreactores

36

11. Sistemas de control de biorreactores

38

INTRODUCCIN
El uso de microorganismos para transformar materiales biolgicos a fin de producir
bebidas y alimentos fermentados tiene sus orgenes en la Antigedad. Desde entonces,
se han perfeccionado bioprocesos para producir una enorme variedad de productos
comerciales, desde materiales relativamente baratos como el alcohol industrial y los
solventes orgnicos, hasta productos qumicos finsimos y carsimos como los
antibiticos, protenas teraputicas y vacunas. Las enzimas y clulas vivas que se
emplean en la industria como las levaduras de panadera y cervecera son tambin
productos comerciales de bioprocesos. (Doran, 1995)
Las aplicaciones de los microorganismos han estado presentes desde tiempos
inmemorables, ya sea en el campo de la salud, permitiendo la produccin de vacunas y
antibiticos o en la produccin de alimentos mediante procesos de fermentacin. El
hombre hizo uso de ellos sin saber que stos existan desde que descubri la manera de
hacer cerveza, vinagre, vino o pan. (Bojorquez, 2011)
Los sistemas biotecnolgicos son sistemas complejos y difciles de controlar; pero
obedecen a las leyes qumicas y fsicas y estn sujetos al anlisis ingenieril. La
intervencin de la ingeniera es esencial en muchos aspectos de los bioprocesos; por
ejemplo, el diseo y la operacin de biorreactores, el diseo de esterilizadores y equipo
de recuperacin de productos, el perfeccionamiento de sistemas de automatizacin y
control de operaciones, o el diseo de plantas de fermentacin seguras y eficientes.
(Doran, 1995)
Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el
microorganismo utilizado, en la eleccin del mismo se deben tener en cuenta ciertos
criterios generales que se indican a continuacin:
1. El microorganismo debe poder obtenerse en forma de cultivo puro
2. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
3. Su velocidad de crecimiento deber ser alta.
4. Sus requerimientos nutricionales deben ser satisfechos a partir de medios de
cultivo de costo reducido y si es posible que no necesite de factores de
crecimiento.
5. Debe ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo, sin prdida de sus
caractersticas particulares.
6. Debe llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debe ser de alto rendimiento y de
fcil extraccin del medio de cultivo.
8. Debe poder desarrollarse en cultivos a gran escala

9. De preferencia debe producir esporas u otra forma de reproduccin para su fcil


inoculacin.
10. Ser inocuo, es decir, no representar peligro para el ser humano, plantas y
animales.
11. Ser susceptible a modificacin gentica. (Bojorquez, 2011)
Cualquier proceso biotecnolgico de nivel industrial tiene que pasar por las siguientes
escalas de operacin: laboratorio, planta piloto e industrial; ya que todo proceso
industrial nace en un laboratorio, donde se hacen los clculos precisos, pero el proyecto
del proceso en una planta de produccin debe prever aspectos que no se consideran en
un laboratorio antes de la puesta en marcha de un proceso de produccin. El biorreactor
puede considerarse como el corazn de todo proceso biotecnolgico, ya que se lleva a
cabo la transformacin de la materia prima al producto de inters y su operacin deber
de garantizar la maximizacin en la conversin, por lo que su funcionamiento es de vital
importancia en la rentabilidad del bioproceso, sobre todo en aquellos catalogados como
de altos volmenes de produccin y bajo valor agregado. (Vzquez, 2010)
Este manual de prctica tiene como propsito proporcionarle al ingeniero en alimentos
los elementos bsicos para entender los procesos fermentativos relacionados con los
bioprocesos de la industria de los alimentos y asimismo los aspectos ingenieriles del
manejo de los biorreactores. El primer aspecto est comprendido en la primera parte de
este manual y la segunda parte se relaciona con el manejo de biorreactores, los
elementos que deben tomarse en consideracin para su funcionamiento y sus usos.

BIBLIOGRAFA:
Bojrquez Velzquez, Esa; Manual de prcticas de procesos industriales de
fermentacin, Universidad de Los Mochis, 2011.
Doran, Pauline; Bioprocess Engineering Principles; Ed. Elsevier Science & Technology
Books, 1995.
Vzquez Gurrola, Dynora et. Al; Manual de prcticas Laboratorio de Biorreactores;
ENCB, IPN, 2010.

REGLAMENTO INTERNO
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
Laboratorio 104
I.

CONTROL DE ASISTENCIA.
Todas las sesiones de trabajo se ajustarn al horario establecido por la Secretara
Acadmica de la Facultad y el Calendario escolar del Perodo vigente.
Todos los alumnos deben
correspondiente y enmicado.

presentar gafete

de

identificacin en

el formato

Se dar un margen mximo de 10 minutos para poder asistir con retardo. El alumno
debe tener presente que se evaluar su asistencia y puntualidad segn el porcentaje
indicado en los parmetros de evaluacin de cada maestro titular, considerando que NO
hay semana de recuperacin, y que a pesar de tener derecho a un 20% de
inasistencias justificadas segn el reglamento de los Alumnos, debe cumplir de
manera presencial el 100% de las prcticas del Programa.
Durante la prctica, los alumnos no podrn salir del laboratorio a excepcin de
enfermedad, estricta necesidad y con permiso del maestro. Se recomienda preparar el
material necesario desde antes de entrar, para no interrumpir ni retrasar el trabajo
programado para cada sesin.
Todos los integrantes de cada gaveta, debern contar con una copia de la llave del
candado que asegura la misma, pues de faltar alguno, no se acreditar la prctica
correspondiente a todos los integrantes.
II.

SEGURIDAD CONTRA PRDIDAS DE MATERIAL.


Cada integrante de la gaveta, debe hacerse responsable de contribuir en la compra de un
candado de buena calidad y SEGURO. Al trmino de cada sesin la gaveta debe
quedar cerrada debidamente.
Los integrantes de cada gaveta se harn responsables de marcar adecuadamente todo
su material al inicio del Curso y contar con una copia del listado del material
solicitado al Almacn, incluyendo una lista de material adicional.
Se prohbe estrictamente la entrada al laboratorio para sacar material fuera del
horario que le corresponde y en ausencia de sus compaeros de gaveta.

Se prohbe abrir cualquier gaveta que no sea la propia, aun cuando le hayan prestado la
llave.
El material, equipo y reactivos del Laboratorio 104 son exclusivos para el uso y servicio
del Laboratorio de Bioprocesos.
Los alumnos que sean sorprendidos abriendo gavetas que no sean las propias o
sustrayendo cualquier otro tipo de material dentro del Laboratorio, sern sancionados
mediante la desacreditacin de la prctica y se harn acreedores a las sanciones
establecida por las Autoridades Administrativas y Acadmicas correspondientes. Se
exhorta a mantener un ambiente de mutuo respeto, honestidad y disciplina.
III.- PREVENCIN DE ACCIDENTES.
Queda estrictamente prohibido consumir alimentos y bebidas en el Laboratorio.
Se prohbe fumar.
Deber mantenerse el orden y la disciplina dentro del Laboratorio evitando juegos,
msica y TODO distractor de la atencin requerida.
Todo alumno deber contar con su bata blanca de algodn, larga, de mangas largas;
cubre bocas, guantes latex (de ciruga) y lentes de seguridad. Debe evitarse el uso
de zapato abierto y pantalones cortos.
Usar el cabello recogido y cubrecabellos.
Manipular con mucho cuidado el material de vidrio.
Tener a la mano toalla, franela y/o jerga, para evitar quemaduras, cortaduras o
rompimiento del mismo con riesgos inherentes a la naturaleza de los reactivos.
Para cortar o preparar conexiones de vidrio, debe manejarse el tubo con una franela,
usar una lima metlica y lentes protectores.
Procure no apoyarse sobre las palmas de sus manos para colocar las conexiones o
forzar su entrada en los tapones, protjase las manos con la jerga o franela.
Use como punto de apoyo la mesa o soporte metlico cuando horade tapones.

EVITE cortaduras o accidentes que requieran su traslado a URGENCIAS en el Hospital.


Procurar tener actualizado su Seguro Facultativo para cualquier atencin Mdica
que, como estudiante, llegara a requerir, realizar a tiempo los trmites en la Secretara de
la Facultad y, si tiene algn padecimiento que requiera atencin especial, comunicarlo a
sus maestros para poder auxiliarlo en su debido caso.
Usar vidrio de reloj y esptula metlica para manipular reactivos slidos, en especial los
corrosivos, evitando derramarlos sobre las mesas o las balanzas o el piso.
NUNCA tratar de oler ningn reactivo qumico, pegando directamente la nariz al
recipiente, sino a distancia prudente, atraer con la mano el olor que despida, si es que no
se trata de una mezcla o reactivo cido o bsico txico, que despida vapores irritantes.
NUNCA probar ningn reactivo, ya que todos conllevan algn riesgo para la salud.
OJO: Cualquier incidente debe comunicarse al maestro para aplicar las medidas
pertinentes oportunamente.

Todo MATERIAL BIOLGICO debe manipularse con mucho cuidado:

Al entrar al laboratorio deber portar su bata blanca de manga larga, guantes de


ltex (de ciruga), cubre bocas, cubre cabellos, lentes de seguridad, zapato
cerrado y ropa adecuada.
Al salir del laboratorio deber quitarse las protecciones en el siguiente orden:
Primero lavar los guantes con benzal y alcohol, antes de quitrselos. Secarlos
con serviitoallas y meterlos en papel de estraza para esterilizarlos.
Lavarse las manos y desinfectarlas.
Quitarse el cubre bocas y cubre cabellos y guardarlo en bolsa nylon para
posteriormente lavarlo con agua y cloro en su casa.
Los lentes de proteccin los limpiar con alcohol.
Si se llegara a contaminar algn material, ste deber esterilizarse.

Los tubos de cultivo que contengan microorganismos debern guardarse en el


refrigerador y cuando ya no se necesiten debern someterse a esterilizacin.
La mayora
de los solventes orgnicos son inflamables, evite calentarlos
directamente, use bao mara o calentamiento indirecto con arena o glicerina, si requiere
mayores temperaturas, de acuerdo a los puntos de ebullicin constantes que caracterizan
a cada compuesto.

No llene demasiado con el reactivo el recipiente que va a calentar, y controle el


calentamiento. Evite acercar a la flama del mechero, reactivos inflamables.

Procure usar slo las cantidades indicadas por el maestro y no sacar del
Laboratorio ningn reactivo, ya que se cuenta con un Inventario de los mismos para que
estn siempre disponibles en sus prcticas y adems, porque implica riesgos
innecesarios.

Evite derramar reactivos en los lavaderos, a menos que haya seguido un tratamiento
previo a los residuos, indicado por el maestro. Todo residuo slido, no txico, debe tirarse
en los botes de basura, para no tapar los lavaderos ni contaminar (desechos de papel,
vidrio, plstico, metal, hule, etc.)
Residuos: Todo residuo de las prcticas del curso se vaciar en un recipiente marcado
con el nombre de la prctica y que se encontrar en la mesa cerca de las ventanas, al
frente del laboratorio. Por ninguna razn lo vierta en el desage, a menos que el titular o
el tcnico de laboratorio lo autorice.
NO TIRE cerillos al piso, ni los apague contra el plstico que protege las mesas, no los
tire en las canaletas de las mesas ni en los lavaderos, hay botes de basura, asegrese de
tirarlos apagados.
Todas las instalaciones del Laboratorio han sido dispuestas con el mayor esfuerzo y
mejor atencin de las Autoridades y, reciben mantenimiento para que el estudiante tenga
un mejor aprovechamiento acadmico al cumplir sus programas prcticos de laboratorio,
evite deteriorar o daar las mismas, tambin podrn usarlas futuras generaciones.
Cuidarlas habla del uso consciente y responsable de cada estudiante, demostrando sus
valores familiares y la educacin que, privilegiadamente, recibe en una Universidad
Pblica.
Antes de iniciar cada sesin de trabajo, cheque que todo est en buenas condiciones: su
mechero, las mangueras, los tapones, las conexiones, ajuste correcto de pinzas universales y
estabilidad segura de los aparatos montados, as como tener etiquetados debidamente todos los
contenedores y contar con cerillos o encendedor, evitando las tiras papel.
Apague todo equipo utilizado, cuando haya terminado de usarlo o vigile que no exceda el tiempo
de uso para evitar que se deteriore o se queme y no se pueda seguir aprovechando, por
ejemplo, la campana de extraccin, la estufa, la parrilla, el microscopio y la bomba de vaco.
VIGILE que no haya fugas de gas, y/o de disolventes dentro de los contenedores que usa en su
aparato.

Cercirese antes de entrar al laboratorio de haber ledo y comprendido lo que va a realizar


en su prctica, investigue antes las constantes fsicas y propiedades qumicas, dibuje un
Diagrama de Flujo que le permita visualizar de manera general los pasos de su trabajo y
organice su participacin en el equipo con el que trabaja.
Registre todas sus observaciones de manera oportuna (al momento de realizarse la prctica),
completa y fidedigna en su bitcora. esta bitcora es imprescindible en todo investigador y
profesional de la Ciencia, le asegura el xito en todo intento de mejorar, proponer o repetir
cualquier proyecto o descubrimiento. Cuente siempre con su tcnica persona, debidamente
protegida.
Evite temores innecesarios que no le permitan trabajar con la seguridad que se requiere en
cada prctica y en la que seguramente tendr xito si la realiza con planeacin,
responsabilidad y preparacin preliminar de su material, equipo, conocimiento de la tcnica y
fundamento terico de la misma.
Procure trabajar con una actitud positiva, responsable y honesta considerando la
puntualidad para entrar y salir de cada sesin de trabajo en el laboratorio.
Si usted considera cada punto de este reglamento para realizarlo le felicitamos por defender
su vocacin con profesionalismo. Enhorabuena.

NO CORRA RIESGOS INNECESARIOS


1) Los reactivos son extremadamente peligrosos, al grado de ser letales; por lo
tanto, antes de iniciar una prctica, el alumno debi haber consultado la
reactividad qumica de los reactivos de laboratorio ante el contacto con la piel,
ojos, garganta, pulmones y agua; as como las medidas ms apropiadas en
circunstancias de contacto.
2) Etiquetar apropiadamente las soluciones utilizadas en la prctica.
3) Evitar desperdicios innecesarios.
4) Al manejar soluciones o lavar material, evitar salpicar.

LINEAMIENTOS GENERALES PARA LOS REPORTES DE LAS PRCTICAS


1. El reporte escrito de la prctica deber realizarse a computadora con las siguientes
caractersticas:
Mrgenes superior e inferior de 2.5, izquierdo y derecho de 3
Letra Arial tamao 12 e interlineado 1.5.
Sin sangras.
2. En la investigacin para conocer el fundamento de la prctica (o introduccin) debe
hacer referencia a la fuente que consult en cada prrafo. Por ejemplo:
stos
son sistemas de reaccin bajo condiciones bsicas (Adam y Sevcik, 1998).
3. Forma de escribir las referencias de su investigacin:
Las referencias, al final de la prctica, debern ser escritas siguiendo la forma:
Revista cientfica: Tsami, E.; Katsioti, M. Drying kinetics for some fruits: Predicting of
porosity and colour during dehydration. Drying Technology 2000, 18 (7), 15591581.
Libro: Lachman, L.; Lieberman, H.A.; Kanig, J.L. The Theory and Practice of Industrial
Pharmacy; Lea & Febiger; Philadelphia, 1974.
Captulo de libro: Epstein, N.; Grace, J.R.; Spouting of particular solids. In Handbook of
Powder Science and Technology; Fayed, M.E., Otten, L., Eds.; Van NostrandReinhold
Co.: New York, 1997; 509536.
Conferencia: Lerici, C.R.; Dalla Rosa, M.; Pinnavia, G. Direct osmotic as pre-treatment
to fruit drying. In Proceedings of European Conference on Food Chemistry, Rome, Italy,
March 1518, 1983; 287296.
Internet: Orihuela, J. L. "Nuevos paradigmas de la comunicacin" , en Chasqui, No 77,
Revista Latinoamericana de Comunicacin, edicin de Internet, seccin Opinin, marzo
de 2002, http://comunica.org/chasqui/77/orihuela77.htm, consultada 2 de abril de 2002.
4. Figuras, grficas y tablas:
Las figuras debern estar bien explicadas. En la parte de abajo de la figura se
debe indicar el nmero de figura y una breve descripcin de la misma (ejemplo:
Figura 3. Contenido de humedad en granos de maz como funcin de la actividad
de agua).
Si se tratase de una grfica, los ejes y smbolos deben tener leyendas apropiadas.
No olvide anotar la fuente, si es parte de su investigacin.
En el caso de las tablas, en la parte de arriba se indicar el nmero de la tabla y
una breve descripcin de la tabla (ejemplo: Tabla 2. Constantes cinticas a
diferentes temperaturas de experimentacin).

5. Reporte de prcticas. Los puntos a considerar en el reporte de las prcticas son los
siguientes:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivos.
Introduccin (investigacin).
Resultados.
Discusin de resultados y conclusiones.
Referencias.

6. Observaciones note que:


1) Las prcticas son individuales. Mismos resultados pero diferente investigacin,
discusin y conclusin. Los alumnos que copian y que se dejan copiar sern
sancionados.
2) Las prcticas se entregan cada semana y tienen el valor de la asistencia.
3) El 20% de inasistencia equivale a no tener derecho a presentar el trabajo final de
laboratorio.
4) Se considerar como inasistencia aquella prctica que presente alguna de las
siguientes faltas: no cubra los requisitos establecidos en el reporte de la prctica,
calidad de la presentacin, escrito deficiente y mala actitud.
5) La entrega de excelentes prcticas al final del curso equivale al 25% de la
calificacin total y es el derecho al examen de teora.

Evaluacin

Desempeo

40

Bitcora

15

Reporte de prctica

25

Examen

20

PRCTICA 1
Fermentacin alcohlica
OBJETIVO:
Demostrar la produccin de alcohol etlico por organismos anaerobios, a partir de
diversos sustratos ricos en azcares.
FUNDAMENTO DE LA PRCTICA:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Tipo de organismo y caractersticas de Saccharomyces cerevisiae.
2. Qu es la fermentacin?
3. Tipos de fermentacin.
4. Identifica los requisitos del proceso de fermentacin.
MATERIAL:

Matraz Erlenmeyer de 250 ml.


Tapn de hule monohoradado.
Manguera de hule.
Tubo de vidrio.
Matraz de destilacin.
Refrigerante recto.
Soportes universales.
Pinzas universales.
Vasos de precipitado de 100 ml (2) y de 250 ml (1).
Agitador de vidrio
Tubos de ensayo (2).
Gradilla.
Pipetas graduadas de 5 ml y de 10 ml.
Vidrio de reloj.
Cpsula de porcelana.
Mechero de bunsen (o en su defecto parrilla elctrica).
Portaobjetos.
Cristalizador.

REACTIVOS:
Solucin de hidrxio de bario al 2%.
Solucin de hidrxido de potasio al 20%.
Solucin de Lugol (iodo/ioduro de potasio).
Solucin de cito ctrico al 5%.
Papel indicador universal.
Solucin alcohlica de azul de metileno al 0.1%.

Diversos:

Levadura seca en grnulos.


Sustrato (miel, jugo de caa, jugo de frutas).

TCNICA:
Parte I (primera sesin)
1) Pesar 10 g de levadura seca e hidratar en un vaso de precipitado de 100 ml con
50 ml de agua corriente.
2) Luego de unos 10 minutos tomar una gota con una varilla de vidrio, efectuar un
frotis en un portaobjetos y dejar secar.
3) Verter el colorante de azul de metileno sobre el frotis y dejar teir por 30
segundos, enjuagar con agua corriente y dejar secar.
4) Observar al microscopio compuesto y dibujar.
5) Colocar en el matraz Erlenmeyer el sustrato elegido. Si se tratara de glucosa diluir
hasta los 150 ml con agua corriente. En caso de usar algn jugo de frutas se
emplear puro. Agregar la levadura hidratada, agua casi hasta el cuello del
matraz y ajustar el pH con la solucin de cido ctrico hasta que quede entre 4 y
5.
6) Tapar perfectamente y conectar la manguera al trozo de tubo de vidrio que se
habr puesto a travs del tapn.
7) La manguera se conectar en el otro extremo a otro trozo de tubo de vidrio y se
colocar dentro de un tubo de ensayo lleno de agua e invertido sobre un
cristalizador a modo de cmara hidroneumtica.
8) Luego de una hora, observar la formacin de burbujas que desplazan el agua del
tubo de ensayo. Con cuidado, retirar del agua, agregar 5 ml de solucin de
hidrxido de bario, agitar y anotar lo observado. Dejarlo reposar 24 h.
Parte II (siguiente sesin)
Una vez que se haya terminado la fermentacin (que depender del sustrato y de la
temperatura a la cual tenga lugar) continuar con la parte siguiente.
1) Decantar con cuidado el lquido del matraz y pasarlo al matraz de destilacin.
2) Destilar y recoger los primeros 15 ml de lquido. Indicar olor y caractersticas.
3) Colocar 5 ml de destilado en una cpsula de porcelana y acercar un cerillo.

4) En un tubo de ensayo, a 5 ml de destilado agregarle 10 ml de solucin de lugol.


Luego aadirle gota a gota la solucin de hidrxido de potasio hasta que se
decolore. Calentar a bao Mara unos 5 minutos. Una vez fro pasar a un vidrio de
reloj y observar al microscopio de diseccin. Dibujar lo observado. Anote la forma,
el color y el olor de los cristales si los hubiera.
Parte III: Anlisis del destilado
1) Mide 10 ml en una probeta con el destilado. Antalo
2) Mide el volumen exacto del destilado.
3) Determina la masa del destilado. (Masa de la probeta con el destilado menos la
masa de la probeta vaca). Calcula la densidad. Este mtodo es bueno para dos
figuras (masa/volumen).
4) Usando la siguiente tabla, determina el porcentaje de la composicin por peso de
etanol en el destilado de la densidad de tu muestra. La purificacin del etanol y el
agua es limitada debido a que el etanol y el agua forman un azetropo.
Porcentaje de etanol por peso Densidad a 20C Densidad a 25C
(g/mL)
(g/mL)
75
80
85
90
95
100

0.856
0.843
0.831
0.818
0.804
0.789

0.851
0.839
0.827
0.814
0.800
0.785

Cuando elabores el reporte de la prctica acurdate de anotar:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivos.
Introduccin (investigacin).
Resultados con los siguientes puntos: Esquemas y/o fotos.
Discusin de resultados y conclusiones.
o Explique el proceso de fermentacin de sus muestras empelando un
lenguaje bioqumico. Escriba las frmulas completas del proceso
metablico que conduce desde glucosa hasta el etanol y el
,
junto con el balance de energa.
Referencias.

PRCTICA 2
Extraccin de ADN a partir de levadura
OBJETIVO:
Obtener ADN de una muestra biolgica y que el alumno perciba la relacin entre
biologa molecular e ingeniera gentica.

FUNDAMENTO DE LA PRCTICA:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Elabore un esquema de un bioproceso que tenga relacin con ADN
recombinante.
2. Mencione algunos productos alimenticios que hagan uso de levaduras
modificadas genticamente
MATERIAL:

Levadura seca comercial.


Tubos de ensayo.
Probetas de 10 y 50 ml.
Pipetas de 5 ml.
Pipeta Pasteur.
Mortero y pistilo.
Agitador.

REACTIVOS:

Solucin de NaOH 0.2M con 1% de Dodecil sulfato de sodio.


Perclorato de sodio en cristales.
Solucin de cloroformo-alcohol isoamlico
Solucin de NaCl 1M.
Etanol absoluto.

Centrfuga.
Balanza granataria.

EQUIPO:

TCNICA:
1) Pese 15 g de muestra biolgica y colquela en un mortero.
2) Agregue 50 ml de la solucin de NaOH 0.2M con 1% de Dodecil sulfato de sodio.

3) Homogenice bien con el pistilo.


4) Vierta 4 ml del homogenizado en un tubo de centrfuga.
5) Agrege 0.1 g de perclorato de sodio y mezcle bien.
6) Agregue 5 ml de cloroformo-alcohol y mezcle bien.
7) Centrifuge por 20 min a 3000 rpm.
8) Separe el sobrenadante y colquelo en otro tubo de centrfuga.
9) Agregue una cantidad igual de cloroformo-alcohol al sobrenadante.
10) Centrifuge por 20 min a 3000 rpm.
11) Colque el sobrenadante en una probeta de 10 ml.
12) Agregue NaCl 1M (fro). El volumen de NaCl ser la dcima parte del volumen
del sobrenadante en la probeta. Mezcle bien.
13) Agregue etanol absoluto 2.5 veces del volumen obtenido en el paso 12.
14) Mezcle bien con una varilla de vidrio y observe.

No olvides anotar en tu reporte de esta prctica:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivos.
Introduccin (investigacin).
Resultados con los siguientes puntos:
Esquemas y/o fotos.
Discusin de resultados y conclusiones.
Explique la funcin de los reactivos en la prctica.
Referencias.

PRCTICA 3
Elaboracin de yogurt y determinacin de cido lctico
OBJETIVO:
Construir una curva de crecimiento que incluya las fases de latencia, logartmica,
estacionaria y de muerte.

FUNDAMENTO:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Qu es un yogurt?
2. Investigue el proceso de elaboracin de yogurt. Describa cada etapa y elabore
un diagrama de flujo o utilice esquemas.
3. Teniendo en cuenta que el yogurt se elabora a partir de leche cruda, que
contiene una cantidad de grasa variable (dependiendo del tipo de alimentacin
que recibe la vaca, la poca del ao, etc.) cul ser el objetivo de
estandarizar el contenido de grasas de la leche?
4. Teniendo en cuenta que el deterioro de los alimentos se debe a la presencia
de microorganismos que se alimentan de ellos, cul ser el objetivo de
realizar un tratamiento trmico al procesar un alimento?
5. Qu es starter o iniciador en la industria alimenticia?
MATERIAL:

Cubre bocas.
4 Pipetas de 1ml.
1 paquete de Algodn.
Gasas.
Tijeras
Papel de estraza.
3 Matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Termmetro.
1 bureta.
Soporte y pinzas para bureta.

REACTIVOS:
Agua estril.
Benzal.
NaOH 0.1N.
Fenolftalena.

EQUIPO:

Mechero Bunsen.
Estufa de incubacin a 42C (en su defecto un termo).
Parrilla elctrica con control de temperatura.
Autoclave.
Agitador orbital.

OJO: El alumno deber conseguir: (la cantidad debe ser estimada a partir de la tcnica)
leche entera en polvo (nido Nestl), leche descremada en polvo (Svelty, Nestl), 20 g de
azcar, 50 ml de yogurt entero o descremado (comercial) y cucharas de plstico.
Tambin deber traer una bandeja con hielo.
TCNICA:
1) Esterilizar el material (pipetas, matraces, etc) en autoclave a 121C por 15 min.
2) Las siguientes medidas sern por cada matraz. Mezclar en seco 2.5 g de leche
nido y 17.5 g de Svelty con 80 ml de agua hervida a 80 C. Esta combinacin
provee un contenido del 2% de grasa. La mezcla debe ser realizada en un
ambiente estril.
3) La mezcla se homogeniza de 65-70 C con agitacin constante.
4) La pasteurizacin se realiza a 85 C por 30 min e inmediatamente colocar el
matraz en bao de hielo hasta que la mezcla adquiera una temperatura de 45 C.
5) Se utiliza como cultivo iniciador 3 cucharadas de yogurt comercial.
6) Medir el pH inicial.
7) Se incuba a 42C por 8 horas y posteriormente refrigerar hasta su utilizacin
(4C).
8) Medir el pH (deber estar alrededor de 4.5).
9) La determinacin de cido lctico:
a) Coloque 9 ml de yogurt en un matraz Erlenmeyer, unas gotas de fenolftalena.
b) Titular con una solucin de NaOH 0.1N.
c) Detener la titulacin hasta el cambio de color.
NOTA: Para calcular la cantidad de cido lctico presente recuerde que 1 ml de NaOH
es igual a 0.009g de cido lctico, por lo tanto los ml de NaOH gastados sern igual a

los gramos de cido lctico presente, multiplicar los gramos por 100 y expresarlos en %
de cido lctico.
En su reporte de la prctica incluya:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivo.
Introduccin (investigacin).
Resultados con los siguientes puntos:
Esquemas y/o fotos.
Discusin de resultados y conclusiones.
Cul ser el objetivo y el resultado de incubar la leche a 43 C luego de
adicionar las bacterias lcticas? tendr esta etapa el mismo objetivo que
el tratamiento trmico a 90C? Justificar la respuesta.
Cmo se produce el cido lctico a partir del cido pirvico (estructuras
qumicas) y qu usos posee en alimentos?
Explique a qu se debe el pH y consistencia del yogurt obtenido.
Referencias.

Prctica 4
Aislamiento de bacterias productoras de amilasa
INTRODUCCIN
Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidn y que se pueden
obtener a partir de fermentacin por diferentes microorganismos, entre ellos bacterias y
hongos. Estas enzimas tienen diferentes aplicaciones en diferentes industrias como la
de alimentos, panadera, cervecera, etc. Muchos microorganismos se estudian para
determinar cul sera el microorganismo ideal para la produccin industrial de enzimas
a travs de bioprocesos. En esta prctica se utilizarn bacterias aisladas del suelo que
presenten capacidad para la produccin de amilasa.
FUNDAMENTO:
Investigar:
Principales enzimas industriales
Pasos en la produccin de enzimas industriales
Qu son las enzimas?
Enzimas intracelulares y extracelulares
Cintica de actividad enzimtica
Tipos de bioreactores usados en la produccin industrial de enzimas
MEDIO SLIDO DE CULTIVO
MATERIAL
Muestra de suelo
Matraz de Erlenmeyer
Solucin salina
Tubos de ensayo
Cajas Petri
Pipeta
Esptula de Digralsky

Se
prepara
ingredientes:
Peptona

con

los

5g

Extracto de carne 3 g
Almidn

10 g

Agar

20 g

Agua destilada 1000 ml

siguientes

PROCEDIMIENTO:
Preparacin del medio de cultivo.
1. Preparar el medio de cultivo por equipo (150 ml) y esterilizar.
2. Preparar tubos por dilucin serial con solucin salina estril (1 tubo de ensayo con 10
ml de solucin salina y 5 tubos de ensayo con 9 ml de solucin salina) y esterilizar.
3. Tambin esterilizar pipetas y cajas Petri.
Preparacin de muestras por dilucin serial.
4. Se toma un gramo de la muestra de suelo que se va a analizar y se vierte en un tubo
de ensayo que contiene 10 ml de solucin (dilucin de 10-1).
5. Agitar para que los microorganismos se repartan homogneamente y dejar reposar
unos instantes.
6. Se contina haciendo diluciones; tomamos un ml de la dilucin anterior y se vierte en
un tubo de ensayo que contenga 9 ml de solucin salina (dilucin 10-2).
7. Repita el procedimiento hasta alcanzar una dilucin de 10-4.
Sembrado.
8. Vaciar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo esterilizado en cada caja Petri y
permitir solidificar.
9. Despus de que solidifique el agar, agregue 0.1 ml de las muestras de las diluciones
10-2 y 10-4 en el centro del agar de dos cajas Petri debidamente etiquetadas.
10. Inmediatamente extienda las muestras encima de la superficie del agar con la ayuda
de la esptula de Digralsky o una cuchara o esptula estril.
11. Incubar de 35 a 37 C y checar el crecimiento cada 24 horas.
12. Despus de formacin de colonias, vaciar con mucho cuidado la solucin de yodo
sobre la caja Petri hasta cubrir completamente la superficie del agar. Las zonas en
las que an queda el almidn se teirn de un color entre azul y negro. Si las
bacterias han degradado el almidn, aparecern zonas de color claro alrededor de
las colonias.
13. Resembrar a partir de las colonias que muestran un halo de color claro en el medio
de cultivo, en tubos de agar inclinado e incubar entre 35 y 37 C.
14. Despus de que haya crecido la cepa, almacenar en refrigeracin hasta el prximo
experimento.
15. Reporte sus resultados con dibujos, diagramas o fotografas.

21

Prctica 5
Caracterizacin de cepas bacterianas
INTRODUCCIN
La correcta deteccin e identificacin de los microorganismos presentes en muestras es
muy importante por varias razones. La identificacin de bacterias puede basarse en
muchos caracteres como:
Morfologa de las colonias (forma, color, consistencia, bordes, etc.)
Morfologa celular (forma de bacilos, de cocos, etc., y de agrupamientos en
diplococos, estreptococos, etc.)
Tincin (Gram, endoesporas, cido-alcohol resistente, etc.)
Fisiologa (aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos)
Condiciones ptimas de crecimiento
Pruebas bioqumicas (presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta
metablica, fermentacin de carbohidratos, etc.)
Tcnicas moleculares (sendas para hidridacin o para amplificacin en PCR,
anlisis filognico mediante secuenciacin de 16 S ARNr)
Mtodos de identificacin tradicionales:
Aislamiento de cepa en medio slido
Purificacin de cepa bacteriana
Tincin de Gram
Microscopa
Pruebas bioqumicas
OBJETIVO
El objetivo de la prctica es aplicar algunos mtodos de crecimiento, tincin y pruebas
bioqumicas para identificar adecuadamente una cepa bacteriana.
FUNDAMENTO
Investigar:
Morfologas ms importantes de los microorganismos ms usados en bioprocesos
Tcnicas de tincin ms usadas en bioprocesos
Pruebas bioqumicas para identificar microorganismos productores de enzimas
Pruebas bioqumicas para identificar microorganismos fermentativos
PROCEDIMIENTO:
Preparacin de observacin en fresco a partir de cultivos en medios lquidos

22

1. Cargar el asa bacteriolgica con una gota de cultivo en medio lquido y


depositarla en el portaobjetos. Cubrirla con un cubreobjetos procurando que
no queden burbujas de aire.
2. A partir de los cultivos en medio slidos colocar una gota de agua sobre el
portaobjetos con ayuda del asa. Cargar el asa estril con una pequea
cantidad de bacterias de una colonia y resuspenderla en la gota de agua.
3. Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersin
(asegrese de aadir una gota de aceite de inmersin, y observar motilidad y
caractersticas morfolgicas.
4. Prepare una tincin de gram de la muestra a partir de cultivos en medio lquido
o medio slido. Proceda como en el caso de la preparacin fresca.
5. Extender la suspensin con el asa hasta conseguir una capa fina.
6. Secar la preparacin a la llama del mechero, evitando que se caliente
demasiado, para no afectar la estructura y forma normal de los
microorganismos, puede comprobar con el dorso de la mano que an no est
caliente.
7. Una vez seca la preparacin proceda a fijar la muestra haciendo pasar 3-4
veces por la llama del mechero. La flama debe tocar la parte inferior del
portaobjetos.
8. Proceda a la tincin de Gram y posteriormente obsrvela.
9. Reporte sus resultados con ilustraciones o fotografas.

23

Prctica 6
Determinacin de una curva de crecimiento de bacterias productoras de amilasa
INTRODUCCIN
Las fases de crecimiento de una poblacin bacteriana pueden determinarse midiendo la
turbidez del cultivo. Aunque dicha turbidez no es una medida directa del nmero de
clulas, su incremento es una indicacin del crecimiento bacteriano. Para estas
determinaciones se utiliza un espectrofotmetro, en el cual la luz pasa a travs del
cultivo bacteriano hasta alcanzar una clula fotoelctrica conectada a un galvanmetro.
A medida que la concentracin celular aumenta, el cultivo se hace ms turbio y se
reduce la cantidad de luz transmitida hacia la celda fotoelctrica. El cambio de la
intensidad de luz se registra en el espectrofotmetro como porcentaje de transmisin
(cantidad de luz transmitida) y absorbancia o densidad ptica (DO).
Cuando se inocula una pequea poblacin bacteriana en un medio de cultivo lquido
adecuado, generalmente el crecimiento no comienza inmediatamente, sino que hay un
perodo de latencia. Una vez que empieza el crecimiento, se observa un incremento
exponencial en la densidad celular, que corresponde a la fase exponencial de
crecimiento. Esta fase es la ms significativa en el ciclo de crecimiento de los
microorganismos y se caracteriza porque los parmetros cinticos del crecimiento (, q)
se mantienen constantes. A medida que el crecimiento avanza, la concentracin de los
nutrientes esenciales disminuye y se acumulan los productos finales del metabolismo,
hasta que el crecimiento llega a detenerse, de modo que el cultivo entra en la fase
estacionaria. Despus las clulas lentamente mueren, lisndose en algunos casos, en
una ltima fase de muerte celular.
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es definir las fases de crecimiento en una cepa bacteriana
aislada anteriormente., mediante la absorbancia de la suspensin celular a diferentes
tiempos de incubacin.
FUNDAMENTO
Investigar:
Cintica de crecimiento microbiano
Determinacin de la velocidad de crecimiento microbiano
Determinacin de la densidad celular de los cultivos por mtodos directos e
indirectos
Determinacin de masa celular
Cuantificacin de la cintica de crecimiento en lote
Cuantificacin de la cintica de crecimiento en cultivos continuos
24

PROCEDIMIENTO:
Preparacin del inculo
1. Se siembra un tubo con 10 ml de medio lquido que contenga almidn, con la cepa
bacteriana aislada y se incuba a 37C con agitacin de ser posible a 100 r.p.m. durante
15-20 hrs.
2. A partir de ese cultivo reciente, sembrar con una pipeta estril un volumen determinado
en un matraz con 25 ml del mismo medio de cultivo lquido y se mide la DO en el
espectrofotmetro. Esta medida corresponde al tiempo 0.
3. Colocar el matraz en una incubadora orbital a 37C y 180 r.p.m. la DO debe medirse
cada 60 minutos por 24 horas, teniendo cuidado de agitar bien el matraz antes de tomar
las medidas.
Medidas del crecimiento en espectrofotmetro
4. Encender el espectrofotmetro manteniendo 10 minutos de precalentamiento antes de
realizar la lectura.
5. Fijar la longitud de onda a 600 nm, para absorbancia mxima de la cepa y mnima del
medio de cultivo.
6. Para calibrar el aparato primero fijar la absorbancia en 0 con el testigo de medio de
cultivo limpio sin inocular.
7. Para medir las muestras, tomar 3 ml de cultivo bien homogeneizado en un tubo y situarlo
en el lugar de las muestras. Anotar la absorbancia.
8. Construir la curva de crecimiento con los datos obtenidos.
9. Reportar sus resultados con dibujos, esquemas, grficas y fotos. Haga una buena
discusin de resultados.

25

Prctica 7
Optimizacin de las condiciones de pH y temperatura para el crecimiento
bacteriano
INTRODUCCIN
Las variaciones de pH y temperatura provocan diferentes efectos sobre los
microorganismos. Una bacteria sometida a un pH o temperatura superior o inferior a la
que normalmente crece, sufre, en primer lugar, daos en sus protenas y cidos
nucleicos. Estos primeros daos impiden que la bacteria se reproduzca y por
consiguiente, formen una colonia sobre el medio de cultivo adecuado.
FUNDAMENTO
Investigar:
Efecto letal y subletal de los cambios de pH y temperatura y clasificacin de los
microorganismos de acuerdo a las temperaturas y pH de crecimiento.
Nombres de los principales microorganismos termfilos usados en la industria de
alimentos y sus productos.
Mtodos de regulacin del pH y temperatura en biorreactores de mesa.
Mtodos de regulacin del pH y temperatura en los biorreactores industriales.
Mtodos de determinacin de la actividad de la amilasa
OBJETIVO
Encontrar de forma prctica los rangos de pH y temperatura ptimos para el crecimiento
de la cepa bacteriana productora de amilasa.
MATERIALES
Pipetas estriles
Matraces Erlenmeyer
Tubos de ensayo
Cepa bacteriana productora de amilasa
Medio de cultivo usado en la prctica 4 como medio lquido.
TECNICA
1. Preparar matraces con el medio de cultivo lquido (por duplicado) y esterilizar.
2. Inocular con la cepa bacteriana.
3. Los equipos del 1 al 3 preparar el medio de cultivo lquido con diferente acidez, (pH = 5,
pH = 9, pH = 11). Se incuban a 37C por 24 horas.

26

4. Los equipos 4 al 6 deben preparar matraces (por duplicado) con medio lquido con un pH
de 7 para incubar a diferentes temperaturas: 40C, 55C y 60C. se incuban por 24
horas.
5. (Adems todos los equipos deben preparar sus cajas Petri con medio slido con un pH
de 7 para el conteo de la poblacin bacteriana despus de cada tratamiento.)
6. Despus de 24 horas, tomar 1 ml de muestra y preparar diluciones seriales hasta 10 -6 en
solucin salina.
7. A partir de la dilucin 10-4, 10-5, 10-6, tomar 1 ml de muestra con una pipeta estril y
vaciar en caja Petri estril (por duplicado).
8. Vaciar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo estril en cada una de las cajas Petri
que continen la muestra.
9. Los equipos 1, 2 y 3 debern incubar a 37 C y los equipos 4, 5 y 6 debern incubar a la
temperatura que usaron. Pero todos incubarn por 24 horas.
10. Contar las unidades formadoras de colonias y checar el crecimiento a las 24 horas y 48
horas.
11. Reporte sus resultados con esquemas y discusin de resultados.
12. Proponga un mtodo para determinar la actividad de la amilasa.

27

PRCTICA 8
Cultivo de hongos comestibles

OBJETIVO:
Analizar el cultivo de hongo comestible como un ejemplo de biotransformacin en
sustrato slido.

FUNDAMENTO:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Investigue porqu la produccin de hongos comestibles se considera como un
bioproceso.
2. Cules son las especies de hongos comestibles ms utilizadas en Mxico?
3. Describa el ciclo de vida del Pleurotus ostreatus.
4. Qu sustratos se pueden emplear para su cultivo?
5. Qu es el micelio y el micelio activado?
6. Qu es una cepa?
MATERIALES:
Bscula granataria.
Autoclave.
Mechero bunsen
Cajas petri.
Papel aluminio.
Papel filtro o papel bond.
Pinzas de diseccin.
2 Matraces Erlenmeyer de 1 litro.
Agua destilada o purificada.
Vaso de precipitado de 2 litros.
Recipiente de plstico grande con tapa.
Material biolgico
Tres o cuatro ejemplares frescos de hongo seta

REACTIVOS:
Papa 200 g.
Agar-agar 15 g.
Glucosa 20 g.
Levadura 2 g.
28

EQUIPO:
Estufa con temperatura de entre 25-28C.

TCNICA:
Procedimiento del medio de cultivo (primera parte):
1) Pelar, cortar, lavar y poner a hervir la papa en 500 ml de agua destilada durante
25 min.
2) Se decanta la papa y se extrae el extracto, el cual se filtra.
3) Se agregan los otros ingredientes y se completa el volumen de un litro.
4) Se calienta a fuego lento moviendo constantemente durante 2 min hasta que
queden totalmente disueltos.
5) El medio de cultivo se transfiere a los matraces Erlenmeyer y se tapa con papel
aluminio. Se esteriliza en autoclave a 15 lb de presin por 15 min. Nota:
aproveche y esterilice el papel filtro o bond.
6) En condiciones de asepsia (con ayuda del mechero) el medio de cultivo tibio se
vierte a las cajas Petri y se deja solidificar.
7) Se dejan en la estufa a 27C por 24 horas y al final seleccionar las cajas no
contaminadas.
Aislamiento por medio de esporas:
1) El hongo a utilizarse, debe ser lavado con una solucin de hipoclorito de sodio al
5%.
2) Con ayuda del mechero y con los materiales esterilizados, se crea una zona de
absoluta asepsia.
3) En una caja de Petri y con ayuda de una pinza estril, se coloca el papel filtro
(previamente esterilizado).
4) Se coloca el sombrero del hongo con las lminas hacia abajo sobre el papel para
obtener la esporada.
5) Para evitar evaporacin y contaminacin, el hongo y el papel se tapan con un
recipiente limpio y se deja reposar por 8 horas.

29

Recuerde que en su reporte de la prctica, debe incluir:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivos.
Introduccin (investigacin).
Resultados con los siguientes puntos:
Esquemas y/o fotos.
Discusin de resultados y conclusiones.
a. Cmo se clasifican los medios de cultivo y a cul pertenecera el elaborado en
el laboratorio?
b. Qu nutrientes o funin aporta la papa, agar-agar, glucosa y levadura?
c. Qu microorganismo pueden utilizar ste medio de cultivo?
d. Qu es una espora y a qu se le llama esporada?
Referencias.

30

PRCTICA 9
Actividad enzimtica por microorganismos
OBJETIVO:
Evaluar la presencia de microorganismos en la leche mediante el efecto de su actividad
enzimtica sobre la reduccin de azul de metileno.

FUNDAMENTO:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Qu es una enzima?
2. Menciona al menos tres aplicaciones de las enzimas en la industria alimentaria.
3. Define cintica enzimtica.
4. Explica el modelo de Michaelis-Menten.
5. Describe la clasificacin de las enzimas.
6. Mencionar al menos tres factores que causan
MATERIALES
18 tubos de ensayo con tapn de caucho.
Tapones de caucho.
Bao mara.
Vaso de precipitado de 500 ml.
3 Matraces Erlenmeyer de 50 ml.
3 Tapones horadado.
Tubos de vidrio.
Manguera.
3 Pipetas de 10 ml.
Papel aluminio.
Mechero bunsen.
Material biolgico:
100 ml de leche en caja.
100 ml de leche bronca (refrigerada una noche antes).
100 ml de leche bronca sin refrigerar (una noche antes).
REACTIVOS:
Azul de metileno en polvo.
Alcohol 96
Agua oxigenada de 3 a 4% (Conseguida por el alumno).

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EQUIPO:
Parrilla elctrica.
Autoclave.
Estufa a 37C.
TCNICA:
Actividad de la Reductasa:
Mtodo A.
1) Esterilizar todo el material de vidrio y los tapones.
2) Diluya 5 mg de azul de metileno en 100 ml de agua (para todo el grupo).
3) En un tubo de ensayo estril (se har por triplicado), se vierte aspticamente 10 ml
de leche y 1 ml de solucin de azul de metileno.
4) Se tapona el tubo y se calienta a 37C durante un tiempo no superior a 5 min.
5) Se realizan varias inversiones del tubo para asegurar la distribucin uniforme y se
incuba a 37C con el tubo en posicin vertical y protegido de la luz.
6) Cada media hora se distribuye la muestra por inversin de los tubos, de manera
suave para evitar la incorporacin de oxgeno.
7) Observe la reduccin del azul de metileno al pasar de color azul a incoloro.
8) La toma del tiempo de reduccin se har desde la puesta en incubacin hasta que se
decolore. La primera observacin se har cada 15 min.
Categora

Calidad de la leche

Tiempo de reduccin

Buena

Ms de 4.5 h

II

Aceptable

2 a 4.5 h

III

Mala

20 min a 2 h

IV

Muy mala

Menos de 20 min

Mtodo B.
1) En 5 ml de alcohol, diluya polvo de azul de metileno hasta saturacin. Posteriormente
diluya stos 5 ml en 195 ml de agua destilada (para todo el grupo).
32

2) En un tubo de ensayo estril (se har por triplicado), se vierte aspticamente 20 ml


de leche y 0.5 ml de solucin de azul de metileno.
3) Se tapona el tubo y se calienta a 37C durante un tiempo no superior a 5 min.
4) Se realizan varias inversiones del tubo para asegurar la distribucin uniforme y se
incuba a 37C con el tubo en posicin vertical y protegido de la luz.
5) Cada media hora se distribuye la muestra por inversin de los tubos, de manera
suave para evitar la incorporacin de oxgeno.
6) Observe la reduccin del azul de metileno al pasar de color azul a incoloro.
7) Los resultados se interpretarn de acuerdo a la siguiente tabla:

Tiempo de Reduccin

Calidad de la leche

No. De microorganismos

Ms de 7 h

Muy buena

Menos de 20 000

Ms de 5 h

Buena

Menos de 50 000

Ms de 4 h

Satisfactoria

Menos de 100 000

Ms de 2 h

Menos de 1 milln

Mediocre

Menos de 20 min

Menos de 20 millones

Mala

Actividad de la Catalasa:
1) En un matraz se vierte 20 ml de leche y se atempera a en bao mara a 30C durante
15 min.
2) Se agrega 5 ml de agua oxigenada y se vuelve a sumergir en el bao.
3) Se coloca un tapn horadado con un tubo de vidrio y conectado a un bao de agua.
4) Analizar en cul muestra de leche se presenta mayor liberacin de oxgeno.

Elabore su reporte de acuerdo a los lineamientos establecidos.

33

PRCTICA 8
Biotransformacin de la leche por accin enzimtica
OBJETIVO:
Analizar el proceso enzimtico involucrado en la biotransformacin de la leche a
queso.

FUNDAMENTO:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Menciona al menos tres ejemplos de microorganismos productores de alguna
enzima cuya aplicacin haya sido aceptada como aditivo en alimentos.
2. Menciona cuatro ejemplos de enzimas y su actividad enzimtica en el rea de
alimentos.
3. Qu es una enzima inducible y a qu se refiere la represin catablica?
4. En qu consiste la inmovilizacin de enzimas y su aplicacin en la industria.
MATERIALES
12 tubos de ensayo con tapn de caucho.
Bao mara.
Vaso de precipitado de 500 ml.
Material biolgico
100 ml de leche Ultrapasteurizada.
100 ml de leche pasteurizada.
100 ml de leche Bronca.
Renina (conseguida por el alumno).
REACTIVOS
Solucin de cuajo al 25% con agua destilada.
Solucin de CaCl2 al 20%.
EQUIPO:
Parrilla elctrica.

TCNICA:
1) Medida de la actividad coagulante:
2) En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de leche, 0.2 ml de Cl 2Ca y un volumen
mximo de 0.3 ml de solucin de enzima.
34

3) Llevar el tubo a bao mara a 37C y medir el tiempo necesario para que comience la
coagulacin, que se detecta por agitacin de la mezcla de incubacin con una varilla
de vidrio, inclinando el tubo. Se eleva la varilla sobre el nivel del lquido, rozando la
pared del tubo y se observa en el lquido que cae sobre la pared, la aparicin de
pequeos cogulos.
Efecto del tratamiento trmico:
1) En tres tubos coloque 8 ml de leche bronca (sin tratamiento trmico), pasteurizada y
ultrapasteurizada, respectivamente.
2) Incube en bao mara a 35C por 10 min y agregue 0.5 ml de cuajo.
3) Mida el tiempo de coagulacin
4) Agregue 0.5 ml de CaCl2 a las muestras que no coagulen y mida el tiempo.
Efecto de la temperatura de incubacin:
1) En cuatro tubos, coloque 8 ml de leche pasteurizada e incube a 4C (tubo 1), 20C,
35C y 60C, por 15 min.
2) Al tubo uno se le agrega 0.5 ml de cuajo y se incuba a 4C por hora y media.
3) Despus de la incubacin, se agrega 0.5 ml de cuajo.
4) Mida el tiempo de coagulacin.
Efecto de la temperatura de la concentracin de enzima:
1) En cuatro tubos coloque 8 ml de leche pasteurizada e incube a 35C por 15 min.
2) Posteriormente agregue solucin de cuajo en volmenes de 0.25, 0.75, 1.3 y 1.8 ml,
respectivamente.
3) Mida el tiempo de coagulacin.

En su reporte, adems de los lineamientos generales ya establecidos, discuta los


resultados con base en stas grficas.
1) Representar el tiempo de coagulacin en funcin del tratamiento trmico.
2) Representar el tiempo de coagulacin en funcin de la temperatura de
incubacin.
3) Representar el tiempo de coagulacin en funcin de la cantidad de solucin de
enzima.
Referencias: Tres libros y una fuente de internet.
35

PRCTICA 9
Produccin de hongos comestibles
OBJETIVO:
Aprender a preparar dos medios de cultivo para el hongo del gnero Pleurotus

FUNDAMENTO:
Investigacin antes de la sesin de laboratorio.
1. Investigue ejemplos de hongos comestibles en el mundo sealando la
especie, nombre comn y distribucin geogrfica.
2. Investigue al menos 10 ejemplos de hongos comestibles en Mxico sealando
el nombre cientfico y el nombre comn.
3. Con base en la obtencin de energa y carbono, explique cmo se clasifican
los hongos.
4. De todos los tipos de hongos comestibles, cules son los nicos que se
cultivan artificialmente.
5. Algunos hongos necesitan un sustrato que debe ser sometido composteo.
Qu es el composteo y en qu consisten sus dos fases?
MATERIALES:
Algodn, gasa y una coladera de poro chico.
40 tubos de ensayo con tapn de rosca, o de algodn y gasa, unos 40 frascos
de penicilina.
REACTIVOS:
100 g de papas.
25 g de Dextrosa.
100 g de grenetina o 100 g de agar.
1500 ml de agua hervida, electropura o filtrada.
30 g de harina de maz.
EQUIPO:
Autoclave
Parrilla de calentamiento.

TCNICA:
Procedimiento del medio de cultivo papa-dextrosa-agar:
1) Pelar y cortar en rodajas 100 g de papa. Posteriormente ponerla a hervir en 250 ml
de agua durante 50 min.
36

2) Dejar asentar las papas y colar a travs de 2 capas de algodn con gasa o con una
coladera de poro chico.
3) En 250 ml de agua disolver 50 g de grenetina 20 g de agar en caliente. Agregue
poco a poco la grenetina hasta que se disuelva.
4) Mezcle las soluciones de los pasos 2 y 3. Mezclar perfectamente.
5) Agregue 10 g de dextrosa y agitar hasta disolucin total.
6) Agregue agua al matraz hasta que se tenga un volumen final de 500 ml. En caliente.
7) Vierta la solucin del paso 6 en frascos de penicilina o tubos de ensayo a la mitad de
su capacidad antes de que la solucin empiece a solidificar. Verter tantos frascos o
tubos como le sean posibles.
8) Tapar los frascos con pequeos tapones hechos de algodn.
9) Prepare la autoclave y esterilice los viales a 15 libras de presin por 15 min.
Procedimiento del medio de harina de maiz
1) En 500 ml de agua, diluir 30 g de harina y hervir a fuego lento de 30 a 60 min.
2) Colar la solucin con algodn y gasa o con una coladera de poro chico.
3) Agregue 20 g de grenetina 7.5 g de agar y disuelva perfectamente. Agregue poco a
poco.
4) Agregue 10 g de dextrosa y disuleva perfectamente.
5) Agregue agua al matraz hasta que se tenga un volumen final de 500 ml. En caliente.
6) Vierta la solucin del paso 5 en frascos de penicilina o tubos de ensayo a la mitad de
su capacidad antes de que la solucin empiece a solidificar. Verter tantos frascos o
tubos como le sean posibles.
7) Tapar los frascos con pequeos tapones hechos de algodn.
8) Prepare la autoclave y esterilice los viales a 15 libras de presin por 15 min.
Una vez que han sido esterilizados, se retiran los viales y se colocan dentro de bolsas de
polietileno (para evitar su desecacin) en un lugar limpio (asptico) procurando que
estos queden inclinados. Dejar enfriar a temperatura ambiente para su utilizacin.

Reporte de la prctica: Ser hasta que se complete la parte dos.


37

PRCTICA 9 (Parte dos)


Produccin de hongos comestibles
OBJETIVO:
Realizar el aislamiento de cepa mediante el mtodo vegetativo.
MATERIALES:
Mechero bunsen.
Bistur o navaja de punta fina.
Viales con medio de cultivo y tapn de algodn.
Etiquetas adhesivas.
Material biolgico

Dos ejemplares frescos de hongo seta (especialmente el sombrero cuerpo


fructfero), recolectados el mismo da o dos das antes pero mantenidas dentro de
bolsas de polietileno y en el refrigerador.

TCNICA:
1) Mantenga una rea completamente asptica.
2) Se esteriliza el bistur a la flama.
3) Se enfra agitando al aire.
4) Se toma el hongo y se parte con las manos cerca de la flama, evitando tocar las
partes internas.
5) Se toma un fragmento de la carne del hongo con el bistur, cerca de la flama.
6) Se quita el tapn de algodn del vial con el medio de cultivo- con el dedo meique,
cerca de la flama.
7) Se introduce el fragmento del hongo en el frasco con el medio de cultivo, sin tocar las
paredes del mismo. La inoculacin se hace cerca de la flama.
8) Se coloca el tapn de algodn en el vial, flameando previamente la parte del algodn
que entrar en el vial.
9) Etiquete el frasco anotando el tipo de medio de cultivo, la fecha de inoculacin, el
nombre del hongo y la clave de la cepa.
10) Coloque el frasco en un lugar con poca luz (ms o menos obscuro) y de temperatura
constante (17-23C) para la incubacin.

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11) Observe el crecimiento del micelio cada da por 5 a 15 das. Sin agitar los tubos en
demasa, tome fotografas.
12) Si se observan manchas verdes, blancas, cremosas o amarillas sobre el medio de
cultivo, stos debern desecharse lo ms rpido posible y alejarse del resto de los
frascos, (nunca deben abrirse en el lugar de incubacin y de trabajo).
13) La cepa obtenida en esta prctica servir para la elaboracin del micelio activado en
las siguientes prcticas de laboratorio.

No olvide anotar en su reporte de la prctica:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivos.
Introduccin (investigacin).
Resultados con los siguientes puntos:
1) Esquemas y/o fotos.
Discusin de resultados y conclusiones.
Referencias.

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PRCTICA 10
Biorreactores
OBJETIVO:
Conocer y distinguir por sus caractersticas los diferentes tipos de reactores
utilizados en la biotecnologa.
MATERIALES:
Biorreactores de diferente capacidad
Fuentes bibliogrficas
Visitas
PROCEDIMIENTO:
1. Para la sesin de introduccin de esta prctica el alumno deber haber
consultado en todas las fuentes posibles el tipo de biorreactores que se emplean
a nivel laboratorio, planta piloto y nivel industrial.
2. Se mostrarn a los alumnos los diversos tipos de biorreactores de nivel
laboratorio y planta piloto dentro de las intalaciones de la Facultad de Ciencias
Qumicas para el estudio de sus componentes.
3. Tambin se propone visitar una planta de tratamiento de agua de la zona.
4. Para el reporte de la prctica, se debern considerar los siguientes puntos para
cada uno de los reactores identificados:

Tipo de reactor.
Capacidad.
Caractersticas geomtricas (incluyendo esquema del biorreactor)
Sistema de carga y descarga.
Sistema de agitacin del lquido de reaccin.
Patrones de flujo
Sistema de aireacin.
Sistema de control (incluyendo sistema de enfriamiento)
Mtodo o forma de esterilizacin de:
o Medios de cultivo
o Reactor (incluyendo la limpieza)
o Aire
o Aditivos de fermentacin (cidos, lcalis, antiespumante, etc.)
Mtodos de cultivo que se lleve a cabo en el biorreactor:
o Lote
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o Lote alimentado
o Cultivo continuo
Produccin.
Dispositivo de toma de muestras y de inoculacin.

BIBLIGRAFA:
1. Bull, D.N., Thoma, R.W., Stinnett, T.E. 1983. Bioreactors for submerged culture.
Adv. Biotechnology Process. 1:1.30
2. Charles, M. 1985. Fermentation scale-up: problems and possibilities. Trends in
Biotechnology.
3. Sitting, W. 1983 Fermentation reactors. Chem Tech. 13: 606-613.
4. Shuler M.L. y Hargi F. Bioprocess Engineering, Prentice Hall, USA., 2002.
5. Bailey J.E. y Ollis D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd edition.
McGraw-Hill, New York, 1986.
6. Doran, Pauline M. Bioprocess engineering principles. Academic Press, 1995.
7. Scragg A. H. Biotecnologa para ingenieros. Sistemas biolgicos en procesos
tecnolgicos. Limusa, Mxico D. F., 2011.

41

PRCTICA 11
Instrumentacin para el seguimiento y control de los biorreactores
OBJETIVO:
El alumno manejar los sistemas de medicin y control de variables de operacin
de biorreatores de tanque agitados, a travs de las determinaciones en lnea de la
temperatura, pH, oxgeno disuelto y espuma.

MATERIALES:
Biorreactor tipo tanque agitado
Sistema de medicin y control de temperatura
Sistema de medicin y control de pH
Sistema de medicin y control de oxgeno disuelto
Sistema de medicin y control de espuma
Tanque de nitrgeno puro con vlvula de control de presin y de flujo
Vasos de precipitado de 250 ml, 500 ml y 2000 ml
Probetas de 1000 ml
Mangueras de silicn para bombas peristlticas
REACTIVOS:
Solucin de NaOH 0.5 N
Solucin de HCl 0.5 N
Antiespumante Mazu al 10% v/v en agua
Solucin proteica o un detergente
PROCEDIMIENTO:
1. Medir las dimensiones de todas las partes del biorreactor.
2. Consultar los manuales de operacin tanto del biorreactor como de los equipos de
medicin y control que se utilizarn.
3. Identificar, en el biorreactor, los sistemas de medicin y control de temperatura,
pH, oxgeno disuelto y espuma.
4. Llenar el biorreactor con agua de la llave o con una solucin proteica o de
detergente.
5. Calibrar los electrodos de temperatura, pH y oxgeno disuelto.
6. Establecer las condiciones de operacin. (siga las instrucciones del titular)
7. Establecer la velocidad de agitacin del biorreactor siguiendo las indicaciones del
manual de operacin del equipo.

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8. Encender el equipo de medicin y control y verificar que el valor del pH que


registra el mismo sea igua que el de la muestra tomada del biorreactor y medida
fuera de lnea.
9. De no ser as ajustar el equipo de acuerdo a las indicaciones del manual.
10. Ajustar el pH a un valor de 5 con una disolucin de cido clorhdrico 0.5 N y
establece el valor del Set Point de 5.
11. El equipo de medicin y control de pH debe tener acoplado el sistema de adicin
de lcali de una bomba peristltica capaz de agregar al biorreactor una solucin
de NaOH 0.5 N de acuerdo a la seal del controlador.
12. Agregar al biorreactor 10 ml de una disolucin de HCl 0.5 N con objeto de simular
una biorreaccin acidognica (disminuye el valor del pH conforme pasa el
tiempo). Observe como el controlador enviar unaseal a la bomba peristltica
para adicionar el lcali. La bomba dejar de funcionar (de adicionar el lcali)
cuando el pH alcance el Set Point de 5.
13. Agregue al biorreacgtor 1 litro de agua aa temperatura ambiente (25 C) y
establezca una velocidad de agitacin de 300 rpm, ayudados por el titular del
laboratorio.
14. Verifique que las vlvulas del circuito de circulacin del agua de enfriamiento a
travs de la chaqueta estn abiertas y encienda el equipo de medicin y control
de la temperatura que consta del sensor RTD, cables, medidor y controlador,
adems de la bomba de agua fra.
15. Establezca en el controlador de temperatura un valor de Set Point de 33C.
16. Encienda la bomba de circulacin del agua y espere hasta que la temperatura en
el interior del biorreactor alcance la temperatura del Set Point.
17. Agregue al biorreactor 1 litro de agua a temperatura ambiente (25 C) y
establezca una velocidad de agitacin de 300 rpm.
18. Establezca un flujo de aire a un valor de 0.5 vvm (verifquelo con el rotmetro).
19. Encienda el equipo de medicin de oxgeno disuelto y espere unos 15 minutos
hasta que la lectura permanezca estable. Con este valor establezca en el equipo
el 100 % del valor de saturacin.
20. Ayudados por el titular, conecte un tanque de nitrgeno puro al sistema de
introduccin del aire del biorreactor y haga pasar un valor de flujo de nitrgeno tal
que no sobrepase los 0.75 vvm totales (verifique con el rotmetro), con el objeto
de disminuir la presin parcial de oxgeno en el aire.
21. Esto provocar que la concentracin de oxgeno disuelto sea menor cuando se
burbujea aire solamente.
22. Cierre completamente el suministro de nitrgeno y observe como regresa al valor
de 100% de oxgeno disuelto.
23. Reporte sus resultados.

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No olvide anotar en su reporte de la prctica:

Nombre y nmero de la prctica.


Objetivos.
Introduccin (investigacin).
Resultados con los siguientes puntos:
2) Esquemas y/o fotos.
Discusin de resultados y conclusiones.
Referencias.

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