AS ROTAS PARA O ETANOL CELULSICO NO BRASIL

Marcos S. Buckeridge, Wanderley D. dos Santos & Amanda P. de Souza

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Resumo
Neste captulo, propomos que a produo de etanol celulsico a partir de cana de
acar possa ocorrer em quatro geraes. A primeira seria o que j existe, ou seja, a
produo de sacarose a partir de colmo de cana de acar. A segunda seria a produo
de etanol a partir de acares produzidos pela hidrlise cida do bagao. A terceira
compreende a produo de acares a partir da parede celular, usando enzimas de
microorganismos. A quarta gerao compreenderia uma integrao de todas as geraes,
mas com uma matria prima (variedades de cana) modificadas geneticamente e capazes
de realizar modificaes na parede celular que tornariam mais eficiente o processo da
terceira gerao. Para explicar como seriam estes processos, revisamos brevemente o
conhecimento sobre a estrutura de polissacardeos de parede celular e comentamos
sobre a existncia de genes que codificam para enzimas hidrolticas da prpria cana que
poderiam ser utilizadas para a produo de etanol celulsico. A idia de utilizar a parede
celular pode ser expandida para outras espcies, como o eucalipto e sementes de rvores
de espcies nativas de biomas brasileiros.
Salientamos tambm a importncia de que as estratgias de produo de etanol
celulsico se coadunem com processos que sejam ambientalmente corretos, como os
sistemas agroflorestais. Propomos que o Brasil tem neste momento a oportunidade e
deve aproveitar a chance de produzir energia renovvel de forma limpa e eficiente.

Introduo
As mudanas climticas e a elevao nos custos do petrleo aliadas s
necessidades estratgicas de produo de energia tm motivado uma corrida sem

precedentes produo de combustveis alternativos, preferencialmente de fontes

renovveis. Neste cenrio, o Brasil desponta como o pas com as tecnologias e polticas
mais avanadas do mundo devido pioneira utilizao do etanol obtido a partir da cana
de acar como combustvel, desde a dcada de 1970. Hoje, o Estado de So Paulo o
maior produtor de etanol no Brasil sendo, portanto, o segundo maior produtor depois
dos EUA com da produo mundial de etanol.
Alm da tradio, variedades altamente selecionadas, processos industriais
sofisticados, clima e disponibilidade de terras agricultveis garantem ao Brasil uma
liderana confortvel na tecnologia da produo de etanol. Entretanto, para preservar
essa posio num cenrio competitivo, o Brasil precisa manter investimentos
compatveis na gerao de novas tecnologias e formao de competncias. Atualmente,
a converso de material lignocelulsico ou biomassa em acares fermentveis para
produo de etanol vem sendo considerada como uma alternativa promissora para
aumentar a produo de etanol necessria para atender demanda mundial.
A celulose, principal componente da biomassa, o polmero mais abundante da
Terra. Ele formado por uma cadeia linear de molculas de glicose ligadas entre si na
posio beta () -1,4. Tais ligaes guardam energia livre e podem ser quebradas para
liberar acares fermentveis. Entretanto, a celulose muito bem protegida pelas
plantas, a fim de que no sejam facilmente utilizadas por predadores. Por esse motivo, o
rendimento lquido da converso da celulose em glicose livre e, a seguir, em etanol
desfavorvel, com as tecnologias disponveis. Tornar os rendimentos favorveis
possibilitar o melhor aproveitamento dessa rica matria prima natural encontrada no
s no bagao da cana, mas em quaisquer outras fontes de biomassa vegetal (madeiras,
serragens, palhadas, cascas, etc.) atualmente desperdiadas ou utilizadas de formas
menos nobres. O desenvolvimento de tecnologias capazes de desmontar a parede celular
vegetal requer o aprofundamento do nosso conhecimento sobre a fisiologia e estrutura
da parede celular tanto da prpria cana de acar como de outros sistemas. Alm disso,
o estudo de processos enzimticos de microorganismos que naturalmente j se
alimentam da parede celular e, portanto, j possuem enzimas especficas para tal
finalidade, podem nos auxiliar na utilizao da energia disponvel nestes
polissacardeos.

Perspectivas na Produo de Etanol Celulsico

A produo de etanol a partir da cana-de-acar ocorre, atualmente, pela
fermentao alcolica da sacarose. Diante das perspectivas de se obter o etanol
celulsico, o etanol obtido da sacarose, assim como o obtido a partir do amido de milho,
nos EUA, tem sido chamado de etanol de primeira gerao. Dessa forma, o etanol
celulsico produzido a partir dos polissacardeos da parede celular vegetal
denominado etanol de segunda gerao. No entanto, para a produo do etanol
celulsico, prevemos diversas etapas que podem ser claramente distinguidas: 1)
hidrlise qumica; 2) enzimtica; e 3) auto-hidrlise. Por este motivo, propomos que
seja chamado de etanol de segunda gerao somente aquele obtido pela hidrlise
qumica da parede celular. Esse processo utiliza solventes cidos ou bsicos para
afrouxar e quebrar os polmeros da parede celular vegetal liberando mono e
oligossacardeos fermentveis. Porm, alm dos custos dos produtos qumicos
empregados poder haver a produo colateral de resduos qumicos. Nossa expectativa
que a combinao de processos biolgicos na hidrlise dever render um processo
ainda mais eficiente. E, por ser um processo que demanda um input maior de estudos e
tecnologia para ser disponibilizado, denominamos este processo de etanol de terceira
gerao. Acreditamos que o maior gargalo neste processo ser a produo em escala
comercial de enzimas hidrolticas e microorganismos selecionados e/ou modificados
para essa finalidade. Assim, ns nos arriscamos a ir alm e sugerimos o que
denominamos etanol de quarta gerao no qual a prpria planta poder ser modificada
geneticamente para produzir as enzimas necessrias digesto de sua prpria parede
celular (acima denominado auto-hidrlise) minimizando ainda mais os custos da
produo (Figura 1).
Alm dos mtodos de hidrlise da parede, o avano no conhecimento sobre a
fisiologia de plantas utilizadas para a produo de etanol, o emprego de ferramentas de
engenharia gentica e industrial devero desempenhar importantes papis no aumento
da produtividade do etanol, independentemente da gerao. Mas antes de detalharmos
os principais aspectos das diferentes geraes, vejamos o que a parede celular.

Figura 1 Esquema das rotas propostas para obteno do etanol celulsico.

A parede
Toda clula vegetal possui parede celular. Ela determina o tamanho e a forma da
clula, confere resistncia mecnica e proteo contra o ataque de predadores e
patgenos, promove a adeso entre as clulas, delimita o tamanho e propriedades
qumico-fsicas das molculas que tm acesso ao interior da clula, controla o nvel de
umidade e ainda pode funcionar como reserva.
A parede celular composta por uma mistura de polissacardeos, protenas,
compostos fenlicos e sais minerais. Os polissacardeos representam cerca de 90% do
peso seco da parede e consistem em celulose, que compe de 20-40% da parede celular,
hemiceluloses (15-25%) e pectinas (~30%). Essa matriz altamente ordenada e
dinmica podendo tornar-se mais rgida ou mais frouxa conforme as necessidades
ontognicas e comportamentais da clula ou da planta.
Seis a oito molculas de celulose se alinham paralelamente para formar uma
fibra onde ocorre a completa expulso das molculas de gua, tornando a microfibrila
extremamente longa e resistente. Sobre a superfcie das microfibrilas, aderem-se as

hemiceluloses (polmeros heterogneos que so classificados de acordo com a

composio em monossacardeos) que cobrem a celulose formando o chamado domnio
celulose-hemicelulose da parede celular (Figura 2). As hemiceluloses impedem que as
molculas de celulose de fibras paralelas colapsem entre si, mas tambm permitem a
interao fraca entre uma fibra e outra, formando uma rede. O domnio celulosehemicelulose fica imerso em um domnio formado por pectinas, que so acares
altamente ramificados que dentre outras funes, determinam a porosidade da parede e
sinalizam a presena de organismos patognicos e insetos (Buckeridge et al. 2008).
As principais hemiceluloses encontradas em plantas so os xiloglucanos (XyG),
os glucuronoarabinoxilanos (GAX) e os mananos (MN). Em todos os casos, h uma
cadeia principal de monossacardeos de glicose, xilose e manose, respectivamente, que
pode ser ramificada com diferentes monossacardeos (Figura 3). Os XyG so os mais
abundantes, encontrados na maioria das eudicotiledneas. Os GAXs ocorrem em maior
proporo em paredes celulares de gramneas (famlia Poaceae) e os MN so de ampla
ocorrncia, mas geralmente aparecem em baixa proporo, exceto em alguns grupos de
samambaias (Pteridophytae) (Silva, 2005a). De fato, pode-se dizer que todas as
hemiceluloses ocorrem em todas as espcies, mas em diferentes propores. Uma
exceo so os chamados glucanos de ligao mista ou -glucanos (BG) que so
compostos de uma cadeia no ramificada de glicose com ligaes -1,4, interrompida
regularmente com ligaes - 1,3. Esta uma hemicelulose que ocorre principalmente
em plantas do grupo da ordem Poales (que inclui Poaceae). Porm, sabe-se que est
presente tambm em lquens (uma associao de fungos e algas) o que indica ser
possvel que os genes necessrios para sintetizar -glucanos esteja presente na maioria
das espcies de plantas superiores (Buckeridge et al. 2004).

Figura 2 - Esquema da parede celular vegetal. A figura mostra a estrutura de uma microfibrila, que
contm 36 molculas de celulose depositadas umas sobre as outras. Uma das molculas de celulose se
apresenta aumentada e prolongada, mostrando as unidades de glucose ligadas entre si por ligaes do tipo
beta-1,4. Uma das molculas de hemicelulose (o glucuronoarabinoxilano) tambm e mostrada em detalhe
na parte de cima da figura.

Figura 3 Estrutura qumica das principais hemiceluloses de parede celular de plantas

Parede celular da cana-de-acar

A cana-de-acar pertence a um grupo de plantas denominadas famlia Poaceae
(gramneas), do qual tambm fazem parte o milho, sorgo, trigo e arroz. Espcies desta
famlia apresentam uma arquitetura da parede tpica que as distingue dos outros grupos
vegetais. A maioria das plantas possui o xiloglucano como principal hemicelulose. J as
gramneas apresentam como principal hemicelulose os glucuronoarabinoxilanos
(GAXs) (Saavedra, Kavacsonyi & Alfoldi, 1988; Souza, 2007), embora tambm possua,
em pequenas propores, xiloglucanos e mananos. Alm do GAXs, os - glucanos so
relativamente abundantes em todos os tecidos de cana (Silva, 2005b).
Quando examinadas ao microscpio de fluorescncia, as paredes celulares de
gramneas apresentam autofluorescncia (Figura 4). Este fenmeno se deve presena
de resduos de cido ferlico esterificados aos resduos de arabinose que formam a
ramificao da cadeia central que, por sua vez, composta por xilanos.

Figura 4 Clulas do parnquima do colmo de cana-de-acar mostrando a autofluorescncia

da parede celular. A seta branca mostra a parede celular.

Resduos de ferulatos esterificados a polmeros vicinais podem sofrer

dimerizao, interligando os polissacardeos entre si. A presena do cido ferlico
confere parede de gramneas, especial resistncia aos raios UV e ao ataque das
enzimas hidrolticas de patgenos (Figura 5).

Figura 5 Glucuronorabinoxilanos interligados por resduos de cido ferlico esterificados a

resduos de arabinose de polissacardeos adjacentes.

Etanol de Primeira Gerao: a fermentao da sacarose

Como citado acima, o processo atual de produo de etanol a partir da cana
realizado pela extrao e fermentao do caldo, que possui aproximadamente 15% de
sacarose e 15% de fibras (Macedo, 2008). Antes do processo de fermentao, que ocorre
por meio de linhagens selecionadas de leveduras Saccharomyces cereviseae, o caldo
esterilizado e purificado. O lcool produzido ento separado da gua por destilao.
Uma parte destes processos impulsionada pela energia obtida com a queima do bagao
da cana que alimenta as caldeiras e gera eletricidade. Mesmo utilizando o bagao para a
gerao de energia, a usina possui um excesso de cerca de 10% da biomassa que pode
ser queimada e vendida na forma de energia eltrica (Macedo e Nogueira, 2005).
Com tcnicas mais eficientes de conservao da energia produzida pela queima
do bagao esse excesso pode chegar a 45%. Alm disso, cerca de 40-50% da palha da
cana que hoje mantida no campo pode ser recuperada e incorporada biomassa
(Macedo e Nogueira, 2005). Esse excesso de biomassa juntamente com os 15% de
fibras poder, no futuro, ser utilizada para produo de etanol celulsico, como
detalhado a seguir.
Etanol de Segunda Gerao: obteno do etanol celulsico por hidrlise cida
No processo de obteno de etanol celulsico, o objetivo desmontar a parede
celular para utilizar os polissacardeos como fonte de acares fermentveis. No
entanto, j foi salientado o quo complexa a estrutura da parede e o quo delicado
deve ser este processo de desmonte para preservar intactos os monossacardeos que
sero usados para fermentao. Atualmente se utiliza um processo denominado hidrlise
cida para desmontar a parede celular. Embora o processo seja funcional, ainda no
eficiente para permitir a produo comercial de etanol.
O processo bsico de hidrlise cida consiste em utilizar um cido forte para
atacar as ligaes glicosdicas entre os monossacardeos de um polissacardeo. A Figura
7 ilustra o processo de forma simples. Os cidos, normalmente utilizados para a
obteno de hidrlise em laboratrio, so cido sulfrico, cido clordrico e o cido
trifluoroactico. H vantagens e desvantagens em relao a cada um. Enquanto os
cidos sulfrico e clordrico discriminam pouco as ligaes glicosdicas de diferentes

tipos, atacando celulose e hemiceluloses de forma similar, o cido trifluoroactico

quebra preferencialmente as ligaes mais fracas, que so as ligaes do tipo alfa ()
presente nas ramificaes das hemiceluloses.

Figura 7 diagrama da hidrlise cida.

No caso da parede celular de cana, os glucuronoarabinoxilanos possuem

ramificaes de cido glucurnico e arabinose cujas ligaes so do tipo , e estas so
as primeiras a serem quebradas. Posteriormente, so quebradas as ligaes (como as
-1,4 dos xilanos). A celulose, por sua vez, a ltima a ser hidrolisada devido sua
forte interao intermolecular, completa ausncia de gua na estrutura da microfibrila
e tambm ao fato das fibrilas estarem cobertas pelas hemiceluloses. O problema em um
processo de hidrlise de polissacardeos contendo ligaes e que como o tempo
necessrio para hidrlise diferente, os monossacarideos liberados antes tendem a
degradar. Este processo chamado de caramelizao (similar formao do caramelo
durante a preparao de uma calda de acar). Se a degradao muito intensa formamse furfurais que so compostos txicos para as leveduras que sero utilizadas na etapa
de fermentao. Assim, ao hidrolisar uma mistura de celulose e hemiceluloses, a
desconexo temporal das quebras das ligaes glicosdicas de cada tipo de
polissacardeo torna-se um entrave para a produo de monossacardeos fermentveis.
Nos processos industriais, a hidrlise cida tem sido realizada com cido
sulfrico (H2SO4). O fato de ainda no haver comercializao de etanol produzido a
partir da hidrlise cida do bagao da cana est relacionado a dificuldades tcnicas e
operacionais que resultam em um custo elevado do produto final (cerca de US$ 0,80
contra US$ 0,35 e US$ 0,27 por kg de etanol obtido a partir do amido e da sacarose,

respectivamente). Parte deste custo se deve ao fato de que para que a hidrlise ocorra de
forma eficiente necessrio aquecer o polissacardeo na soluo cida. A temperatua
ideal para a quebra de hemiceluloses est entre 100 a 120 o C e a concentrao ideal de
cido sulfrico ao redor de 3% (Buckeridge & Dietrich, 1990). No caso especfico da
cana de acar, este custo minimizado devido ao fato de parte do bagao ser queimado
para alimentar as caldeiras e produzir a energia eltrica consumida no processo.
Outra dificuldade advm da necessidade de neutralizao da soluo contendo os
acares para que se possa proceder fermentao. Em geral, para a neutralizao,
utiliza-se hidrxido de clcio (calcrio). No entanto, ao se proceder desse modo, o cido
sulfrico convertido em sulfato de clcio e no pode ser reaproveitado (Ali, Mark &
Daniel, 2006). Esse o principal fator que contribui para o alto custo da tcnica. Para se
obterem nveis aceitveis de comercializao (< US$ 0,36/kg) ser necessria a reduo
dos custos associados principalmente ao consumo e reutilizao do cido e ainda a
melhora na produtividade e eficincia na converso da biomassa (Kaylen et al., 2000;
Goldenberg, 2007).
A fim de melhorar a perspectiva do uso da hidrlise cida em escala comercial, a
empresa brasileira DEDINI Indstria de Base investiu em pesquisas para tornar a o
processo mais rentvel e, atualmente, possui uma usina experimental que tem utilizado
o prprio etanol em mistura com o cido sulfrico como solvente para a lignina. Isso
permite reduzir a utilizao do cido e recuperar o solvente. Outra proposta, feita por
um grupo de cientistas chineses a substituio do processo de neutralizao por um
processo de eletrodilise, que consiste na aplicao de um potencial eltrico entre dois
compartimentos separados por uma membrana semipermevel carregada eletricamente.
Este processo permitiria uma economia de at 55% no consumo do cido sulfrico
(Cheng et al., 2008).
Segundo Rodrigues & Guirardello (2008), os furfurais, que se formam
naturalmente durante a hidrlise cida, poderiam ser aproveitados como matria prima
na produo de solventes e resinas para fabricao de fibra de vidro e outros materiais
plsticos. Sua comercializao pelas usinas poderia se tornar rentvel e contribuir para
reduzir o custo do etanol celulsico.
Outros pesquisadores brasileiros tambm tm se dedicado a buscar solues
compatveis para melhorar o desempenho da hidrlise cida. Em Lorena, Adriane
Milagres estuda mtodos de remoo qumica da lignina para entender seu efetivo
papel na limitao da hidrlise. Em So Carlos, Paulo Seleguin e Glauco Caurin, da

Escola de Engenharia de So Carlos desenvolvem um projeto de pr-processamento por

despressurizao explosiva do bagao da cana. Esta tcnica expe as fibras do bagao,
aumentando a superfcie de contato necessrio para a quebra das microfibrilas. Estes
estudos brasileiros que esto em andamento tm potencial para aumentar tanto a
eficincia da hidrlise cida quanto da hidrlise enzimtica, como veremos a seguir.
Em suma, o processo de hidrlise tem um timo potencial para produzir
acares fermentveis a partir de biomassa vegetal e pode ser adaptado a diferentes
casos. Para a cana, esta tecnologia j est prxima de se tornar comercial e ser um
ponto de extrema importncia estratgica para as prximas geraes de etanol
celulsico. Considerando-se o ponto em que se encontra no momento, pode-se esperar
que a viabilidade comercial seja atingida em 1 a 2 anos. O desenvolvimento de tal
tecnologia de extrema importncia tecnolgica, pois abre o caminho para que se
utilizem enzimas e/ou se modifique a matria prima para obter rendimentos ainda
maiores.
Etanol de Terceira Gerao: complexidade e alternativas para a hidrlise
enzimtica
As maiores expectativas para a viabilizao do etanol celulsico no longo prazo
esto depositadas na possibilidade de utilizarmos a maquinaria bioqumica de
microorganismos (fungos e bactrias) para desmontar a parede celular. O problema
que, assim como os fungos desenvolveram estratgias para invadir a parede celular, as
plantas tambm co-evoluiram para sofisticar seus mecanismos de defesa. Assim, embora
haja fungos capazes de degradar a parede celular vegetal, ela bastante recalcitrante
degradao. Uma das formas que as gramneas desenvolveram para resistir ao ataque
enzimtico parece ser a formao de interligaes de cido ferlico entre suas
hemiceluloses (dos Santos et al. 2008; Figura 5).
Em geral, a lignina, que bastante resistente ao ataque enzimtico, acumula-se
apenas em certos tecidos especializados como fibras e clulas do tecido vascular das
plantas (xilema). Entretanto, nas gramneas, pode-se dizer que as pontes formadas pelo
cido ferlico realizam uma quasi-lignificao em toda a extenso da parede celular,
mesmo em tecidos parenquimticos. Esse processo est relacionado cessao do
crescimento celular e resulta em uma dificuldade adicional para os microorganismos
dispostos a atacar a planta. Por sua vez, certos fungos desenvolveram feruloil-esterases

que so enzimas aptas a separar os resduos fenlicos dos arabinoxilanos, tornado a

parede mais susceptvel s xilanases (enzimas capazes de hidrolisar xilanos).
Para chegar celulose, que o principal composto da parede celular, os fungos
ainda precisam hidrolisar as outras hemiceluloses que recobrem as microfibrilas. Esta
dificuldade semelhante quela dos cidos s diferentes camadas e diferentes ligaes
glicosdicas. Por essa razo, fungos como os dos gneros Trichoderma e Penicillium
produzem verdadeiros arsenais com mais de uma centena de glicosidases e dezenas de
celulases, quitinases, proteases e lipases, entre outras hidrolases. Evidentemente que
para proceder hidrlise enzimtica da parede celular e aproveitar ao mximo a energia
armazenada nestas molculas, pertinente estudarmos esse poderio enzimtico dos
fungos bem como as estruturas finas de enzimas hidrolticas para que possamos utilizlos em nosso favor.
Para desenvolvermos uma tecnologia eficaz para converter a parede em acares
fermentveis e etanol ser estratgico compreender os processos relacionados com o
ataque de cada enzima sobre cada ligao na parede celular.
Atualmente, dispomos de algumas informaes estratgicas que podem nos
ajudar a nortear o caminho do etanol celulsico:
a) conhecemos as ligaes glicosdicas que tm de ser quebradas para liberar
monossacardeos (Silva, 2005b). A partir desses dados podemos iniciar um escrutnio
sistemtico e detalhado de enzimas e mtodos para obter uma completa hidrlise desses
monossacardeos.
b) conhecemos parte da identidade de 469 genes da cana de acar que esto
relacionados ao metabolismo de sntese e degradao da parede celular na cana de
acar (Lima et al., 2001). Entre estes genes esto vrios que so capazes de degradar a
parede celular. Essa informao nos indica que se obtivermos o controle desses genes
poderamos ativ-los no momento desejado.
c) h um grande nmero de estudos com enzimas de microorganismos
mostrando como estas atacam polissacardeos de parede celular. Neste caso, h dois
caminhos que devem ser tomados paralelamente. Um deles a prospeco de espcies
mais eficientes. O outro a transformao gentica de fungos que produzam maior
quantidade de enzima ou ento que expressem genes que codifiquem para enzimas
heterlogas de interesse.

d) Temos algum conhecimento sobre a estrutura de glicosidases de parede

celular que nos possibilitam desenhar estratgias para melhorar o desempenho destas
enzimas ao nosso favor.
Estes quatro conjuntos de informaes so fundamentais para a concepo de
uma estratgia para obtermos um etanol de terceira gerao que inclua o bagao da
cana-de-acar e como uma das matrias primas com eficincia energtica e, sobretudo,
sustentabilidade, tanto em relao aos gases estufa, quanto em relao aos demais
dejetos poluentes.
Outro desafio que se impe obteno do etanol a partir da celulose o da
fermentao de pentoses. As hemiceluloses so ricas em pentoses como xiloses e
arabinoses. O Saccharomyces cereviseae, microorganismo usualmente empregado na
produo de lcool a partir da sacarose, muito pouco eficiente na converso de
pentoses. A presena de pentoses de fato inibe a fermentao das hexoses. Uma
perspectiva a utilizao de outras espcies de fungos, melhor adaptados s pentoses.
Espcies como Pachysolen tannophilus so capazes de utilizar xilose e fermentam
parcialmente outras pentoses depois de consumirem a glicose e a celobiose disponveis
que so seus alimentos preferidos (Hinman et al. 1989).
Para desenvolver as tecnologias do etanol celulsico conveniente cruzar estas
informaes e coordenar esforos com base em prioridades dos estudos. A tecnologia
dever incluir o desenvolvimento de maquinrio e processos para produo de enzimas
em escala industrial, bem como dos processos de degradao da parede em si, mas
tambm as tecnologias voltadas ao desenvolvimento das variedades de cana apropriadas
e as tecnologias para preparar o bagao para incubao.
Prospeco, seleo e engenharia de fungos
A prospeco e a seleo de fungos uma das estratgias para obter melhores
enzimas para hidrolizar o material lignocelulsico. Em um pas como o Brasil, que tem
alto nvel de biodiversidade, existe maior probabilidade de encontrar microorganismos
que apresentem novidades nesse aspecto.
Estudos feitos na ndia com palhada de cana, indicam que os fungos Aspergillus
terreus, Cellulomonas uda, Trichoderma reesei e Zymomonas mobilis podem ser
chaves na degradao do material lignocelulsico (Singh et al., 2008). No Brasil, o
grupo de pesquisa liderado por Maria de Lourdes Polizeli da USP Ribeiro Preto est
empenhado na prospeco de fungos e na caracterizao, imunolocalizao e

purificao de enzimas fngicas. Um dos estudos mostra a caracterizao de uma

xilanase de Aspergillus (Rizzati et al., 2008). Nosso grupo, no Departamento de
Botnica - IB/USP prospectou a atividade celuloltica de mais de 50 espcies de fungos
do solo do cerrado e trabalha na viabilizao do Penicillium steckii para uso industrial
(no publicado). Nosso grupo tambm estudou a ao da celulase sobre xiloglucanos
polmero tambm presente no colmo da cana. Descobrimos, por exemplo, que celulases
de Trichoderma podem funcionar como um sistema de restrio anlogo s enzimas de
restrio usadas sobre o DNA (Tin et al., 2003) agindo sobre a estrutura qumica fina
dos polissacardeos hemicelulsicos (ver tambm Tin et al., 2006). Informaes
detalhadas sobre o mecanismo da ao enzimtica sobre polisacardeos so valiosas se
desejamos induzir um aumento na eficincia dessas hidrolases.
Outro grupo de pesquisa brasileiro que tem trabalhado com hidrolases fngicas e
sua ao sobre polissacardeos de parede celular o de Edivaldo Ximenes Ferreira
Filho, da Universidade de Braslia. Seus estudos esto focados na deteco e
caracterizao das enzimas, assim como nos genes que as codificam (ver Iembo et al.
2006 e Salles et al., 2007 como exemplos).
Na USP Zona Leste, Felipe Chambergo, estuda a utilizao da potente
maquinaria de expresso gnica de celulases de Trichoderma reesei a fim de sintetizar
celulases de interesse para a indstria. Nesse mbito (engenharia gentica de fungos), j
existem resultados bastante interessantes sobre a regulao e sinalizao da expresso
gnica obtidos pela equipe de Gustavo Goldman da USP Ribeiro Preto. Este grupo
verificou que a espcie Aspergillus niger, por exemplo, tem um nico fator de
transcrio (XLnR) que

regula a expresso de todos os genes relacionados

degradao de polissacardeos, enquanto que em Trichoderma, ocorre mais de um fator

de transcrio para estes mesmos genes (Gustavo Goldman, comunicao pessoal).
Goldman pretende manipular os mecanismos de regulao da expresso gnica, a fim de
obter mutantes capazes de produzir continuamente enzimas celulolticas na presena de
substratos, sem que o sistema de expresso gnica sofra retro-inibio pelos produtos da
ao enzimtica, como ocorre naturalmente.
Caracterizao e engenharia de enzimas
Outro tipo de retro-inibio ou inibio pelo produto ocorre no nvel da catlise.
Quando a concentrao de produtos se torna alta no meio, as enzimas no conseguem se
desligar do produto formado e, ento, a atividade enzimtica comea a cair. A atividade

pode no s parar completamente, como pode at mesmo se inverter. No Instituto de

Qumica da USP, Sandro Marana est propondo a unio de um domnio de ligao
celulose (CBD cellular binding domain) a -glicosidases a fim de promover a reduo
da concentrao local dos produtos da atividade da enzima. O CBD uma seqncia
protica encontrada em algumas celulases que adere microfibrila provocando uma
desorganizao local na estrutura cristalina da fibra que facilita a catlise. Um brao
protico posiciona o stio cataltico no local exato onde a desordenao promovida pelo
CBD expe as molculas de celulose ao ataque enzimtico. Um recurso importante na
pesquisa interessada na compreenso e engenharia de enzimas o do desvendamento da
estrutura terciria de protenas. O grupo de Marana acredita que a razo
produto/substrato menor nas proximidades do polissacardeo. Com foco na estrutura
das enzimas, o grupo de Marana estuda -glicosidases ativas sobre celobiose (um
dmero de glicose produzido pela hidrlise da celulose) e sobre celodextrinas
(oligossacardeos beta-1,4 ligados derivados da celulose). Eles esto interessados nos
aminocidos localizados fora do stio ativo da enzima e que esto associados
especificidade da ao enzimtica. O grupo trabalha com uma metodologia denominada
evoluo dirigida em que so produzidas pequenas variaes na seqncia de
aminocidos das enzimas e a seguir so realizados ensaios a fim de selecionar variantes
cuja eficincia cataltica de interesse aumentou e ento so estudadas quais as variaes
estruturais responsveis pelo aumento na atividade/especificidade.
As diferentes glicosidases so agrupadas em famlias. Entretanto, a grande
maioria das delas ainda no tem sua estrutura terciria desvendada ou tem apenas uns
poucos representantes cuja estrutura estrica foi elucidada. O grupo de Igor Polikarpov
da USP de So Carlos estuda a estrutura terciria de enzimas por cristalografia de raios
X e entre elas glicosidases. Eles j conseguiram cristalizar e resolver a estrutura de
xilanases de Trichoderma reesei (Galubev et al. 2000, Rojas et al. 2005). Polikarpov e
seus colaboradores so responsveis por tcnicas que tm levado ao aperfeioamento da
cristalografia que tornou a metodologia muito mais eficiente. Eles esto empenhados na
criao/aperfeioamento de modelos de enovelamento protico que possam ser usados
para prever a estrutura terciria com base na seqncia de aminocidos e que podem ser
utilizados na engenharia de catalisadores enzimticos.
Usando conhecimentos sobre os mecanismos fisiolgicos, bioqumicos e moleculares
para aprimorar o acesso celulose

Ainda que a estrutura bsica das hemiceluloses j seja conhecida (tipos e

propores entre as ligaes glicosdicas), necessrio estudarmos sua estrutura fina.
Para tanto necessrio utilizar enzimas especficas que revelem os padres de
ramificao e/ou das repeties das ligaes glicosdidas na cadeia principal
(propores entre ligaes beta-1,3 e beta-1,4 nos beta-glucanos e entre as manoses e
glicoses nos mananos, etc). Tais informaes so relevantes, pois temos verificado que a
ao das hemicelulases depende fortemente da estrutura fina (Tin et al. 2003). Alm
das estruturas baseadas nos acares, outro aspecto ainda relativamente pouco estudado
em relao s hemiceluloses so as ramificaes com radicais acetila e tambm com
compostos fenlicos (dos Santos et al. 2008b). Para que possamos aprofundar nosso
conhecimento a esse respeito precisamos utilizar estudos com base em enzimas
especficas puras e espectrometria de massas (e.g. MS-MS).
Para que possamos manipular as enzimas corretas para desmontar a parede e
obter acesso celulose precisamos tambm aprofundar nosso conhecimento sobre os
mecanismos de sinalizao e expresso dos genes relacionados parede celular.
Atualmente, nosso grupo est estudando a composio e estrutura fina da parede
celular em diversos rgos da cana de acar e as variaes nessa composio durante o
desenvolvimento. Investigamos a importncia dos compostos fenlicos na recalcitrncia
da parede celular ao ataque de hidrolases (dos Santos et al. 2008c) e o controle
hormonal sobre o crescimento, o desenvolvimento e a composio da parede celular.
Estamos estudando ainda os mecanismos de autodigesto da parede que ocorrem
naturalmente (como em frutos e sementes) e que podem auxiliar na compreenso do
processo de sntese e, sobretudo, de degradao da parede. Estamos tambm
empenhados em estudar as enzimas e a composio da parede celular de sementes
visando produo de lcool atravs do uso sustentvel de sementes nativas. Sementes
de espcies nativas de vrios biomas brasileiros, entre eles a Mata Atlntica e do
Cerrado, acumulam grandes quantidades de polissacardeos de parede celular
(Buckeridge & Dietrich, 1990, Buckeridge et al. 1995, Mayworm et al. 2000). Em
algumas destas o acmulo de tal ordem que possvel extrair carboidratos em larga
escala para uso industrial. J desenvolvemos, por exemplo, um processo para obter
galactomanano a partir de sementes de faveiro (Dimorphandra mollis; Panegassi et al.
2000). Durante os ltimos 15 anos temos desvendado os mecanismos bioqumicos e
fisiolgicos envolvidos nos processos de degradao desses polmeros. Purificamos
diversas enzimas (Buckeridge et al. 2000) e clonamos genes relacionados (ver Alcntara

et al. 1999, 2006, Lisboa et al. 2006 e Brando 2008), bem como investigamos os
mecanismos de controle hormonal da degradao da parede celular nesses modelos de
estudo (Santos et al. 2004, Tonini et al. 2006).
A idia introduzir em leveduras os genes que codificam para as enzimas de
hidrlise de galactomananos e xiloglucanos de sementes de Leguminosae. Ento,
poderamos usar as leveduras para degradar o polissacardeo das sementes para produzir
monossacardeos e, a seguir, promover a fermentao alcolica. Alm do faveiro
(Dimorphandra mollisii) o feijo-do-mato (Sesbania virgata) e o jatob (Hymenaea
courbaril) produzem grandes quantidades (acima de 40% do peso seco) de
polissacardeos nas sementes (Buckeridge et al. 2000). Nos casos citados, as espcies
so de larga ocorrncia em vrios biomas sul-americanos e possvel a explorao
sustentada atravs de contatos com cooperativas que j utilizam outras partes de forma
sustentvel.
Em termos de escala de produo, a quantidade de etanol passvel de ser
produzida relativamente pequena em relao ao que a cana-de-acar pode produzir.
No entanto, as vantagens ambientais suplantam muito s econmicas no caso de se
formar sistemas agro-florestais em que florestas sejam regeneradas (ou mantidas) em
meio ao canavial. Esta estratgia, que denominamos caminho do meio (Buckeridge,
2007), tem o potencial de produzir um etanol que poderia ser certificado como
ambientalmente correto e poderia assegurar fatias de mercado (por exemplo, na Europa
e Japo) de combustvel que tenha padro de produo com baixo impacto ambiental.
No caso da cana-de-acar, uma possibilidade fazer um screening das
paredes celulares das diversas variedades buscando diferenas de composio que
possam nos auxiliar a compreender as variaes estruturais e produzir mutantes que
permitam maior acesso celulose.
Como o grande propulsor da busca por novas tecnologias para obteno de
etanol a mudana climtica global, nosso grupo tambm estuda os efeitos das
mudanas climticas sobre a cana-de-acar e outras espcies de interesse para a
obteno de energia renovvel em regies amaznicas, como a Senna reticulata (matapasto) e Euterpe oleracea (aa). Um dos objetivos entender os mecanismos de
acmulo de biomassa e avaliar outros aspectos bioqumicos e ecofisiolgicos afetados
por mudanas climticas.
Plantas de cana-de-acar incubadas em atmosfera de gs carbnico de 720 ppm
(concentrao esperada para 2050, caso as emisses de combustveis fosseis continuem

na mesma taxa), apresentaram um aumento na taxa fotossinttica e um grande aumento

em biomassa. Na cana, o aumento pode chegar a 60% apenas na biomassa do colmo
(Souza et al. 2008). Nestas plantas, observamos a superexpresso dos genes
relacionados com expanso celular como a xiloglucano endo-transglicosilase (XTH),
com a fotossntese e tambm com a inibio da expresso de genes relacionados
sntese de fenilpropanides (intermedirios na sntese da lignina). Paralelamente, o
grupo de Glucia Souza do IQ USP, com o qual colaboramos, observou que plantas com
alta produtividade de acares expressam a XTH com maior intensidade e tambm tm
inibida expresso da cinamil orto-metiltransferase (COMT), relacionada sntese de
fenilpropanides.
Neste momento estamos aprofundando os estudos sobre o papel da enzima XTH
no metabolismo de parede celular de cana e o processo fotossinttico em cana-deacar. Nossa expectativa a de poder aumentar a produtividade da cana aumentando a
expresso dos genes de fotossntese que respondem ao CO 2 elevado. Com isto, a planta
no s produz mais sacarose, mas tambm mais fibra, que servir como substrato para a
produo do etanol celulsico.
Etanol de Quarta Gerao: a planta ajudando na produo de etanol
O que chamamos de etanol de quarta gerao ir integrar os processos de
produo das demais geraes (Figura 1). Consistir em um conjunto de alteraes na
prpria planta de cana-de-acar (adaptvel tambm a outras espcies) que devero
aumentar a eficincia dos processos de produo de etanol de segunda e terceira
geraes.
Alm de otimizar a produo do etanol atravs de modificaes na planta e
microorganismos utilizados na degradao da celulose, uma alternativa que poder
reduzir o custo da produo de enzimas a modificao da cana para expressar enzimas
capazes de promover a digesto da parede celular. Nosso grupo se dedica a entender
tanto a relao entre a expresso dos genes relacionados biossntese e degradao da
parede celular quanto queles relacionados com o metabolismo de carboidratos em
geral. Em 2001, nosso grupo participou do projeto SUCEST da cana e encontrou 459
genes relacionados ao metabolismo de parede celular (Lima et al. 2001). Neste trabalho
foi demonstrado que grande parte dos genes da via de biossntese est ativada, enquanto
os genes da via de degradao em geral no so expressos durante o desenvolvimento.

Isso indica que deve haver um baixo turnover de polissacardeos da parede. No entanto,
os genes existem e devem ser expressos em condies especficas como durante a
senescncia foliar. Se obtivssemos controle sobre estes genes poderamos induzir a
planta a expressar estas enzimas na poca da colheita, reduzindo a necessidade de se
introduzir enzimas fngicas para desmontar a parede.
Outra idia a de introduzir na cana genes heterlogos que sejam ativos apenas
em condies especficas, durante o processamento da biomassa. J foram produzidas
plantas transgnicas, nas quais foi inserido o gene da -amilase que converte o amido
em glicose e uma celulase para a degradao da celulose. Num outro estudo, uma
endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus que funciona otimamente a 81o C e
pH 5 foi expressa no apoplasto de vrias plantas incluindo Arabidopsis e arroz. A
enzima mostrou-se ativada em extratos brutos e quando adicionada aos colmos de arroz
aps a colheita e aps um pr-tratamento cido, mas no causou degradao da celulose
in planta (Dai et al, 2000). Estudos em andamento em nosso laboratrio indicam que a
presena de hemicelulose e lignina previnem o acesso da E1 celulose (dos Santos et al.
2008c). Sendo assim, torna-se necessrio estudar in vitro a ao de enzimas que
degradam lignina como lacases e peroxidases, bem como enzimas ativas sobre
hemiceluloses (feuloil-esterases, xilanases, liquenases, etc). Posteriormente, a expresso
dessas enzimas pode ser estudada em Arabidopsis e cana, direcionando-as para
compartimentos celulares que permitam que sua ao seja disparada apenas no
momento desejado. Para tanto, precisamos prospectar as enzimas produzidas pela
plantas de interesse e/ou relacionadas, assim como os mecanismos de sinalizao
envolvidos na regulao da expresso desses genes. Dessa forma estaramos aptos a
tentar controlar esses mecanismos de sinalizao em nosso favor. J prevendo esta
possibilidade, nosso grupo, em colaborao com outros, est realizando experimentos
para verificar quais enzimas, em quanto tempo, e em qual ordem e propores, devem
ser utilizadas a fim de degradar a parede da cana-de-acar com a maior eficincia
possvel.
Uma outra possibilidade modificar o tipo de hemicelulose presente na parede e
ativar a sntese dos polissacardeos reduzindo a quantidade de lignina a fim de produzir
a cana-energia que, como conseqncia da maior quantidade de polissacardeos,
possuir mais energia conversvel em etanol. Essa planta poder ser usada para hidrlise
com coquetis enzimticos de alta eficincia ou mesmo por fungos geneticamente
modificados ou ainda por enzimas expressas pela prpria planta.

Apesar do alto grau de conhecimento que necessitamos ter para que se torne
possvel tal situao, a manipulao e/ou introduo de genes para a degradao da
parede in vivo possvel. Acreditamos que o etanol de quarta gerao se tornar vivel
em cerca de 10 anos, pela utilizao de modificaes genticas que alterem a parede
celular e fisiologia da planta de forma a prepar-la para melhor adaptao a diferentes
condies com aquelas advindas das mudanas climticas globais.
Para que esta quarta gerao de etanol seja realizada, metas como o
seqenciamento completo do genoma da cana e alguns fungos-chave, o mapeamento
dos genes de parede, a compreenso dos mecanismos de controle fisiolgico
(hormnios, fatores de transcrio), bem como na compreenso da relao entre
estrutura e eficincia de enzimas e substratos, devem se tornar linhas de pesquisa
prioritrias, hoje.
A Figura 7 resume as rotas do etanol celulsico integradas entre si, considerando
a possibilidade de se alterar, com tecnologias de quarta gerao, o balano entre
biossntese e degradao e produzir plantas que tenham mais celulose e, portanto, um
maior nvel de empacotamento de energia nas ligaes glicosdicas (veja Buckeridge
2007 para maiores detalhes).

Figura 7 Rotas possveis para o etanol de quarta gerao.

Abordagens paralelas cana-de-acar para o avano tecnolgico do etanol

celulsico
O eucalipto atualmente a maior fonte de celulose disponvel comercialmente,
embora sua produo esteja voltada para a fabricao de papel. Entretanto, a casca do
eucalipto, atualmente desperdiada, uma grande fonte de carboidratos que podem vir a
ser matria-prima para produo de etanol celulsico. H alguns anos, nosso grupo
realizou um levantamento sobre a composio da parede celular do eucalipto em um
projeto financiado pela Suzano Papel e Celulose e, atualmente, o grupo liderado por
Carlos Labate da ESALQ/USP vem realizando um estudo sobre produtividade e
composio dos carboidratos da casca de diferentes variedades de eucalipto. Algumas
tm a casca especialmente rica em hexoses chegando a apresentar at 5% de sacarose
em sua composio. Labate tambm est interessado em estudar celulases com
especificidade por essas matrias-primas, como as encontradas no trato digestivo de
cupins e outros insetos especializados em madeiras. Alm do conhecimento sobre a
composio da parede de eucalipto, a polpa tambm j foi estudada com relao ao
ataque de enzimas fngicas (Medeiros et al., 2002).
Outro resduo que pode ser obtido em grandes quantidades o ingo
(pendculo do cacho) de banana com composio similar da cana (resultados no
publicados) que podem ser digeridos por enzimas de fungos (Medeiros et al. 2000).
Outro resduo promissor a borra de caf, que rica em manano e celulose (no
publicado) que poderia ser digerida por uma mistura de mananases (Lisboa et al., 2006)
e celulases. H vrias outras possibilidades, mas estes processos podem ser vistos como
exemplos que poderiam complementar a produo de etanol celulsico com base no
bagao da cana.
Mesmo com o foco no etanol de alta tecnologia, importante no perdermos a
necessria ateno sobre a fisiologia das plantas de interesse para produo de etanol.
Precisamos investir em plantas mais produtivas e precoces a fim de reduzir a
necessidade de expanso das reas de plantio. Do mesmo modo, importante obtermos
variedades mais resistentes seca, alagamento, frio e patgenos para fazer frente as
modificaes climticas em curso, bem como para atender demanda por variedades
aptas ao cultivo em regies distintas das tradicionais.
Concluses

O etanol celulsico, ao lado do biodiesel, uma promissora fonte de

combustvel sustentvel e eficiente capaz de atender demanda universal por
combustveis lquidos, tanto para propelir veculos quanto para alimentar as iminentes
clulas de combustvel. Diversos mtodos para obteno de etanol esto em
experimentao e imprescindvel que o Brasil mantenha sua liderana natural neste
campo para que o valor tecnolgico agregado dos biocombustveis possa ser revertido
em nosso favor enquanto o produto avana para se tornar uma comdite. Neste
caminho, a cana de acar desponta com larga vantagem como a planta sobre a qual
devemos depositar nossos maiores esforos a curto prazo. Entretanto, no podemos
perder de vista outras fontes de lignocelulose como o eucalipto e outras plantas tais
como o sorgo sacarino e as sementes de espcies nativas. Tambm devemos manter a
ateno sobre tecnologias voltadas hidrlise, mas sem perder de vista a necessidade
avanar na produtividade das plantas que serviro como matria-prima a este processo.
Alm disso, independentemente do foco em combustveis de segunda, terceira e
quarta geraes importante que conheamos profundamente a fisiologia das plantas de
interesse para produo de etanol. Assim, poderemos produzir variedades mais
resistentes seca, alagamento, frio e patgenos, bem como plantas mais produtivas e
precoces frente a modificaes no ambiente de plantio devido possibilidade de
expanso de reas e s mudanas climticas em curso no planeta.
A produo de bioenergia uma medida de extrema importncia para
enfrentarmos os srios desafios ambientais relacionados com os efeitos das mudanas
climticas globais. Ainda que a bioenergia no seja a nica soluo para este problema,
ela certamente contribuir para mitigar as emisses de combustveis fsseis.
Outro desafio igualmente importante a preservao da biodiversidade. O
aumento de produtividade esperado nos prximos 10 a 15 anos, deve ser usado para
diminuir a necessidade de expanso da rea plantada para produzir combustvel. Ao
mesmo tempo, deve ser incentivada a recuperao de florestas que, se possvel, podem
ocupar espao em meio aos canaviais, recuperar as matas ciliares e trazer de volta parte
da biodiversidade.
A produo de etanol celulsico com alta eficincia e sustentabilidade no ser
tarefa de poucos, mas resultar da integrao entre diversos grupos de pesquisa
especializados em diferentes reas da fisiologia, ecologia, bioqumica, gentica,
enzimologia, fsica e engenharia, entre outras. O Brasil est diante de mudana no modo

de produo rara ou talvez indita na histria. Podemos desenvolver uma tecnologia de

alto valor agregado e ao mesmo tempo us-la tambm para recuperar a biodiversidade,
integrando sustentabilidade e desenvolvimento tecnolgico. Talvez no seja exagero
dizer que Brasil tem a chance de liderar uma transio entre o velho Homo sapiens
pujante e poluidor para um novo e equilibrado Homo ambientalis.

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