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2005/2006
BCM / BCI
2005/06
1
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28 Set 30 Out
3 7 Out
10 14 Out
17 21 Out
24 28 Out
31 Out 4 Nov
7 11 Nov
14 18 Nov
21 25 Nov
28 Nov 2 Dez
5 Dez 9 Dez
12 - 16 Dez
4 feriado, 5 e 6 no h aulas
N de aulas previstas: 11
Limite de faltas : 4
Exames
Dispensas: s tm direito a dispensa os alunos que obtiveram frequncia nas aulas prticas
do ano lectivo transacto de 2004-05.
BCM / BCI
2005/06
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BCM / BCI
2005/06
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Material de laboratrio 1
Material de laboratrio
Ver: http://newton.dep.anl.gov/york/listing.html
Gobel
Matrazes ou Erlenmeyers
- utilizados para colocar e armazenar solues (no so utilizados para medir volumes com rigor, a
sua escala aproximada)
Pipeta
Bales volumtrico
Provetas
BCM / BCI
2005/06
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Material de laboratrio 2
Tubos de ensaio
Tubos Falcon
Ajuste do volume
Microtubos (Eppendorfs)
Mostrador do volume
Micropipetas automticas
Pontas para as micropipetas
- utilizadas para medir volumes pequenos com elevada preciso
Placa da Petri
- utilizadas por ex. para cultura de clulas
Almofarizes
- para homogeneizar material biolgico
Concentrao
Data
BCM / BCI
2005/06
5
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Material de laboratrio 3
BCM / BCI
2005/06
6
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Material de laboratrio - 4
BCM / BCI
2005/06
7
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Material de laboratrio - 5
Manejo da micropipeta
(http://www.fhcrc.org/education/hutchlab/lessons/use.htm)
2 Ajuste para o
volume desejado
4 Pressione o mbolo at
ao primeiro STOP
5 Coloque a extremidade
da ponta dentro do lquido
6 Liberte o mbolo
lentamente
7 Coloque a ponta
prxima do fundo do
novo tubo
8 Pressione o mbolo at
ao segundo e ltimo STOP
9 Retire a ponta do
tubo e depois liberte a
presso no mbolo
BCM / BCI
2005/06
8
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Normas de segurana 1
BCM / BCI
2005/06
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Normas de segurana 2
H Lot Number
I Hazard Pictogram
Lets you know at a glance what safety hazards are involved in the use of this product.
J Further Hazard Information
More complete description of actual hazards, handling precautions, and emergency management
procedures.
K CAS Number
Chemical Abstract Service number shown wherever available. CAS numbers vary in how
specifically they define the material. We make every effort to provide the most specific CAS
number which applies. Where a CAS number is provided for a mixture or solution, it is usually the
CAS number of the solute or component referred to in the main label name.
L Chemical Formula and Formula Weight
Unless water of hydration is indicated in the formula, the formula weight is for the anhydrous
material.
M Bar Code and Eye Readable Equivalent
The bar code and the eye readable equivalent of the bar code are for Sigma internal use and label
identification.
N Risk and Safety Numbers
O Material Safety Data Sheet Available
A Material Safety Data Sheet is available for this product.
P EC Number
This product has been identified with an EC number (EINECS or ELINCS). Those products without
an EINECS number will carry the warning statement, "Caution-Substance Not Yet Fully Tested."
Pictograms
Pictograms are based on widely accepted standards.
Explosive
Oxidizing
Flammable
Toxic
Harmful or Irritant
Corrosive
Biohazard
Hazard Codes
B
C
E
F+
F
Xn
Xi
Biohazard
Corrosive
Explosive
Extremely Flammable
Highly Flammable
Harmful
Irritant
N
O
R
T
T+
BCM / BCI
2005/06 10
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Solues
Uma soluo uma mistura homognea de duas ou mais substncias qumicas puras, entendendose por homogneo uma aparncia uniforme ao microscpio ptico.
Numa soluo considera-se o(s) soluto(s) e o solvente. O soluto apresenta as suas molculas
dispersas no solvente. Considera-se como solvente a substncia que confere o estado fsico
soluo, a substncia que estiver em maior proporo caso o estado fsico de soluto e solvente seja
o mesmo, ou a substncia mais voltil se para alm do mesmo estado fsico as duas substncias
estiverem na mesma proporo. Se a gua estiver presente, esta sempre considerada como
solvente.
Uma soluo caracterizada pela natureza de soluto e solvente - propriedades qualitativas, e pelas
propores relativas de soluto e solvente - propriedades quantitativas ou concentrao.
A concentrao de uma soluo consiste na relao entre a quantidade de soluto e solvente
presentes na soluo e pode exprimir-se em:
Percentagem (p/p, p/v ou v/v)
% (p/p) gramas de soluto por 100 gramas de soluo
% (p/v) gramas de soluto por 100 mililitros de soluo
% (v/v) mililitros de soluto por 100 mililitros de soluo
Molaridade (M)
M n de moles de soluto por litro de soluo
Molalidade (m)
m n de moles de soluto por quilograma de solvente
Partes por milho (ppm)
ppm partes de soluto por 1 milho de partes de soluo ( mg L-1)
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1 L = 103 mL (1000 mL)
1 mL = 10-3 L
1 L = 10-6 L
1 nL = ___ L
1 L = 106 L
1mL = 103 L
1 L = 10-3 mL
1 nL = ___ mL
1 L = 109 nL
1mL = 106 nL
1 L = 103 nL
1 nL = ___ L (COMPLETE)
BCM / BCI
2005/06 11
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Solues e concentrao de uma soluo 2
BCM / BCI
2005/06 12
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Solues e concentrao de uma soluo 3
Como o cido actico um lquido, temos que calcular qual o volume do cido actico 95%
que corresponde aos 3,16 gramas.
1L = 1,05 kg (significa que a densidade = 1,05)
se 1L = 1,05 kg ento 1 mL = 1,05 g
1 mL ---------1,05g
V mL --------3,16 g
OU:
d = 1,05 = massa (g) / volume (mL)
1,05 = 3,16 g / V
1,05 x V = 3,16 g
V = 3,16 / 1,05 = 3 mL
BCM / BCI
2005/06 13
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Solues e concentrao de uma soluo 4
4 Como procederia para preparar 50 mL de EDTA 0,2 M a partir de uma soluo 1M?
0,2 M = 0,2 mol / 1 L (=1dm3=1000mL)
0,2 mol ------------1000 mL de soluo
X mol ------------- 50 mL de soluo que se quer preparar
X x 1000 = 0,2 x 50 X = (0,2 x 50) / 1000 = 0,01 mol
So necessrias 0,01 mol de EDTA para preparar 50 mL de uma soluo 0,2 M. Agora
necessrio calcular qual o volume de uma soluo 1 M que contm esse n de moles.
1 M =1 mol / 1 L
1 mol ----------- 1000 mL
0,01 mol ------- Y mL
Y x 1 = 0,01 x 1000 Y = (0,01 x 1000) / 1 = 10 mL
OU encarar a situao como uma diluio de uma soluo com concentrao 1 M para obter
50 mL com concentrao 0,2 M.
Para diluies: Ci x Vi = Cf x Vf
final)
Logo:
1 M x X mL = 0,2 M x 50 mL
X = (0,2 x 50) /1 = 10 mL
Para preparar 50 mL de EDTA 0,2 M a partir de uma soluo 1M, pipetaria 10 mL de EDTA
1 M para uma proveta ou balo volumtrico com 50 mL e adicionaria gua destilada at
perfazer o volume de 50 mL.
BCM / BCI
2005/06 14
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Solues e concentrao de uma soluo 5
5 - Calcule a molalidade de uma soluo de H2 SO4 20% (p/v) sabendo que a densidade da
soluo 1,09 e que M H2 SO4 = 98 g/mol.
Molalidade = n de moles de soluto por quilograma de solvente
H2 SO4 20% (p/v) significa
1mol ------------- 98 g
X mol ------------ 20 g
X x 98 = 1 x 20
ii)
d = 1,09 = massa (g) / volume (mL)
1,09 = Y g / 100 mL
1,09 x Y = 100
Y = 100 / 1,09 = 91,743 g ou seja: 100 mL de soluo = 91,743 g de soluo
logo: 20 g H2 SO4 / 100 mL de soluo correspondem a 20 g H2 SO4 / 91,743 g de soluo
e a quantidade de solvente ser de 91,743 20 g = 71,743 g
ento temos 20 g H2 SO4 (= 0,204 moles) / 71,743 g de solvente e queremos saber as moles
para 1 kg de solvente (=1000 g)
0,204 mol ---------- 71, 34 g solvente
X mol --------------- 1000 g solvente
X x 71,34 = 0,204 x 1000
X = (0,204 x 1000) / 71,34 = 2,86 mol / 1 kg de solvente = 2,86 m
Uma soluo de H2 SO4 20% (p/v) tem uma molalidade de 2,86 molal (m).
BCM / BCI
2005/06 15
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Solues e concentrao de uma soluo 6
final)
Logo:
2,5 M x 16 mL = X M x 20 mL
X = (2,5 x 16) / 20 = 2 M
BCM / BCI
2005/06 16
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Solues e concentrao de uma soluo 7
PROBLEMAS
1 - Que massa de hidrxido de sdio necessria para preparar 500 mL de uma soluo 0,3 M? (M =
40g/mol).
2 - Uma soluo 0,25 M num certo soluto em que volume de soluo existem 3,75 milimoles desse
soluto?
3 - A massa especfica de uma soluo de cido sulfrico concentrado a 91,33% (p/p)
aproximadamente 1,813g/mL. Calcule a concentrao em g/L (M = 98 g/mol).
4 - Determine o volume de uma soluo de cido sulfrico 0,2 M que contm 2,5 g de H2SO4.
5- Uma soluo de sulfato de sdio 0,1 M em anio sulfato. Calcule a concentrao do catio sdio
em g/L. (Na2SO4: M = 142,04 g/mol).
6 Qual o volume a adicionar a 1 mL de cloreto de hidrognio 2 M para se obter uma soluo 0,4 M?
7 - a) Pretende-se preparar 100 mL de uma soluo de NaOH a 40% (p/p) (d = 1,44). Qual a
quantidade de NaOH que se deve utilizar? b) Qual o volume de soluo de NaOH a 40%
necessrio para preparar 1 L de NaOH 0,5 M. c) Calcule a concentrao de NaOH correspondente
soluo preparada na alnea b), expressa em g/mL.
8 - Como procederia para preparar 200 mL de uma soluo 0,2 M em io clcio, se s possusse no
seu laboratrio 100 mL de uma soluo 0,2 M em sulfato de clcio (CaSO4) e 2,5 g de hidrxido de
clcio [Ca(OH)2].
9 - Adicionaram-se 6 gramas de KCl a 80 g de uma soluo de KCl a 12% (p/p). Determine a
concentrao da soluo resultante expressa em: a) % (p/p) e b) molalidade.
(KCl: M = 74,56 g/mol).
10 - Qual a molaridade e a molalidade de uma soluo de cido sulfrico que contm 410,3g de
H2SO4 por L de soluo e cuja densidade 1,243?
11 - Calcule quantos mL de cido sulfrico concentrado a 96% (p/p), cuja densidade 1,84, so
necessrios para preparar 5 L de uma soluo 0,05 M.
12 - Que volume de uma soluo 1M contm a mesma quantidade de uma dada substncia dissolvida
que 30 mL de uma soluo 0,2 M?
13 - A densidade do cido sulfrico de uma bateria de automvel 1,23. Sabendo que a concentrao
desta soluo 4 M, calcule a concentrao em a) molalidade e b) % (p/p).
14 - Calcule a massa de nitrato de prata (AgNO3) que necessrio dissolver em 250 g de gua para
obter uma soluo 5 x 10-3 molal (AgNO3: M= 170 g/mol).
15 - A 50 mL de uma soluo aquosa 0,1 M de um determinado composto, adicionou-se 150 mL de
gua. Supondo no haver contraco de volume, qual a concentrao da soluo resultante?
16 - De uma soluo de tampo fosfato a 5% (p/v) foram retirados 2 mL aos quais se adicionaram 5
mL de gua. Indique a concentrao final do tampo.
17 - Calcule a molalidade e a molaridade de uma soluo de cido sulfrico a 20% (p/v) (d = 1,09).
Solues dos problemas:
1 - 6 g.
2 - 15 mL.
3 - 1655,8 g/L.
4 - 127,5 mL.
5 - 4,6 g/L.
6 - 4 mL.
7 - a) 57,6 g. b) 34,7 mL. c) 0,02 g/mL.
8 - 100 mL de CaSO4 0,2 M + 1,48 g de Ca(OH)2
+ H2O at 200 mL
9 - a) 18,1% b) 2,967 m.
10 - 4,18 M; 5,019 m.
11 - 13,86 mL.
12 - 6 mL.
13 - a) 4,77 m; b) 68,1%.
14 - 212 mg.
15 - 0,025 M.
16 - 1,43%.
17 - 2,292 m; 2,040 M.
BCM / BCI
2005/06 17
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Solues e concentrao de uma soluo 8
Preparao de solues
1. Preparar 250 mL de dihidrogeno fosfato de sdio (NaH2PO4) 0,1M. Grupo 1
Material e procedimento:
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BCM / BCI
2005/06 18
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pH e solues tampo - 1
pH
O solvente no interior das clulas e em todos os fludos intercelulares a gua. Uma das
caractersticas principais de qualquer soluo aquosa a concentrao dos produtos de
dissociao da gua - os ies H+ e OH- . As caractersticas da molcula da gua e
especificamente a concentrao dos seus produtos de dissociao influencia de uma forma
determinante as propriedades das molculas orgnicas e a forma como elas interagem.
Equao da dissociao da gua
H2O
H+ + OH-
A 25 C
[H+] x [OH-] = 10-14 M2
A escala de pH varia de 0 a 14. Numa soluo aquosa pura [H+] = 10-7 M, logo pH = - log 10-7 =
7 , a soluo diz-se neutra ([H+] = [OH-] ). Valores de pH inferiores a 7 indicam uma soluo
cida ([H+] > [OH-] ) e valores de pH superiores a 7 indicam uma soluo bsica ou alcalina
([H+] < [OH-] ).
Tabela 1 Escala de pH e exemplos com diferentes valores de pH (adaptado de Loddish et al. 2000).
Concentrao de H+
(M)
pH
Exemplo
Acidez crescente
10-0
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0
1
2
3
4
5
6
Fludos gstricos
Sumo de limo
Vinagre
Solos cidos
Lisossomas e Vacolos
Citoplasma de msculo em contraco
Neutro
10-7
Basicidade crescente
10-8
10-9
10-10
10-11
10-12
10-13
10-14
8
9
10
11
12
13
14
gua do mar
Solos alcalinos
Lagos alcalinos
Detergentes com amnia
Cal (soluo saturada)
BCM / BCI
2005/06 19
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pH e solues tampo - 2
Fenolftalena
Indicador universal
Elctrodo de pH
BCM / BCI
2005/06 20
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pH e solues tampo - 3
BCM / BCI
2005/06 21
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pH e solues tampo - 4
Solues tampo
Uma soluo tampo uma soluo que possui uma capacidade superior gua pura para resistir
alterao de pH por adio de cido ou base. A capacidade tamponante da soluo resulta da
presena de um cido fraco e da sua base conjugada ou da presena de uma base fraca e do seu
cido conjugado. Todas as clulas e fludos extracelulares possuem pares conjugados cido/base
que funcionam como sistemas tampo garantindo a homeostasia do pH.
A capacidade tamponante de um cido fraco e da sua base conjugada torna-se evidente quando se
procede curva de titulao do cido (fig. 1). A dissociao de um cido fraco HA na sua base
conjugada A- e em H+ vai ocorrendo progressivamente ao longo da titulao:
HA
H + + A-
O pKa de um cido igual ao valor de pH para o qual [HA] = [ A-], ou seja, o pH para o qual o
cido e a sua base conjugada esto presentes em concentraes iguais. No intervalo de pH igual a
pKa1 a pKa+1 o par conjugado confere capacidade tamponante soluo como ilustra a curva de
titulao.
pH 8
6
Zona tamponante
(pKa + 1)
pH 3,75 a 5,75
pKa = 4,75
4
Zona tamponante = pKa + 1 (3,75 5,75)
2
Moles de NaOH adicionadas
BCM / BCI
2005/06 22
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pH e solues tampo - 5
pH
9,7
0,3
5,30
9,5
0,5
5,59
9,0
1,0
5,91
8,0
2,0
6,24
7,0
3,0
6,47
6,0
4,0
6,64
5,0
5,0
6,81
4,0
6,0
6,98
3,0
7,0
7,17
2,0
8,0
7,38
1,0
9,0
7,73
0,5
9,5
8,04
BCM / BCI
2005/06 23
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pH e solues tampo - 6
Resultados:
Tabela 4 __________________________________________________________________
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NaOH 0,2M
(mL)
pH
NaOH 0,2M
(mL) cont.
pH
cont.
Figura 3 __________________________________________________________________
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BCM / BCI
2005/06 24
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pH e solues tampo 7
BCM / BCI
2005/06 25
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pH e solues tampo 8
BCM / BCI
2005/06 26
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pH e solues tampo 9
BCM / BCI
2005/06 27
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Microscopia ptica - 1
lentes
oculares
tubo
revlver e lentes
objectivas
coluna
Microscopia ptica-2
parafusos
macromtrico e
micromtrico
Fonte luminosa e
respectivo diafragma
restato
d=k
AN
n
sen
k
AN
BCM / BCI
2005/06 28
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Microscopia ptica-2
Iluminao de Khler
O sistema de iluminao do microscpio ptico a utilizar incluiu: fonte de iluminao,
condensador e diafragma da fonte de iluminao; o condensador e o diafragma de ris do
microscpio. Um microscpio iluminado pelo mtodo de Khler tem um campo de iluminao
uniforme e apresenta a mxima resoluo para o sistema de ampliao.
1. Colocar uma preparao na platina do microscpio
2. Ligar a luz e deslocar a preparao at observar o objecto com a objectiva de menor
ampliao.
3. Focar o objecto utilizando os parafusos macromtrico e micromtico.
4. Abrir completamente o diafragma do condensador e o diafragma da fonte de iluminao.
5. Olhar atravs da ocular e fechar devagar o diafragma da fonte de iluminao at o campo de
observao ficar reduzido a cerca de metade.
6. Focar a margem do diafragma ajustando a posio do condensador.
7. Abrir novamente o diafragma da fonte de iluminao at todo o campo estar iluminado.
BCM / BCI
2005/06 29
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Microscopia ptica-3
Medio de objectos
Utilizando uma escala graduada em m, montada numa lmina de vidro micrmetro
objectivo e uma escala associada a uma lente ocular micrmetro ocular - possvel
efectuar a medio de objectos ou estruturas observados ao microscpio ptico.
Procedimento
1. Colocar o micrmetro objectivo na platina do microscpio e focar a escala com a objectiva
de 10x.
2. Deslocar o micrmetro objectivo at fazer coincidir o zero da escala do micrtomo objectivo
com o zero da escala do micrtomo ocular (pontos 0 e 0na figura).
3. Determinar outro ponto de coincidncia entre as duas escalas (pontos B e B na figura).
4. Calcular a distncia entre os pontos 0 e B no micrmetro objectivo multiplicando o nmero
de divises entre os 2 pontos pelo valor conhecido de cada diviso.
Exemplo da figura:
1 div (microt. objectivo) =10 m
distncia 0-B no micrmetro objectivo = 8 div. x 10 m = 80 m
5. Determinar o valor de cada diviso do micrmetro ocular dividindo o valor da distncia 0B, calculada em 4, pelo n. de divises correspondentes distncia 0-B no micrmetro
ocular.
Exemplo da figura:
distncia 0-B no micrmetro ocular = 5 div = 80 m
1 diviso no micrmetro ocular = 80/ 5= 16 m
BCM / BCI
2005/06 30
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Observao de imagens de microscopia - 1
BCM / BCI
2005/06 31
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Observao de imagens de microscopia 2
Material biolgico
Allium cepa
Elodea
Fgado
Ampliao
Esquema
Medies
BCM / BCI
2005/06 32
_________________________________________________________________________________________
Cortia
Bactrias do
iogurte
Anabaena sp.
Bacillus subtilis
Ampliao
Esquema
Medies
BCM / BCI
2005/06 33
_________________________________________________________________________________________
Clula animal:
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
Clula vegetal:
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
BCM / BCI
2005/06 34
_________________________________________________________________________________________
Espectrofotometria 1
ESPECTROFOTOMETRIA
A espectrofotometria estuda as interaces entre a energia radiante e a matria, incidindo tanto nos
aspectos qualitativos como nos quantitativos. Ou seja, a espectrofotometria permite tirar
concluses sobre a natureza e composio de uma amostra desconhecida e permite, por outro lado,
determinar a concentrao de uma substncia conhecida.
Todas as substncias absorvem energia radiante, isto , radiaes electromagnticas, desde as
ondas de rdio at s radiaes gama (Fig. 6), numa certa extenso. Mesmo materiais que so
considerados transparentes para a vista tm espectro de absoro no ultravioleta ou no
infravermelho - por exemplo o vidro e a gua respectivamente.
A absoro de energia por uma molcula apenas pode ocorrer quando a energia do foto incidente
igual diferena de energia entre dois nveis electrnicos, promovendo assim a transio de um
electro de um nvel de energia baixo para um mais elevado. Antes que um outro foto possa ser
absorvido, o estado excitado deve perder esta energia e reverter ao estado de energia inicial.
BCM / BCI
2005/06 35
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Espectrofotometria 2
A razo entre a intensidade de luz transmitida depois de atravessar uma soluo colocada no
aparelho - It - e a intensidade de luz na ausncia de amostra - I0 chama-se transmitncia (T):
I0
It
T = It / I0
A transmitncia pode ter um valor entre 0 e 1 e frequentemente multiplicada por 100 sendo
assim indicada como uma percentagem . A absorvncia traduz a quantidade de luz absorvida pela
substncia em soluo.
BCM / BCI
2005/06 36
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Espectrofotometria - 3
Leis da Absoro
Lei de Lambert
Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado,
a absorvncia da soluo directamente proporcional espessura do compartimento que contm a
soluo trajecto ptico da luz na amostra = l (expresso em cm).
A = k l
Lei de Beer
Para uma concentrao baixa de soluto e para qualquer comprimento de onda de luz considerado,
a absorvncia da soluo directamente proporcional concentrao do soluto = c.
A = kc
BCM / BCI
2005/06 37
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Espectrofotometria 4
O coeficiente de extino uma constante caracterstica de cada espcie qumica dissolvida num
determinado solvente e depende do comprimento de onda da radiao incidente e da temperatura.
O coeficiente de extino mais vulgarmente utilizado o coeficiente de extino molar - . Neste
caso a lei de Lambert-Beer corresponde a :
A=lc
Olhando para esta expresso pode verificar-se que o coeficiente de extino molar de uma
substncia, para um determinado , corresponde absorvncia de uma soluo com a
concentrao 1M: l = 1cm, c = 1M ento A = x 1 x 1 ou seja A =
O coeficiente de extino molar pode ser consultado em tabelas para inmeras substncias e
assim, a partir da absorvncia de solues de concentrao desconhecida, pode-se determinar
facilmente a respectiva concentrao utilizando a lei de Lambert-Beer.
Em determinadas situaes no conveniente a expresso da concentrao em molaridade e no
possvel recorrer a um pre determinado:
- para molculas polimricas de tamanho varivel ou de peso molecular indefinido - caso de
cadeias de DNA ou de polissacardeos
- quando se deseja determinar a concentrao, no de uma espcie qumica, mas de uma classe de
compostos (por exemplo todos os lpidos presentes numa amostra)
- quando se pretende medir uma concentrao indirectamente atravs de uma reaco
colorimtrica
Absorvncia
Nestes casos, a constante de proporcionalidade k tem que ser determinada para cada situao.
necessrio construir a recta que representa a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de
absorvncia obtidos para solues preparadas no laboratrio com concentraes conhecidas da
substncia em estudo. Esta recta designada recta padro e a sua equao corresponde lei de
Lambert Beer para essa situao. O declive da recta corresponde obviamente constante de
proporcionalidade k.
Para construir uma recta padro so, portanto, necessrias solues com concentraes
conhecidas - normalmente designadas solues padro, e necessrio obter os respectivos
valores de absorvncia. Estes valores so colocados num grfico no qual o eixo das abcissas
representa a concentrao - varivel independente - e o eixo das ordenadas a absorvncia
varivel dependente. Desenha-se ento a melhor recta que traduz a nuvem de pontos tomando
como ponto fixo a origem das coordenadas (fig. 8). Alternativamente pode determinar-se a
equao da melhor recta representada pelo conjunto de pontos atravs dum mtodo estatstico de
regresso linear.
Concentrao
BCM / BCI
2005/06 38
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Espectrofotometria - 5
Aplicaes da espectrofotometria
As aplicaes da espectrofotometria podem ser divididas em duas categorias:
a) medio da absorvncia a um determinado comprimento de onda.
Exemplo: utilizao do coeficiente de extino molar ou construo de uma recta padro
para a determinao da concentrao de um determinado composto em soluo.
b) medio da variao da absorvncia num intervalo de comprimentos de onda.
Exemplo: obteno de um espectro de absoro para identificao de biomolculas.
O espectro de absoro de um composto obtido medindo a absorvncia a vrios
comprimentos de onda e registando a absorvncia em funo do comprimento de onda (ver
Fig. 5).
Abs.
BCM / BCI
2005/06 39
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Espectrofotometria - 6
(nm)
Absorvncia
BCM / BCI
2005/06 40
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Figura 10 ______________________________________________________________
______________________________________________________________________
BCM / BCI
2005/06 41
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Espectrofotometria - 7
gua
(mL)
(mL)
(mL)
---
---
---
---
---
---
Tubo
Calcule a concentrao de azul de metileno nos tubos 1 a 6 e preencha a tabela 7 com esses
valores.
BCM / BCI
2005/06 42
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Espectrofotometria - 8
Concentrao
(mg/mL)
Abs
(=
nm)
0,000
2
3
4
5
0,005
BCM / BCI
2005/06 43
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Espectrofotometria 9
Figura 11 ____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
BCM / BCI
2005/06 44
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Regresso linear - 1
Para obviar subjectividade subjacente ao traado manual de uma recta que estabelea uma relao
linear numa representao grfica de uma nuvem de pontos, como a que est representada na Fig. 12,
mais apropriado efectuar o procedimento de regresso linear recorrendo a uma metodologia
estatstica como, por ex., o mtodo dos mnimos quadrados
Com este mtodo, depois de aceitar diversos pressupostos estatsticos, podemos obter a equao de
uma recta que represente a possvel relao linear entre as duas variveis, neste caso absorvncia e
concentrao.
Equao da recta:
m = declive da recta
b = valor da ordenada na origem
y = mx + b
Y = absorvncia
X=
Para obter estes dois parmetros necessrio proceder a uma srie de clculos uma vez que:
x y
i
m=
( xi )( yi )
n
( xi )
n
b = y mx
BCM / BCI
2005/06 45
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Regresso linear - 2
Aps a determinao da melhor recta que passa por um conjunto de pontos experimentais pelo mtodo
dos mnimos quadrados, importante saber-se em que medida estes pontos tm ou no alguma
probabilidade de seguirem uma relao linear.
Tal estudo pode fazer-se atravs da determinao do coeficiente de correlao (r):
r=
m x
- desvio padro dos valores experimentais (x,y) em torno dos seus valores mdios. Para o seu
clculo podemos utilizar a expresso que nos fornece o valor da varincia (2) destes mesmos dados:
x
=
y
=
x2
y2
O coeficiente de correlao pode tomar valores entre +1 e 1. Quando r = 1 isso exprime a existncia
de uma funo linear entre as duas variveis em causa; quando r = 0 isto significa que as duas
variveis so independentes.
Uma vez determinado o valor de r, para saber se os pontos experimentais tm uma probabilidade
superior ou inferior a 95% de estarem em linha recta, deve comparar-se o valor de r determinado
experimentalmente pela expresso acima com o valor terico tabelado para a probabilidade de 95% e
para um nmero de graus de liberdade N = n-1. Se o valor experimental for superior ao valor terico
tabelado, pode afirmar-se que os pontos tm uma probabilidade maior que 95% de seguirem uma
relao linear. Caso o valor de r experimental for inferior ao valor terico tabelado, os pontos
experimentais tero uma probabilidade inferior a 95% de seguirem tal relao (Tabela 8). O valor 95%
representa um limite de confiana que determinamos ser suficiente para cada caso experimental
figura 13.
BCM / BCI
2005/06 46
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Regresso linear 3
Figura 13 Recta obtida por regresso linear a partir de um conjunto de pontos experimentais e que
traduz a relao de proporcionalidade directa entre absorvncia e concentrao. A figura mostra ainda
a representao grfica de um limite de confiana de 95%.
Tabela 8 Coeficientes de correlao tericosentre duas variveis, expressos em mdulo, para 95 %
de probabilidade e um dado n de graus de liberdade.
________________________________________________________________________
Mdulo do coeficiente
N
Mdulo do coeficiente
de correlao
de correlao
1
0,997
16
0,468
2
0,950
17
0,456
3
0,878
18
0,444
4
0,811
19
0,433
5
0,754
20
0,423
6
0,707
21
0,413
7
0,666
22
0,404
8
0,632
23
0,396
9
0,602
24
0,388
10
0,576
25
0,38 1
11
0,553
26
0,374
12
0,532
27
0,367
13
0,514
28
0,361
14
0,497
29
0,355
15
0,482
30
0,349
_________________________________________________________________________
N
BCM / BCI
2005/06 47
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Regresso linear - 4
Para facilitar os clculos dos diferentes parmetros deve-se comear por calcular cada uma das
variveis intervenientes nas diferentes frmulas:
x =
y=
2
y =
yi =
xi =
xi yi =
( xi) 2 =
xi 2 =
( xiyi) =
Clculo de:
a) m =
b) b =
c) Equao da recta:
d) r =
Concluso:
BCM / BCI
2005/06 48
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Ponto isoelctrico - 1
BCM / BCI
2005/06 49
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Ponto isoelctrico - 2
Resultados:
Tabela 1 -________________________________________________________________________
Protena
Distncia percorrida
Distncia percorrida
Distncia percorrida
pH 4,0
pH 7,2
pH 9,2
ctodo
nodo
ctodo
nodo
ctodo
nodo
Citocromo c
Mioglobina
Albumina srica
pH 4,0
Poos e
protenas
carregadas
pH 7,2
AS
pH 9,2
AS
AS
Figura 1 ____________________________________________________________________
Tabela 2 -______________________________________________________________________
_
Carga
Protena
pH 4,0
pH 7,2
pH 9,2
Citocromo c
Mioglobina
Albumina srica
BCM / BCI
2005/06 50
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Ponto isoelctrico - 3
Solues tampo:
Tampo Acetato pH 4,0: adicionar 25,6 ml de cido actico glacial a cerca de 500 mL de gua
destilada, adicionar 13,6 g de acetato de sdio (anidro), ajustar o pH para 4,0 e acertar o volume final
para 1 Litro.
Tampo Tris 50 mM pH 7,2: misturar 250 mL de Tris 0,2 M com 221 mL de HCl 0,2 M, ajustar o
pH para 7,2 e acertar o volume final para 1 Litro.
Tampo Tris-Glicina pH 9,2: disso l40 g de Tris e 15 gramas de glicina em cerca de 500 mL de gua
destilada, ajustar o pH para 9,2 e acertar o volume final para 1 Litro.
Solues de protenas:
Citocromo c: preparar uma soluo com concentrao de 5 mg/mL em gua destilada. Para carregar
no gel, misturar previamente, num tubo Eppendorf, 45 L da soluo de protena com 5 L de
glicerol.
Mioglobina: preparar uma soluo com concentrao de 5 mg/mL em gua destilada. Para carregar
no gel, misturar previamente, num tubo Eppendorf, 45 L da soluo de protena com 5 L de
glicerol.
Albumina srica: preparar uma soluo com concentrao de 7 mg/mL em gua destilada. Para
carregar no gel, misturar previamente, num tubo Eppendorf, 35 L da soluo de protena com 5 L
de glicerol e com 10 L de uma soluo saturada de azul de bromofenol.
Caractersticas das protenas em estudo:
Citocromo c Est presente em tecidos animais e vegetais e faz parte da cadeia transportadora de
electres das mitocndrias. O citocromo c consiste numa nica cadeia polipptidica enrolada em volta
de um grupo heme. O Fe presente neste grupo heme o responsvel pela cor laranja/acastanhada da
protena. In vivo, a protena bsica devido presena de uma grande quantidade de resduos de
lisina.
Mioglobina A mioglobina a responsvel pelo armazenamento de oxignio nas clulas musculares.
Tem uma cor vermelha/acastanhada devido presena de um grupo heme cujo Fe tem a capacidade de
ligar oxignio.
Albumina srica a protena predominante no plasma sanguneo, ligando-se e transportando um
grande nmero de pequenas molculas no sangue. No tem cor, mas pode ser corada com azul de
bromofenol. uma protena relativamente acdica.
Tabela 3 -Pontos isoelctricos de algumas protenas
Protena
pI
Pepsina
~1,0
Albumina do ovo
4,6
Albumina srica
4,9
Urease
5,0
5,2
-lactoglobulina
Hemoglobina
6,8
Mioglobina
7,0
Quimotripsina
9,5
Citocromo c
10,7
Lisozima
11,0
Adaptado de Nelson & Cox (2000)
BCM / BCI
2005/06 51
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DNA - 1
BCM / BCI
2005/06 52
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DNA - 2
Quantificao do DNA
1 - Diluir as amostras 1/500 em gua.
2 - Medir a absorvncia a 260nm num espectrofotmetro de ultravioletas. Usar gua como branco.
E260nmDNA = 0,02 g-1cm-1 mL
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Tampo de Extraco
200 mM Tris-HCl pH 7,5
250 mM de NaCl
25 mM EDTA
0,5% SDS
TE
10 mM Tris-HCl pH 7,4
1 mM EDTA
BCM / BCI
2005/06 53
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DNA - 3
Procedimento experimental
Ateno: usar solues e material esterilizado, luvas, e trabalhar com os tubos em gelo.
1 - Pipetar para um tubo Eppendorf as seguintes solues:
2 L de DNA (0.1-10 ng)
2 L de Primer 1
2 L de Primer 2
14 L de Mistura de reaco *
Total = 20 L
aps pipetar todos os componentes agitar de forma a homogeneizar bem a mistura
2 - Colocar os tubos no termociclador e seleccionar o programa:
35-40 ciclos:
Extenso final:
3 - Observe os resultados correndo o(s) produto(s) de reaco em gel de agarose (pg. 54 e 55).
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------* Mistura de reaco:
Solues
1 reaco
2.0 l
dNTPs 10 mM
0.4 l
H2O
11.5 l
Taq polimerase
0.1 l
___ reaces
(complete)
aps pipetar todos os
componentes agitar de
forma a homogeneizar
bem a mistura
BCM / BCI
2005/06 54
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DNA - 4
DNA*
Tampo
10x
HindIII
EcoRI
H2O
1 L
1 L
1 L
---
7 L
1 L
1 L
---
1 L
7 L
Controlo
1 L
1 L
---
---
8 L
* 1 g
2 - Misturar os reagentes batendo suavemente na extremidade do tubo. Se necessrio, centrifugar para
evitar que fique lquido nas paredes.
3 - Incubar todos os tubos de reaco por um perodo mnimo de 30 minutos a 37C.
BCM / BCI
2005/06 55
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DNA - 5
BCM / BCI
2005/06 56
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DNA - 6
Procedimento D: Electroforese
1 - Fechar a cmara de electroforese e ligar os cabos elctricos a uma fonte de alimentao elctrica de
modo a que o ctodo da cmara fique ligado ao ctodo da fonte (preto preto), assim como o
nodo (vermelho vermelho). Verificar se os poos com DNA esto do lado do ctodo (polo
negativo).
2 - Ligar a fonte de alimentao e regular a voltagem para 70 V. Verificar a formao de pequenas
bolhas gasosas nos elctrodos da cmara. Passados alguns instantes de corrida, deve ver-se o
corante azul deslocar-se no gel em direco ao polo positivo. O azul de bromofenol desloca-se
mesma velocidade de um fragmento de DNA de aproximadamente 300 bp.
3 - Deixar de correr a electroforese at o azul de bromofenol se encontrar prximo do fim do gel.
4 - Desligar a fonte de alimentao, desligar os cabos de ligao e remover a tampa da cmara de
electroforese.
5 - Cuidadosamente, e usando luvas, retirar o gel com o respectivo suporte da cmara de electroforese.
6 - Examinar o gel com iluminao UV e registar o padro de bandas em fotografia ou desenhando
numa folha de acetato sobreposta ao gel. Neste caso, no esquecer de marcar a posio dos poos.
Ateno: proteger os olhos da radiao UV por meio de culos adequados.
BCM / BCI
2005/06 57
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DNA - 7
Resultados e Discusso
1 - Os fragmentos lineares de DNA migram a velocidades inversamente proporcionais ao log10 das
suas massas moleculares. Para simplificar, substitui-se a massa molecular dos fragmentos pelo
seu tamanho em pares de bases(bp).
2 - Na tabela seguinte esto os tamanhos de fragmentos de DNA de Lambda originados por digesto
com HindIII:
HindIII
Distncia (mm)
bp real
EcoRI
Distncia (mm)
bp calculado
bp real
23130
9416
6682
4361
2322
2027
*564
*125
* estas bandas podem no ser visveis
3 -Medir a distncia, em mm, desde o bordo frontal do poo a cada uma das bandas e registar na
tabela.
4 -Fazer corresponder a distncia a cada banda ao tamanho do respectivo fragmento.
5 - Usando papel semi-logartmico, marcar a distncia migrada no eixo dos xx e o logartmo de kbp no
eixo dos yy, para cada fragmento de HindIII. Unir os pontos.
6 - Usar a curva obtida para obter o tamanho, em kbp dos fragmentos obtidos coma EcoRI, a partir das
distncias migradas.
7 - Registar o valor obtido na tabela, na coluna correspondente a bp calculado. Comparar com os
valores reais conhecidos.
BCM / BCI
2005/06 58
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DNA - 8
Figura 20 - ______________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
BCM / BCI
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DNA - 9
BCM / BCI
2005/06 60
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DNA - 10
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Bibliografia: DNA Restriction Analysis Kit - Instructors Manual (1990). Carolina Biological Supply
Company, USA.