Anlisis qumico

Tcnicas cromatogrficas

ndice
1 Conceptos Bsicos sobre la cromatografa:.3
1.1 Introduccin.3
1.2 - Base cientfica..4
2 Tipos de separacin cromatogrfica:
2.1 Clasificacin de los distintos tipos de cromatografa..9
2.2 Cromatografa plana...12
2.3 Cromatografa de capa fina (CCF).12
2.4 Cromatografa en columna.15
3 Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
3.1 Fundamentos y principios bsicos.19
3.2 Instrumentacin..22
3.3 Aplicacin al anlisis de alimentos25
Cromatografa de gases
4.1 Fundamentos y principios bsicos.26
4.2 Instrumentacin..26
4.3 Aplicaciones al anlisis de animales..30
5 Bibliografa.....31

1 - CONCEPTOS BSICOS SOBRE CROMATOGRAFA

1.1 Introduccin:
La cromatografa es una tcnica mediante la cual los componentes de una
mezcla, se separan segn las distintas velocidades con que se desplazan a travs de una
fase estacionaria cuando son transportados por una fase mvil lquida o gaseosa.
Hay dos tipos de mtodos cromatogrficos:
a) Cromatografa en columna: la fase estacionaria se mantiene dentro de un tubo
angosto y la fase mvil es forzada a pasar a travs del tubo bajo presin o por
gravedad. En ste tipo de cromatografa se puede realizar la cromatografa de
lquidos, gases y fluidos supercrticos.
Clasificacin de mtodos cromatogrficos en columna:

Clasificacin
general

Mtodo especfico

Fase estacionaria

Tipo de equilibrio

Lquido-Lquido o

Lquido absorbido

Participacin entre lquidos

participacin

sobre un slido

inmiscibles

Especies orgnicas
Lquido-fase unida

slida

1 - Cromatografa
Lquida (CL)

Lquido slido o

(Fase mvil: lquida)

absorcin
Intercambio de iones
Exclusin por tamao
Gas lquido

2 - Cromatografa
gaseosa (CG)
(Fase mvil:gas)

unidas a una superficie

Slido
Resina de intercambio
inico
Lquido en intersticios
de un slido polimrico

Adsorcin
Intercambio inico
Participacin / tamizado
Participacin entre gas y

sobre un slido

lquido

unidas a una superficie

slida

Gas slido

y superficie unida

Lquido absorbido
Especies orgnicas

Gas fase unida

Participacin entre lquido

Slido

Participacin entre lquido

y superficie unida
Adsorcin

3 - Cromatografa
fluida supercrtica

Especies orgnicas

Particin entre fluido

unidas a una superficie

supercrtico y superficie

slida

unida

b) Cromatografa plana: la fase estacionaria est soportada en una placa plana o en

los poros de un papel. En este caso, la fase mvil se mueve a travs de la fase
estacionaria por accin capilar o bajo la influencia de la gravedad.
La cromatografa plana y de columna estn basadas en los mismos tipos de
equilibrios.

1.2 - Base cientfica:

Velocidades de migracin de los solutos
La efectividad de una columna cromatogrfica para la separacin de dos solutos
depende en parte de las velocidades relativas a las cuales las dos especies son
eluidas, es decir, el proceso en el cual los solutos son lavados a travs de una fase
estacionaria por el movimiento de una fase mvil. Estas velocidades son
determinadas a su vez, por las relaciones de particin de los solutos entre las dos
fases, es decir, las diferencias en el grado al cual los solutos se reparten entre la fase
mvil y la estacionaria.
La relacin entre la velocidad de migracin de un soluto y su relacin de
participacin, lo podemos expresar con:
= u x fraccin de tiempo que el soluto transcurre en la fase mvil

Tambin depende el tiempo de retencin, que es el tiempo entre la inyeccin de

una muestra y la aparicin de un pico de soluto en el detector de una columna
cromatogrfica.

El factor de capacidad es un parmetro experimental importante que se emplea

ampliamente para describir las velocidades de migracin de solutos en columnas.
Para un soluto A, el factor de capacidad KA se define como:
KA = KAVS / VM
en donde KA es la relacin de particin para las especies A.
Cuando el factor de capacidad para un soluto es mucho menor que la unidad, tiene
lugar la elusin tan rpidamente que la determinacin de los tiempos de retencin es
difcil. Cuando el factor de capacidad sea mayor que 20 a 30 , los tiempos de elusin
se convierten excepcionalmente largos. Idealmente, las separaciones se deben
realizar bajo condiciones en las cuales los factores de capacidad para los solutos de
una mezcla estn lmites de 1 y 5.
Los factores de capacidad en la cromatografa gaseosa se pueden variar cambiando
la temperatura y el empaquetado de la columna. En la cromatografa lquida, los
factores de capacidad se pueden manipular frecuentemente para dar mejores
separaciones variando la composicin de la fase mvil y de la fase estacionaria.
El factor de selectividad de una columna para las dos especies A y B se define
como:
= KB / KA
en donde KB es la proporcin de participacin para las especies B retenidas con ms
fuerza y KA es la constante para las especies mantenidas menos fuertemente, o sean
las eluidas ms rpidamente , A. De acuerdo con esta definicin, es siempre
mayor que la unidad.
La sustitucin de la ecuacin del factor de capacidad y de la ecuacin anloga para
el soluto B dentro de la ecuacin del factor de selectividad, proporciona, despus de
una reacomodacin, una relacin entre el factor de selectividad para dos solutos y
sus factores de capacidad:
= KB / KA
en donde KB y KA son los factores de capacidad para B y A , respectivamente.

Eficiencia de las columnas cromatogrficas

La eficiencia de una columna cromatogrfica se refiere a la magnitud del
ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a travs de la columna.
El grado de ensanchamiento de la banda depende del tiempo que la fase mvil est en
contacto con la fase estacionaria.
Estas situaciones se dan por diferentes razones:
-

En el centro de una banda cromatogrfica la concentracin de una especie es

elevada, en tanto que los bordes se aproxima a cero. Por consiguiente, las
molculas tienden a migrar hacia cualquiera de los bordes de la banda, lo que
produce es un ensanchamiento de la banda.

Otra causa de ensanchamiento de banda es cuando las molculas en la fase

mvil siguen trayectorias de longitudes diferentes a medida que va atravesando
la columna, y en su llegada al detector difiere, y consecuentemente las bandas
son ms anchas.
La anchura de una banda se incrementa al moverse hacia abajo, en la columna
debido a que ha tenido ms tiempo para expandirse. As la anchura de la zona
est relacionada directamente con el tiempo de residencia en la columna e
inversamente a la velocidad de flujo de la fase mvil.

El ensanchamiento de la columna, y en esta forma la prdida de eficiencia de sta, es

consecuencia de la velocidad finita a la cual ocurren los procesos de transferencia de
varias masas durante la migracin de un soluto hacia abajo en una columna. Algunas de
las variables que afectan estas velocidades son controlables y se pueden aprovechar para
mejorar las separaciones.
Se ha demostrado que se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye
el tamao de partcula del empaque de la columna, empleando capas ms delgadas de la
pelcula inmovilizada (en donde la fase estacionaria es un lquido absorbido por un
slido), y disminuyendo la viscosidad de la fase mvil. El incremento de la temperatura
tambin reduce el ensanchamiento de banda en casi todas las circunstancias.
En mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatogrficas se
emplean dos trminos:
1. Altura de plato ( H )
6

2. N de platos tericos ( N )
Los dos estn relacionados mediante la ecuacin :
N=L/H
En donde L es la longitud (generalmente en centmetros ) del empaquetado de la
columna y la altura de un plato H es el equivalente de un plato terico ( HETP ).
La eficiencia de las columnas cromatogrficas se incrementa a medida que se hace
mayor el numero de platos y a medida que la altura del plato se hace menor. Se
encuentran grandes diferencias en las columnas, dependiendo de su tipo y de las clases
de fases mvil y estacionaria que contienen. Las eficiencias en trminos de nmeros de
platos pueden variar desde unos cientos hasta varios millares; la altura de los platos
vara desde dcimos a un milsimo de centmetro y hasta ms pequeas.

Resolucin en columnas
La resolucin Rs de una columna proporciona una medicin cuantitativa de su
capacidad para separar dos analitos. El significado de este trmino se muestra en el
siguiente figura , la cual consiste en los cromatogramas para las especies A y B sobre
tres columnas con diferentes potencias de resolucin. La resolucin de cada columna
queda definida como:
Rs = 2Z / WA + WB = 2[ ( tR)B ( tR )A ] / WA + WB

En la figura podemos observar que una resolucin de 1.5 da una separacin

prcticamente completa de A y B, en tanto que una resolucin de 0.75 no lo hace. A una
resolucin de 1.0, la zona A contiene alrededor de 4% de B y la zona B contiene
alrededor de un 4% de A.
A una resolucin de 1.5, la superposicin es solamente de 0.3%. La resolucin para una
fase estacionaria dada se puede mejorar alargando la columna, incrementando as el
nmero de platos. Una consecuencia adversa de los platos adicionados es, sin embargo
un incremento en el tiempo que se requiere para la resolucin.
Podemos derivar con facilidad una ecuacin til que relaciona la resolucin de una
columna con el nmero de platos que contiene, as como con factores de capacidad y
selectividad sobre un par de solutos de la columna B. Se puede demostrar que para los
dos solutos A y B ( del dibujo ), la resolucin est dada por la ecuacin:
Rs = N / 4( -1 / )( KB / 1+ KB )
En donde KB es el factor de capacidad de las especies que se mueven con mayor
lentitud, y es el factor de selectividad. Esta ecuacin se puede reacomodar para dar el
nmero de platos necesarios para llevar a cabo una resolucin dada:
N = 16Rs2 ( / -1)2( 1 + KB / KB )2

Efecto de la resolucin sobre el tiempo de retencin:

El objetivo en la cromatografa es la resolucin ms elevada posible en el menor
tiempo. Desafortunadamente estos objetivos tienden a ser incompatibles, por lo tanto se
necesita un compromiso entre las dos. El tiempo ( tR )B necesario para eludir las dos
especies del dibujo con una resolucin Rs est dado por:
( TR )B = 16Rs2H / u ( / -1)2 ( 1+ KB)3 / ( KB )2
En donde u es la velocidad lineal de la fase mvil.

2. TIPOS DE SEPARACIN CROMATOGRFICA

Todas las tcnicas cromatogrficas dependen de la distribucin de los componentes de

la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, que transporta las sustancias que
se separan y que progresa en relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase
mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria puede ser un slido o un lquido.
Las combinaciones de estos componentes dan lugar a los distintos tipos de tcnicas
cromatogrficas que aparecen en la siguiente tabla:

Segn esta clasificacin, se utilizan las siguientes expresiones:

-

Cromatografa gas slido (CGS)

Cromatografa gas lquido (CGL)

Cromatografa lquido slido (CLS)

Cromatografa lquido lquido (CLL)

Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica correspondiente recibe el

nombre de dicha fase mvil:

2.1 - Clasificaciones de los distintos tipos de cromatografa

2.1.1 - Clasificacin segn el estado fsico de la fase mvil

Cromatografa de gases (CG): Es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es un

gas. La cromatografa de gases se lleva a cabo siempre en columna.
Cromatografa de lquidos (CL): Es una tcnica de separacin en la que la fase mvil es
un lquido. La cromatografa de lquidos se puede realizar tanto en columna como en
plano. Hoy da, la cromatografa de lquidos en la que normalmente se utilizan
partculas muy pequeas y presiones de entrada relativamente altas, se suele denominar
cromatografa de lquidos de alta eficacia (o alta presin), y con el acrnimo HPLC.
Cromatografa de fluidos supercrticos (CFS): Es una tcnica de separacin en la que la
fase mvil es un fluido ligeramente por encima de su temperatura y presin crticas.
En general, los trminos y definiciones utilizados en cromatografa de gases o lquidos,
son aplicables a la cromatografa de fluidos supercrticos.
2.1.2 - Clasificacin segn la configuracin del lecho cromatogrfico
Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, es decir, segn el
dispositivo utilizado, cabe distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas:
Cromatografa en columna: Es una tcnica de separacin en la que el lecho estacionario
est dentro de un tubo. Las partculas de la fase estacionaria slida, o del soporte
recubierto con la fase estacionaria lquida, pueden llenar el volumen interno del tubo
(columna rellena), o concentrarse sobre o a lo largo de la pared interna del tubo, dejando
un camino abierto sin restriccin, en la parte media, por el que circula la fase mvil
(columna abierta). El flujo de la fase mvil (lquido o gas) a travs de la estacionaria se
consigue: por presin, por capilaridad o por gravedad.
Cromatografa plana: Es una tcnica de separacin en la que la fase estacionaria es un
plano o est sobre un plano. Este plano puede ser un papel utilizado como tal, o
impregnado con una sustancia a modo de lecho estacionario (cromatografa en papel,
PC), o bien una capa de partculas slidas que recubren un soporte, como por ejemplo
una placa de vidrio (cromatografa en capa fina, TLC).
El flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos formas:
-

por capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente)

10

por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente)

En la cromatografa plana queda excluido el uso de un gas como fase mvil, por lo que
sta siempre es lquida.
2.1. 3 - Clasificacin segn el mecanismo de separacin
Cromatografa de adsorcin: La separacin se basa fundamentalmente en las distintas
afinidades de adsorcin de los componentes de la muestra hacia la superficie de un
slido activo.
Cromatografa de reparto: La separacin se basa fundamentalmente en las diferencias de
solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (cromatografa de
gases) o en las diferencias de solubilidad de los componentes en la fase mvil y en la
fase estacionaria (cromatografa de lquidos).
Cromatografa de intercambio inico: La separacin se basa fundamentalmente en la
distinta susceptibilidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra.
El slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas)
Cromatografa de exclusin: La separacin se basa fundamentalmente en efectos de
exclusin, tales como diferencias en el tamao de las molculas y /o en su forma o en su
carga. El trmino cromatografa de exclusin por tamao, se puede utilizar cuando la
separacin se basa en el tamao molecular. Los trminos cromatografa de filtracin
sobre gel o permeacin sobre gel (GPC), se han utilizado para describir este proceso
cuando la fase estacionaria es un gel hinchado. El trmino cromatografa de exclusin
de iones es especfico para la separacin de iones en una fase acuosa.
Cromatografa de afinidad: Esta expresin caracteriza a una particular variante de la
cromatografa, en la que se utiliza para la separacin una interaccin biolgica
especfica entre el analito y la fase. Es un tipo especial de cromatografa de adsorcin
utilizada especialmente en bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado
ligando de afinidad que puede ser, por ejemplo, un indicador enzimtico o un
anticuerpo.

11

2.2 - Cromatografa plana

La cromatografa plana es un tipo de cromatografa liquida en la que la fase
estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna.
Existen dos tcnicas de cromatografa plana: cromatografa en papel (CP) y
cromatografa de capa fina (CCF). La CP es ms antigua y esta siendo superada por
la CCF debido a su mayor rapidez, versatilidad y reproducibilidad.
La muestra se aplica en forma de gota sobre una lmina o superficie plana;
despus de evaporado el disolvente, la lmina se coloca verticalmente en una
cmara cerrada con su extremo sumergido en la fase mvil (eluyente). Esta desplaza
los compuestos de la muestra a travs de la fase estacionaria a distinta velocidad,
teniendo lugar la separacin. Cuando el disolvente ha pasado de la mitad o dos
tercios de la longitud de la lmina se saca de la cmara y se seca ponindose de
manifiesto la presencia de las especies separadas.

Principios bsicos
La caracterizacin de los componentes se lleva a cabo mediante el factor de
retardo:
Rf = dist. recorrida por el soluto / dist. recorrida por el frente disolvente
Los valores varan de 0 a 1 pero existen muchos factores que pueden influir (T,
tamao de la cmara, naturaleza de la mezcla), para minimizar estas diferencias se
aplica el parmetro Rx:
Rx = dist. recorrida por el soluto / dist. recorrida por un patrn.
El factor de retencin o factor de capacidad viene definido por la expresin:
K= tR / t M cte . (dM dR) / cte. dR 1 RF / RF
Donde tr es el tiempo realmente invertido en la retencin de un soluto por la
fase estacionaria, es proporcional a la distancia recorrida por el frente disolvente
menos la distancia recorrida por el soluto: tR = cte . (dM- dR). Y donde t m es el
tiempo de residencia del soluto en la fase mvil, es proporcional a la distancia
recorrida por el soluto: t M= cte. d R

2.3 - Cromatografa de capa fina (CCF)

12

Se realiza en placas de vidrio o plstico recubiertos con una capa delgada de

partculas finamente divididas contenidas en la fase estacionaria. El mecanismo
predominante es la adsorcin.
Para la fase estacionaria se emplean partculas cuyo tamao oscila entre 10-25
m para facilitar el flujo e incrementar la resolucin. Tradicionalmente los
materiales mas usados han sido:
Gel de slice: es el ms utilizado, es una fase estacionaria inorgnica de
caractersticas polares; es necesario activarla por calor. Es una fase adecuada para
separar muchas sustancias: aa, alcaloides, azucares, AG
Almina: requiere aplicacin de calor (125-150 C) para obtener resultados
reproducibles y separaciones optimas
Celita: material diatomceo muy poroso y de gran rea superficial, pero su poder
de adsorcin es bajo.
Poliamidas: son de gran utilidad para la separacin de compuestos relacionados
con los fenoles al producirse interacciones entre los solutos y la fase estacionaria por
puentes de hidrogeno.
Para la

fase mvil

el disolvente a utilizar debe reunir una serie de

caractersticas:
-

Inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria.

Elevada pureza.

Adecuada viscosidad y tensin superficial.

Bajo punto de ebullicin para facilitar el secado de las placas.

Econmico,

Baja inflamabilidad y toxicidad

En la preparacin de las placas el material que constituye la fase estacionaria

se dispone en forma de suspensin y se extiende sobre la lmina de vidrio o plstico.
Es fundamental que la capa sea lo mas uniforme posible; el espesor de esta es menor
para en trabajos analticos (0,2-0,3 mm) que en cromatografas preparativas (210mm). La placa se seca al aire y se activa por calefaccin.

13

El punto critico del proceso es la aplicacin de la muestra, se hace por contacto

entre la placa y el tubo capilar que contiene la muestra en disolucin a 1-2 cm del
extremo, si no se hace adecuadamente se perturba la capa de absorbente..
La localizacin de sustancias separadas puede hacerse directamente si son
sustancias coloreadas, si son incoloras es necesario recurrir a:
Mtodos qumicos, implican una reaccin qumica ya sea especfica para un
determinado componente o general:
Vapor de yodo se adsorbe reversiblemente sobre una gran cantidad de
sustancias, origina puntos oscuros en la zona donde esta presente el compuesto en la
placa
H2SO4 concentrado se pulveriza sobre una placa de slice, permite visualizar
las sustancias orgnicas tras haber calentado la placa en una estufa.
Fluorescena

origina coloracin amarillo-verdoso en gran cantidad de

sustancias orgnicas.
Ninhidrina usada en la deteccin de aa.
Mtodos fsicos, el mas comn es la radiacin ultravioleta en combinacin con
un indicador fluorescente; la placa contiene material fluorescente cuya emisin a
254nm es inhibida por la mayora de solutos. La placa se ilumina y se ven las
manchas de soluto ms oscuras que el resto de la placa que brilla.
La CCF tiene aplicacin en anlisis cualitativo, basndose en los valores de los
RF obtenidos respecto a patrones cuyo cromatograma se ha desarrollado en las
mismas condiciones. Tambin se puede emplear en estimaciones semicuantitativas
por comparacin de la mancha del patrn con la del analito.
Cromatografa en papel
Es una tcnica muy sencilla, se utiliza una tira de papel de filtro (Whatman n 1
por ejemplo) como soporte para la separacin. El mecanismo que interviene en la
separacin fundamentalmente de reparto.
La fase estacionaria esta constituida por el agua absorbida sobre las molculas
de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser papel de filtro estndar o papel
14

especial para CP con porosidad, espesor concreto y baja concentracin de

compuestos metlicos.
La fase mvil se selecciona empricamente, se emplean mezclas consistentes en
compuestos

orgnicos,

agua

otras

especies

(cidos,

bases,

agentes

complejantes) que modifiquen la solubilidad de los compuestos de la muestra. En

la cmara cromatogrfica hay que mantener una atmsfera saturada de vapor de
disolvente para evitar la evaporacin del disolvente.
El desarrollo del cromatograma se hace en una determinada direccin y en
condiciones de humedad controlada, lugares exentos de contaminacin que pueda
adsorberse sobre las fibras de celulosa alterando las separaciones.
Si las sustancias a separar son muy solubles en agua es conveniente impregnar el
papel en un medio no acuoso para que acte como fase estacionaria.
La muestra disuelta en un disolvente voltil se aplica al papel con un capilar,
microjeringa o una micropipeta. El tamao ser de unos 2cm de dimetro y la
cantidad de muestra estar comprendida entre 10 y 50 g. El disolvente se elimina
por evaporacin.
Para la deteccin de las sustancias separadas se pueden emplear las mismas
tcnicas que en CCF excepto aquellas que impliquen el uso de reactivos que puedan
daar el papel (H2SO4 concentrado). La deteccin sobre el papel es mas sensible que
en capa fina ya que las muestras aparecen generalmente ms difusas.
La CP aun se usa en determinadas aplicaciones con finalidad didctica y para
separacin de muestras clnicas y bioqumicas as como en otras aplicaciones
analticas generales por su gran sencillez y bajo coste.

2.4 - Cromatografa en columna:

Las tcnicas cromatogrficas pueden agruparse atendiendo a diversos criterios.
Si consideramos el mecanismo de interaccin del soluto con la fase estacionaria como
criterio de agrupacin, la cromatografa en columna sera una de las tcnicas ms
ampliamente aplicadas. Desarrollada por vez primera por el botnico ruso M. S. Tswett

15

en 1903, no se redescubri hasta la dcada de los treinta, aunque experiment su mayor

auge a partir de los aos cincuenta, como prcticamente el resto de las tcnicas
cromatogrficas utilizadas hoy en da.
La cromatografa lquida en columna es la variante ms antigua de la
cromatografa, aunque su importancia prctica slo ha sido reconocida cuando su
desarrollo, catalizado por el de la cromatografa de gas, alcanz el nivel que
actualmente conocemos como cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC).

2.4.1 Principios bsicos:

Las fuerzas que dan origen a una retencin selectiva entre los analitos son
debidas a la adsorcin de stos sobre el relleno de la fase estacionaria. (El trmino
adsorcin se puede entender como una retencin del soluto por parte de los grupos
moleculares activos de la superficie de un slido; estas uniones pueden deberse a
interacciones qumicas, o ms frecuentemente a interacciones fsicas). Segn Snyder et
al (1968, 1974) el mecanismo de separacin obedece a fuerzas de retencin por parte de
grupos activos del relleno slido (fase estacionaria) que actan de manera diferencial en
los analitos que estn en la fase mvil. El mecanismo se basara en la formacin de un
complejo analito-relleno, que expresado qumicamente sera:
Xm + Ys (X-Y)s
donde Xm representa el analito X en la fase mvil e Ys representa los grupos
moleculares activos en el relleno, es decir, los centros adsorbentes en la fase
estacionaria. La especie (X-Y)s representa el adsorbato generado durante la retencin
del analito X. Algunas clases de molculas slo se adsorben dbilmente o no se
adsorben en absoluto, y son las primeras que eluyen. Las que se adsorben con ms
intensidad son las ltimas en eluir.

2.4.2 Instrumentacin:
La tcnica utilizada por el ruso Tswett es an vigente en laboratorios de
investigacin de productos naturales y en la industria farmacutica. En esta modalidad
de cromatografa la fase estacionaria est empaquetada en un recipiente cilndrico de
plstico, vidrio o metal abierto por los extremos, llamado columna. El dimetro interno
16

de las columnas en cromatografa lquida convencionales de aproximadamente 10-15

mm. El relleno de la columna se denomina lecho cromatogrfico y empaquetar la
columna es la operacin de prepararlo. La fase mvil fluir por la estructura porosa del
lecho, y el flujo de la fase mvil depender de la gravedad o de una bomba peristltica
de baja presin en la cromatografa convencional o de alta presin en la cromatografa
lquida de alta resolucin.
La disolucin problema, disuelta previamente en la fase mvil, se depositar
sobre la parte superior del lecho, y se dejar que vaya fluyendo hacia su interior,
manteniendo el extremo opuesto de la columna abierto. Cuando toda la solucin de
muestra ha penetrado, se adiciona fase mvil sobre el lecho para evitar que ste se
seque. El paso de fase mvil a travs de la columna se llama elucin.
La elucin de los solutos se registra mediante un sistema de deteccin adecuado
y se denomina cromatograma o perfil de elucin cromatogrfico. El cromatograma est
formado por una serie de curvas representadas en funcin del tiempo o volumen de
elucin, y el rea por debajo de las curvas sera proporcional a la abundancia del soluto.
Las cromatografas en columna que se realizan a baja presin, con el flujo de
fase mvil inducido por accin de la gravedad o por el empleo de una bomba
peristltica son conocidas genricamente como cromatografa convencional. Esta
modalidad tiene una aplicacin bsicamente preparativa, por ejemplo, para la
purificacin de protenas a partir de un homogeneizado, un medio de cultivo, etc. y
permite la separacin de compuestos en cantidades notables a partir de volmenes
grandes.

Los equipos de cromatografa convencional constan de un depsito que

contiene el eluyente conectado a la columna en la que se encuentra el lecho

cromatogrfico y de la cual se recogen los eluidos conforme van saliendo de la
columna; los eluidos son fraccionados y recogidos por el operario o mediante un
colector de fracciones. La diferencia de alturas entre el recipiente que contiene el
eluyente y la recogida de la muestra produce una presin hidrosttica que es la que
conduce el flujo de la fase mvil. Cuando la columna es larga, el lecho cromatogrfico
ofrece una mayor resistencia al paso de eluyente; en estos casos es necesario utilizar
una bomba peristltica de baja presin.

17

El colector de fracciones est constitudo por una clula fotoelctrica sobre la

que incide un fino haz de luz. Cuando las gotas de eluido interceptan el rayo ptico se
genera una seal elctrica que permite programar la recogida de alcuotas de eluyente de
forma automtica. La deteccin de los solutos que emergen de las columnas se realiza
midiendo la absorbancia del eluido mediante un espectrofotmetro. Los datos de la
absorbancia permiten obtener el perfil de elucin.
El empaquetamiento de la columna es posible realizarlo con diversos materiales:
almina, slica, carbonato de calcio, sephadex, polisacridos u otros polmeros
sintticos. En los inicios de la cromatografa las columnas se empaquetaban con
diversos rellenos slidos, sobre todo la almina, y las partculas del relleno rondaban las
75 micras de dimetro; ms tarde se comprob que disminuyendo el tamao medio de la
partcula del relleno (10-5 micras) era posible conseguir una mejora en la calidad de las
separaciones. Sin embargo, esto condicion en gran medida los tiempos de anlisis, que
podan llegar a durar varias horas o das. Al ir disminuyendo el tamao del poro fue
necesaria la instalacin al inicio de la columna de un sistema de bombeo que superara la
resistencia del relleno y que adems diese un flujo de fase mvil que pudiese ser
controlado a lo largo de la cromatografa. De esa manera se consigui adems acortar
los tiempos de anlisis de las columnas gravitatorias. stas se han quedado casi
exclusivamente en labores preparativas (como se ha comentado anteriormente) o bien se
han ido transformando en la cromatografa de diseo plano (cromatografa de capa fina,
TLC) o en papel (PC). Sin embargo, en la industria todava se siguen utilizando
columnas de gran dimetro y longitud para la obtencin de sustancias.
La fase mvil, en la que ir disuelta la muestra, suele ser distinta en funcin de
la muestra a analizar, y se elegir aquella que permita una mejor separacin de los
componentes de la muestra. Los solventes ms frecuentemente utilizados son el ter o
exano, tolueno, cloroformo, acetona, etanol, e incluso agua. Generalmente estos
solventes se suelen combinar entre s, en las proporciones adecuadas.

18

3 - CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

Al final de la dcada de 1960, los avances obtenidos en el desarrollo de la

instrumentacin cientfica consiguieron que fuese posible el anlisis de mezclas
complejas por cromatografa de gases en cuestin de minutos o incluso segundos,
pudindose detectar, en las condiciones ms favorables, cantidades de sustancias del
orden de los nanogramos, y algunas veces de los picogramos. Sin embargo, para
muestras no voltiles, la cromatografa lquida clsica, no alcanzaba la eficiencia y la
sensibilidad de la CG, ya que, en muchas ocasiones, era necesario invertir horas para la
elucin, recoger fracciones de forma manual conteniendo miligramos o gramos de
material eluido y utilizar litros de disolvente. Era, pues, necesario lograr que la
cromatografa lquida ( CL ) proporcionase unas prestaciones similares a las logradas
con la cromatografa de gases (CG) . Para ello, tena que acelerarse, automatizarse y
adaptarse a muestras mucho ms pequeas. Esta tecnologa requera una
instrumentacin sofisticada, que permitiera poder trabajar a altas presiones, lo cual
contrastaba con la las simples columnas de vidrio de la cromatografa de liquidos
clsica en la que el caudal se deba a la gravedad. Como consecuencia de los esfuerzos
efectuados en estas direcciones surgi la moderna Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (CLAR), tambin denominada HPLC del ingls High Performance Liquid
Chromatography

3.1 Fundamentos y principios bsicos

Los principios bajo los cuales se asienta la HPLC son los mismos que los de la
cromatografa liquida. Sin embargo para optimizar su rendimiento fue necesario hacer
algunos cambios.
El primer aspecto considerado para optimizar la CL clsica fue incrementar la
velocidad de la fase mvil, lo cual puede hacerse sin demasiados problemas mediante la
utilizacin de bombas adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar

19

sometido el lquido a presiones elevadas. Sin embargo, con fases estacionarias

convencionales, el empleo de altas velocidades de fase mvil implica una prdida de
resolucin. Para mejorar sta se hace necesario modificar el empaquetamiento de la fase
estacionaria, lo cual se considerar seguidamente en conexin con la ecuacin de Van
Deemter, que, aunque desarrollada para cromatografa en fase gaseosa, es razonable
considerar que el ensanchamiento de las bandas en CL se debe al mismo tipo de
factores.

B
H = A + + Cu
u
A = Difusin por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase mvil.
B = Difusin longitudinal del soluto a lo largo de la columna.
C = Equilibrio del soluto entre las fases mvil y estacionaria no suficientemente rpido.
u= Velocidad lineal media de la fase mvil.
La resolucin en cromatografa lquida se mejora al disminuir el tamao de las
partculas de la fase estacionaria, lo cual, en primer lugar, reduce el trmino A de la
ecuacin de Van Deemter, ya que las trayectorias seguidas por la fase mvil son ms
uniformes en el caso de partculas de menor tamao.
En relacin con la difusin longitudinal, B/u, este trmino es importante en
cromatografa de gases, pero como la difusin es mucho ms lenta en los lquidos, el
ensanchamiento de las bandas por este motivo en CL slo es significativo cuando la
velocidad de flujo es excesivamente lenta.
El trmino de resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental, ya que,
con velocidades de flujo elevadas, se conseguirn bajas resoluciones, al menos que la
transferencia de solutos entre las fases mvil y estacionaria sea muy rpida. A esto
colabora decisivamente la reduccin del tamao de las partculas de la fase estacionaria.
Los materiales que normalmente se utilizan en cromatografa lquida convencional estn
constituidos por partculas de tamao relativamente grande (150 m o ms) y con poros
profundos. Estos poros se llenan con porciones estancadas de fase mvil y es posible
que las molculas de soluto penetren en ellos a una profundidad tal que su regreso por
difusin al lquido mvil sea lento. Esto es favorable en CL convencional, que trabaja
20

con lentas velocidades de flujo, pero cuando se opera con velocidades de flujo elevadas
se origina un ensanchamiento de bandas excesivamente grande.
Los primeros intentos satisfactorios para mejorar las prestaciones condujeron a
la utilizacin de fases estacionarias de partculas peliculares, constituidas por
partculas esfricas de un material slido no poroso (frecuentemente bolitas de vidrio de
unos 40 m de dimetro) recubiertas de una capa superficial porosa y de espesor muy
pequeo (entre 1 y 3 m). Esta capa puede ser gel de slice, almina o geles de
poliamida .De esta forma, la presencia de poros superficiales facilita considerablemente
el proceso de transferencia de masa. Sin embargo, debido al pequeo espesor de la
pelcula porosa, el volumen de la fase estacionaria, Vs, es pequeo, por lo que este tipo
de columnas no resultan adecuadas para cromatografa preparativa.
Por ello, en poca relativamente reciente, se ha incrementado el uso de una
nueva generacin de materiales de partculas microporosas con tamaos inferiores a
30 m y que son totalmente porosos.
En cualquier caso, tanto con partculas peliculares como con partculas
microporosas, el precio a pagar es la elevada resistencia al flujo. Por ello es necesario
utilizar presiones elevadas para forzar el paso de lquido a travs de la columna.
Normalmente se requieren presiones que pueden llegar a ser de hasta 200 atmsferas
para velocidades de flujo de 0,5 a 5 mL/min.

21

3.2 - Instrumentacin
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC son:
Depsitos para la fase mvil.
Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil.
Dispositivo para la introduccin de la muestra.
Columna cromatogrfica.
Detector.
Sistema para el tratamiento de datos y registrador.

Columnas cromatogrficas: Como algunas fases mviles usadas en la HPLC son

qumicamente activas , como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los
componentes del sistema estn fabricados con materiales resistentes a esos posibles
ataques. Por ello las columnas son de acero inoxidable, de un dimetro interno de 2-5
mm y una longitud variable de 10 30 cm, dependiendo del dimetro de las
micropartculas de la fase estacionaria. Como cierre de las columnas se utilizan placas
filtrantes de acero que no dejen escapar las micropartculas de la columna. En muchos
casos se utiliza una pre-columna para eliminar contaminantes y partculas de polvo.
La mayor parte de los sistemas estn provistos de calentadores de columna,
que controlan la T desde la cercana al ambiente hasta 150 C. Manteniendo la T
constante se obtienen mejores resultados.

22

Existe una gran variedad de materiales de relleno de las columnas cromatogrficas

segn las distintas separaciones. Bsicamente, las micropartculas utilizadas estn
compuestas de slice, aluminio y resina. Como ya hemos mencionado pueden ser de dos
tipos:
1. Partculas enteramente porosas, de forma irregular y dimetro 3-10 m.
2. Partculas esfricas de superficie porosa, con dimetros de 30-60 m.y
con un ncleo que no se puede atravesar.
Son necesarias bombas de presin de varios centenares de atmsferas para conseguir
velocidades de flujo razonables debido a la resistencia que ofrecen las micropartculas.
Como consecuencia, el equipo de HPLC es ms costoso y elaborado que el de otro tipo
de cromatografas. Las elevadas presiones que generan las bombas, no constituyen un
peligro de explosin, puesto que los lquidos no son muy compresibles.
Se dispone de varios reservorios de disolvente que pueden contener cada uno ms de
500ml. Es necesario que estos reservorios vayan acompaados de desgasificadores para
eliminar los gases del disolvente, pues producen burbujas en la columna interfiriendo en
los resultados.
Para una buena eleccin de la fase mvil o disolvente, hay que tener en cuenta que la
interaccin con la fase estacionaria debe ser ptima y la separacin debe ser lo mas
rpida posible. Los parmetros que determinan el disolvente a utilizar son: viscosidad,
transparencia al ultravioleta, punto de ebullicin, ndice de refraccin, inercia frente a la
muestra, resistencia a la corrosin, toxicidad, precio y mantenimiento.
El sistema de inyeccin de las muestra que mas se emplea se basa en lazos de
muestreo, que son bucles o vlvulas dosificadoras que permiten la aplicacin
cuantitativa y reproducible a presin elevada. Proporcionan una seleccin del tamao de
la muestra que va desde 5 a 500 l. La muestra se pasa primero al bucle sin presin,
para luego pasar a la columna accionando el flujo de disolvente con una llave de varias
vas o vlvulas de membrana.
La muestra no debe contener slidos para que no se atasque la columna, si es necesario
deber filtrarse por un filtro de membrana o pre-columna. Lo mejor es disolver la
23

muestra en el eluyente que se vaya a emplear en la separacin. El volumen inyectado de

la muestra debe ser lo mas pequeo posible, para que los resultados aparezcan mas
ntidos.
Para la HPLC se suelen utilizar distintos detectores dependiendo de la la naturaleza de
la muestra:
1 - Detectores selectivos: responden a una propiedad del soluto en disolucin.
Son los detectores de fluorescencia, los detectores electroqumicos y los detectores
ultravioleta/visible (UV/Vis). Ahora bien, algunos autores consideran a estos ltimos
detectores universales.
Los detectores ultravioleta/visible son los ms utilizados, sobretodo el
espectrofotmetro, que registra sustancias que absorben la radiacin ultravioleta o
visible. Los hay muy sensibles, son relativamente independientes de las oscilaciones de
temperatura y se pueden utilizar en la elucin en gradiente.
2 Detectores universales: responden cuando una propiedad de la fase mvil es
cambiada por la presencia de soluto. Son el detector del ndice de refraccin (RI) y el
detector de conductividad.
El ms utilizado es el detector RI, que registran todas aquellas sustancias
que presenten un RI diferente al de la fase mvil pura. La seal ser tanto mayor cuanto
mayor sea la diferencia en el RI. Es necesario un control estricto de la temperatura y no
se pueden utilizar para separaciones por elucin en gradiente.
Un detector ideal en HPLC deber reunir las siguientes caractersticas:
Sensibilidad elevada.
Buena estabilidad y reproducibilidad.
Amplio margen de respuesta lineal.
Pequeo tiempo de respuesta, independiente de la velocidad de flujo.
Pequeo volumen muerto, para minimizar el ensanchamiento de las bandas
cromatogrficas.
Insensible a cambios en la presin y la temperatura.
Respuesta independiente de la composicin de la fase mvil.
No destructivo.

24

3.3 - Aplicaciones al anlisis de alimentos:

La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o
grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente.
Como condicin, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la
fase mvil un lquido.
Es la tcnica analtica de separacin mas ampliamente utilizada debido a sus
cualidades de sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y su
gran adaptabilidad a sustancias que son de gran inters para la industria, la ciencia y la
sociedad.
El empleo de HPLC en sus muchas variantes se ha especializado mucho.
Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminocidos, protenas,
cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenos, plaguicidas,
antibiticos, esteroides y una gran variedad de sustancias inorgnicas.
Dentro de la alimentacin la HPLC se utiliza para:

Deteccin y cuantificacin de sacarina benzoatos, cafena y aspartante en

refrescos.

Deteccin de ciclomato en jugos de fruta.

Separacin de esteres de cidos grasos por fase inversa y con argentacin de

columnas( Silicato de Al con Ag)

Separacin de triglicridos por la longitud de la cadena y el grado de

instauracin por fase inversa y detector de dispersin luminosa, para el estudio
de aceites y grasas adulteradas.

Determinacin del contenido de Vit A y sus precursores ( y caroteno) en

margarina y aceites de hgado por fase inversa.

Determinacin del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase

normal.

25

4 - CROMATOGRAFA DE GASES

4.1 - Fundamentos y principios bsicos

La cromatografa de gases es una de las tcnicas mas usadas en anlisis
cualitativos y cuantitativos, para analitos fcilmente voltiles. En esta, los
componentes de una muestra vaporizada se separan como consecuencia de su
reparto entre una fase mvil gaseosa y otra fase estacionaria liquida o slida
mantenida en una columna.
Al realizar una separacin cromatogrfica de gases, la muestra se vaporiza y se
inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se logra mediante el
flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de muchos otros tipos de
cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito, sino que
su nica funcin es transportar el analito a lo largo de la columna. Hay dos tipos de
cromatografa de gases:
-

Cromatografa de gas-slido: la fase mvil es un gas, y la estacionaria es

un slido que retiene los analitos por adsorcin fsica. La cromatografa de
gas-slido permite la separacin y determinacin de gases de bajo peso
molecular, como los componentes del aire, sulfuro de hidrogeno, monxido
de carbono y xidos de nitrgeno.

Cromatografa de gas-liquido: suele abreviarse a cromatografa de gases

(CG) y se utiliza bastante. En sta, la fase mvil es un gas y la estacionaria
o inmvil es un liquido retenido sobre la superficie de un slido inerte por
absorcin o por enlaces qumicos.

4.2 - Instrumentacin en cromatografa de gas-liquido

Desde su introduccin comercial han ocurrido muchos cambios y mejoras en los
instrumentos de cromatografa de gases. Las dcadas de 1980 y 1990 contemplaron
el uso de ordenadores en el control automtico de muchos parmetros
instrumentales, como la temperatura de la columna, velocidades de flujo e inyeccin
26

de la muestra; el desarrollo de instrumentos de muy alto rendimiento a coste

moderado y el desarrollo de columnas tubulares abiertas, que permiten separar los
componentes de mezclas complejas en periodos relativamente breves.
El cromatgrafo de gases esta compuesto por las siguientes partes:
- Gas portador:
Acta como fase mvil y transporta los componentes de la muestra a travs de la
columna y hasta el detector, deber ser una especie qumicamente inerte respecto al
analito y relativamente barata, ya que es expulsado a la atmsfera al final del
proceso cromatogrfico. En la prctica, los gases ms utilizados son: helio,
nitrgeno, hidrogeno, argn y dixido de carbono.
La eleccin de la fase mvil se hace normalmente en funcin del coste,
disponibilidad e inercia qumica, as como tambin en funcin del detector utilizado
y, ocasionalmente en cuanto a la eficiencia de la separacin.
Un factor muy importante en las separaciones por cromatografa de gases es el
ajuste del caudal, ya que este condiciona la velocidad de la separacin.
Normalmente los caudales se controlan mediante un regulador de presin de dos
niveles, colocado en la botella de gas, y algn tipo de regulador de presin instalado
en el cromatgrafo.
Los caudales pueden determinarse mediante un rotametro situado a la cabeza de la
columna, ya la forma ms exacta es utilizar un simple medidor de pompas de jabn
colocado en la salida de la columna.
-Sistema de inyeccin de la muestra:
Las muestras a separar pueden ser de diferente naturaleza y estado fsico, pero
necesariamente han de pasarse al estado de vapor. El procedimiento de vaporizar las
muestras y de introducirlas en la columna tiene gran importancia desde el punto de
vista de la eficacia en la separacin.
Para que se cumplan las condiciones tericas del mecanismo de la separacin, la
muestra ha de absorberse totalmente en el primer plato de la columna sin mezclarse
con el gas portador. Sin embargo, como en la practica la inyeccin no es
instantnea, la muestra se mezcla en cierta medida con el gas portador y no se fija
totalmente en el primer plato; el proceso de separacin se inicia simultneamente en
varios platos a la vez, lo que origina un ensanchamiento de las bandas
cromatogrficas.

27

Por otra parte, es importante que el tamao de muestra sea el adecuado a las
caractersticas del equipo utilizado.
En resumen, deber inyectarse la cantidad adecuada de muestra, en el menor tiempo
posible y conseguir la vaporizacin total de las muestras no gaseosas (las muestras
slidas y liquidas se introducen usualmente como disoluciones diluidas de un
disolvente voltil).
-Columnas de separacin y fases estacionarias:
Constituye la parte esencial del sistema cromatogrfico y de ella depende el xito o
fracaso del anlisis cromatogrfico. Hasta hace poco, la mayor parte

de las

cromatografas de gases se realizaban con columnas empaquetadas o de relleno,

mientras que actualmente se realizan ms las columnas tubulares abiertas o
capilares.
Columnas empaquetadas: tubos de vidrio o acero inoxidable que se llenan con un
soporte slido de grano fino, recubierto de una capa delgada de un lquido no voltil
que acta de fase estacionaria. Una buena columna empaquetada puede contener
entre 1000 y 2000 platos tericos por metro, mientras que las columnas capilares
pueden llegar hasta los 10000 platos por metro.
Columnas capilares: son mucho mas estrechas y suelen ser mucho mas largas que
las columnas empaquetadas. Los tipos mas importantes son de pared recubierta, con
soporte recubierto y de capa porosa.
-

Detectores:

En cromatografa un detector funciona comparando una propiedad fsica entre el gas

portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que
previamente se han separado en la columna, esta accin se traduce en una seal tipo
elctrica, que posteriormente se amplificar mediante un registrador grfico o
integrador permitiendo indicar el momento que salen de la columna los
componentes.
Los solutos eluidos de una columna cromatogrfica se ponen de manifiesto
mediante detectores que deben medir el componente minoritario en mezclas binarias
muy diluidas. Suelen agruparse de diferentes formas:
1 - Integrales/diferenciales: proporcionan en cualquier instante una medida de la
cantidad total del material eludo desde que comienza la deteccin. Los

28

cromatogramas consisten en una serie de escalones cuyas alturas indican las

cantidades de soluto.
El detector diferencial responde a la primera derivada de la variacin de la
concentracin del efluente en funcin del tiempo, y el cromatograma consiste en una
serie de picos. Estos tienen mayor versatilidad respecto a los integrales.
2 - Destructivos/ no destructivos: los destructivos descomponen las sustancias
durante el proceso de deteccin y suelen responder a la velocidad a la que la muestra
pasa por el sistema de deteccin (flujo msico).
Los no destructivos tienen la propiedad de no alterar los compuestos medidos y
responden generalmente a la concentracin del compuesto medido en gas portador.
En cromatografa de gases preparativa o en sistemas multicanales con varios
detectores montados en serie se han de emplear detectores no destructivos.
3 - Discriminativos/ no discriminativos: los no discriminativos dan informacin de
la cantidad de muestra eluda, pero no la identifican. Como los datos de retencin
por si solos no suelen ser suficientes para caracterizar de forma inequvoca las
sustancias, se tiende a utilizar detectores discriminativos. Los ms empleados son el
espectrofotmetro de masas y el de infrarrojo.
Los detectores mas utilizados son el de conductividad trmica (TDC), el de
ionizacin de llama (FID) y el de captura electrnica (ECD).

4.3 - Aplicaciones al anlisis de alimentos:

Separacin e identificacin de azucares de forma cualitativa y cuantitativa

despus de una conversin a derivados voltiles termoestables.

Determinacin rpida y precisa de la composicin de los cidos grasos en los

aceites y las grasas tras efectuar la conversin de los esteres de triglicridos en
esteres metlicos, que son mas voltiles. As se conoce con mas detalle le
composicin isomrica, geomtrica, y posicional de los triglicridos en los
cidos grasos.

Identificacin y determinacin de esteres metlicos en cidos grasos

poliinsaturados individuales.

29

Determinacin del contenido de ismeros trans en aceites, grasas y alimentos

grasos

Separacin entre y tocofenol ( UPLE )

Separacin y determinacin de alcoholes de azcar derivados del trimetilsilileter

(TMS)

Determinacin del sorbitol, el manitol y el xilitol de las frutas en capilares de

vidrio.

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5 BIBLIOGRAFA

Chromatography. Concepts and contrasts. 2 ed. (2005). James M. Miller.

Wiley-interscience.

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Prez, C. Ed. Ariel Ciencia, S.A. 1 edicin Enero 2002.

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Lorenzo, M. del Carmen Casais. Ed. Sntesis.

Tcnicas instrumentales en bioqumica y biologa. 1 ed (2003). Francisca

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