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LABORATORIO DE BIOLOGA
CURSO: BIOLOGA MOLECULAR Y CELULAR
PROFESOR: MANUEL ALVIS DAVILA
INFORME DE PRCTICA
PRCTICA N: 10
TTULO: FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS
INTEGRANTES:
- MENDOZA TELLO, ARIADNA
- PASACHE RISCO, ANGELA
- RAFAEL BADILLO, ASTRID
HORARIO de PRCTICAS:
DIA: MARTES
HORA: 10am - 12pm
FECHA de REALIZACIN de la PRCTICA: 17 de junio del 2014
FECHA de ENTREGA del INFORME: 24 de junio del 2014
LIMA PER
I INTRODUCCIN
La electroforesis es una tcnica que se utiliza con frecuencia para fraccionar
protenas, as como para detectar el producto de una PCR. Depende de
la capacidad de molculas cargadas para migrar cuando se colocan en
un campo elctrico.
La separacin electrofortica de protenas casi siempre se realiza por
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), en la que las protenas
son impulsadas por una corriente que se aplica a travs de una matriz
gelatinosa. La matriz se compone de una pequea molcula orgnica
(acrilamida) que establece enlaces cruzados para formar un tamiz
molecular, una especie de filtro.
El movimiento relativo de las protenas por un gel de poliacrilamida depende
de la densidad de carga (carga por unidad de masa) de las molculas.
Mientras mayor sea la densidad de carga, la protena se impulsa con ms
fuerza por el gel y, por tanto, la migracin es ms rpida. Sin embargo, la
densidad de carga es solo un factor importante en el fraccionamiento por
PAGE: el tamao y la forma tambin influyen. La poliacrilamida forma un
tamiz molecular con enlaces cruzados que enreda las protenas que pasan
por el gel. Entre mayor sea la protena, ms se enreda y migra con ms
lentitud. La forma tambin es un factor importante, ya que las protenas
globulares compactas se mueven ms rpido que las protenas fibrosas
alargadas de masa molecular similar. La concentracin de acrilamida (y el
agente de los enlaces cruzados) que se emplea para hacer el gel es otro
factor importante. A menor concentracin de acrilamida, menos enlaces
cruzados se forman en el gel y la migracin de una molcula protenica
determinada puede ser ms rpida.
El progreso de la electroforesis se sigue al observar la migracin de un tinte
rastreador cargado que se mueve justo por delante de las protenas ms
rpidas. Despus que el tinte rastreador se movi a la localizacin deseada,
la corriente se corta y el gel se retira de su recipiente. Por lo general, el gel
se tie con azul Coomassie o tincin de plata para revelar la localizacin de
las protenas.
Objetivos
1. Familiarizarse con la tcnica de electroforesis en gel
2. Comprender los conceptos que estn involucrados en la separacin
de cidos nucleicos en una corrida electrofortica
3. Visualizar la muestra de ADN aislada de la prctica anterior
II RESULTADOS
El siguiente cuadro indica la muestra en cada carril, su volumen y el grupo
del cual se tom la muestra:
CARRIL
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
MUESTRA
ADN Ladder
ADN total
PCR amplificado
PCR amplificado
PCR amplificado
PCR amplificado
ADN Ladder
ADN total +
ECORI
ADN total +
ECORI
ADN total
ADN Ladder
VOLUMEN
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
1 L
GRUPO
1 L
Al azar
1 L
1 L
Al azar
Al azar
I
II
III
IV
Al azar
Carril 1:
Se encuentra el ADN ladder o ADN marcador como una escalera que
indica el intervalo de tamao de los fragmentos de ADN en pares de bases
(pb)
Carril 2:
Se visualiza una banda oscura y gruesa de ADN en la parte superior
Carril 3:
No se ve banda de ADN alguna
Carril 4:
No se ve banda de ADN alguna
Carril 5:
Se visualiza una banda de color grisceo, gruesa de ADN en la parte central
Carril 6:
Se visualiza una banda de color plomo, gruesa (un poco ms gruesa que la
del carril 5) de ADN en la parte central
Carril 7:
Se encuentra el ADN ladder o ADN marcador
Carril 8:
Se visualizan fragmentos de ADN en bandas intercaladas desde la parte
superior hasta antes de la parte central
Carril 9:
Se visualizan fragmentos de ADN en bandas intercaladas desde la parte
superior hasta antes de la parte central. A diferencia del carril 8, estas
bandas son un poco ms gruesas
Carril 10:
Al igual que en el carril 2, se ve una banda oscura y gruesa de ADN en la
parte superior
Carril 11:
Se encuentra el ADN ladder o ADN marcador
los
en
las
del
Carril 3 y 4:
La deteccin del producto de una PCR se realiza normalmente mediante una
corrida electrofortica. Es as que, despus de la extraccin de ADN
mediante el Kit de Extraccin Pureling-genomic (Invitrogen) y su respectiva
cuantificacin, se realiz PCR para amplificar en forma exponencial un
fragmento de ese ADN.
Para la ejecucin de cada procedimiento se sigue un protocolo. Los pasos a
seguir en el protocolo son sumamente especficos, por lo que un error en el
cumplimiento de estos lleva a errores relevantes en los resultados. En este
experimento, en la segunda etapa de la PCR, la etapa de hibridacin, donde
los cebadores (tambin llamados primers) especficos para protenas globina, hibridan las secuencias complementarias del ADN molde, la
temperatura debe ser de 55 C. Si es que hay una alteracin de la
temperatura durante este proceso, el cebador no podr actuar de manera
ptima cumpliendo su funcin de marcar el sitio donde luego actuar la ADN
Polimerasa.
Es as que el sitio de anclaje no se marca adecuadamente y al final se
adicionan secuencias de nucletidos en distintos sitios o en ninguno, lo
que, ltima instancia, lleva a que no se vea ADN como banda en el gel de
poliacrilamida: este es el caso de este par de carriles (3 y 4).
Tambin ha podido surgir una alteracin al momento del incremento de la
temperatura a 72C, temperatura ptima para la realizacin de la tercera
etapa de la PCR: la etapa de elongacin. Los cebadores pudieron haber
actuado eficazmente su funcin; sin embargo, la ADN polimerasa, por
cambios en la temperatura, no pudo adicionar los nucletidos. Es as que no
ha habido producto de PCR, por lo que no se ha mostrado ADN en la
electroforesis.
Carril 5 y 6:
Los resultados de los carriles 5 y 6 muestran que el protocolo se sigui con
mayor cuidado que en los carriles 3 y 4. La banda de ambos carriles se
ubic en el centro. Debido a que es una molcula relativamente pequea
(posee 150 pb, lo cual es confirmado por su medicin con el ADN marcador),
su velocidad de migracin a travs del gel de poliacrilamida durante la
corrida electrofortica fue rpida. Es as que el ADN se situ en la parte
inferior.
Expression Technologies Inc. [en lnea] (2003) DNA ladders/DNA markers for
gel electrophoresis. [fecha de acceso 23 de junio del 2014]. Recuperado de:
http://www.exptec.com/DNA%20ladders%20and%20DNA%20markers.htm
Garca H. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad
e importancia. Univ DIAG 2001; 1 (2): 31 - 41
Karp G. En: Mc Graw Hill Interamericana. Tcnicas en Biologa Celular y
Molecular. 6ta edicin. Mxico D.F.: Biologa Celular y Molecular: Conceptos y
experimentos; 2011. p. 737 - 753.