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1. CARBOHIDRATOS
Los carbohidratos son el tipo de compuesto biolgico ms abundante puesto que forman
parte de la materia viva en cantidad muy superior a protenas, lpidos o cidos nucleicos. Las
formas de carbohidratos ms abundantes en la Naturaleza son los polisacridos,
macromolculas constituidas por la polimerizacin de unidades moleculares de azcares
sencillos o monosacridos. El principal monosacrido es la glucosa, cuya polimerizacin da lugar
a dos grandes grupos de polisacridos de gran importancia para la vida: la celulosa y el almidn.
Ambos compuestos estn constituidos fundamentalmente por cadenas lineales de molculas de
glucosa, unidas por enlaces glicosdicos que enlazan el carbono 1 de un residuo de glucosa con
el carbono 4 del siguiente residuo. La orientacin espacial de este enlace, a su vez determinada
por la configuracin ( o ) del tomo de carbono anomrico situado en la posicin 1 de la
molcula de glucosa, prefigura las propiedades estructurales y la funcin biolgica del
polisacrido resultante. La unin de dos molculas de glucosa por un enlace 14 da lugar al
disacrido maltosa, mientras que si el enlace es 14 el disacrido resultante es celobiosa
(Figura 1).
La polimerizacin de sucesivas molculas de glucosa mediante uno u otro tipo de enlace
da lugar al almidn y a la celulosa, respectivamente. Estos dos polisacridos tienen funciones
distintas. El almidn es una molcula de reserva energtica, utilizada como materia prima para la
obtencin de energa por muchos seres vivos. La celulosa es el principal componente de la
pared celular vegetal y contribuye de manera determinante a la consistencia y resistencia
estructural de las plantas. Aparte de celulosa y almidn, existen otros importantes polisacridos
como el xilano, el manano y la quitina, constituidos por la polimerizacin de monosacridos
diferentes a la glucosa como son la xilosa, la manosa y la acetilglucosamina. El xilano es, junto a
la celulosa, un importante material estructural de las plantas. El manano es un constituyente de
la pared celular de hongos. La quitina forma parte de la pared celular de hongos y del
exoesqueleto de los artrpodos.
La mayora de los azcares sencillos (monosacridos, disacridos, etc.) no existen como
tales en la Naturaleza en cantidad apreciable, sino que se encuentran formando parte de
polisacridos. No obstante, hay algunos relativamente abundantes y muy importantes por su
relacin con la nutricin humana y animal. Es el caso de la glucosa, que es el azcar de la uva,
cuya fermentacin da lugar al vino; la lactosa o azcar de la leche y la sacarosa, azcar comn o
de mesa.
Con frecuencia, los azcares se presentan unidos mediante enlaces glicosdicos a
compuestos qumicos de diferente naturaleza. Es frecuente su unin a grupos que contienen
nitrgeno, fsforo o azufre. Por ejemplo, la acetilglucosamina, cuya polimerizacin da lugar a la
quitina, contiene nitrgeno. Otro ejemplo de gran significacin es la unin de ribosa y
desoxiribosa al cido fosfrico y a una base nitrogenada, para constituir los nucletidos y los
cidos nucleicos. Tambin es frecuente que los carbohidratos se presenten en forma conjugada,
unidos a protenas o a lpidos.
2. CARBOHIDRASAS: CLASIFICACIN
Las carbohidrasas constituyen un grupo muy amplio y variado de enzimas cuya
caracterstica comn es la capacidad de hidrolizar el enlace glicosdico que forma el eslabn de
enlace de los azcares. Con mayor propiedad bioqumica se denominan glicosil hidrolasas. Al
igual que el resto de enzimas, las glicosil hidrolasas se clasifican siguiendo las recomendaciones
originalmente establecidas por el Nomenclature Comittee (NC) de la International Union of
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Biochemistry (IUB), posteriormente adoptada por otras organizaciones bioqumicas
internacionales, como la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) y la
International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Esta clasificacin establece
un Catlogo de Enzimas (Enzyme Catalog, abreviado EC) que asigna a cada enzima un cdigo
numrico basado en el tipo de reaccin catalizada y en la especificidad de substrato. Las glicosil
hidrolasas son definidas como (EC 3.2.1.x), donde los tres primeros dgitos indican la propiedad
de hidrolizar el enlace O-glicosdico, y el cuarto (x) indica el tipo de substrato. Aunque esta
clasificacin es de gran utilidad, no aporta informacin sobre aspectos muy importantes de las
enzimas como son su estructura molecular y sus relaciones filogenticas. Para suplir estas
limitaciones, Henrissat y colaboradores han establecido una clasificacin de las glicosil
hidrolasas complementaria a la anterior, basada en la similitud de sus secuencias de
aminocidos. Esta clasificacin, que en su primera edicin (15) distingua 35 familias, ha ido
amplindose en el transcurso de los aos, a medida que aparecen publicados datos de
secuencia de nuevas enzimas (8), y en la actualidad cuenta con cerca de 100 familias. Una
versin actualizada est disponible en Internet, en la direccin (http://afmb.cnrsmrs.fr/CAZY/index.html). La metodologa utilizada para la clasificacin parte de la elaboracin de
una matriz de datos con la secuencia primaria de todas las glicosil hidrolasas de secuencia
conocida, obtenida de la base de datos SWISSPROT (http://www.expasy.org/sprot/). El conjunto
de secuencias es analizado con una serie de programas informticos para establecer su
homologa y relacin filogentica. El resultado ofrece informacin muy valiosa. Adems de hacer
evidente las relaciones de parentesco, permite obtener modelos de la estructura tridimensional
de las enzimas, mediante tcnicas de modelado comparativo con protenas homlogas de
estructura resuelta, ya que la similitud de secuencia entre protenas (estructura primaria) implica
un parecido an ms notable en su estructura tridimensional (estructura terciaria; (7)). Algunas
familias cuentan con gran nmero de enzimas, implicadas en procesos biolgicos muy diversos y
presentes en todo tipo de organismos vivos, mientras que otras familias estn constituidas por
enzimas que podran considerarse peculiaridades evolutivas, responsables de funciones muy
particulares, o presentes solamente en un reducido nmero de organismos. Una caracterstica
fcilmente apreciable es que la clasificacin presenta cierto sesgo cronolgico, manifestado
porque las familias con un nmero de orden ms bajo corresponden, en trminos generales, a
tipos enzimticos ms ubicuos y significativos que ya aparecan incluidos en la clasificacin
inicial de 35 familias, realizada en 1991. A medida que se han ido caracterizando nuevos tipos de
enzimas, se ha puesto de manifiesto la existencia de nuevas familias, hasta las ms de 90
descritas hasta ahora, muchas de las cuales corresponden a enzimas menos abundantes en la
naturaleza, o poco significativas y pobremente caracterizadas.
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Un segundo grupo de familias relacionadas por su funcin son aquellas que incluyen
enzimas involucradas en la digestin de la celulosa. En este grupo estn, entre otras, las familias
5-12. Algunas de estas familias, como la 5 y la 10, incluyen enzimas presentes en bacterias,
hongos y plantas. Otras, la 6, 11 y 12, estn representadas en bacterias y hongos. En los casos
de las familias 7 y 8, todas las enzimas caracterizadas pertenecen a hongos o a bacterias,
respectivamente. No todas las enzimas incluidas en este grupo de familias son celulasas; hay
muchas enzimas con otro tipo de actividad. Por ejemplo, hay xilanasas clasificadas en las
familias 5, 8, 10 ,11 y 12. El hecho de que enzimas pertenecientes a una misma familia,
homlogas en secuencia y por tanto con estructura tridimensional parecida, sean activas frente a
substratos distintos, como son la celulosa y el xilano, se explica por la relacin estructural
existente entre estos dos polisacridos. Si bien la unidad monomrica es distinta en uno y otro
caso: una hexosa, la glucosa, en la celulosa y una pentosa, la xilosa, en el xilano, los sucesivos
enlaces -glicosdicos que constituyen ambos polisacridos se estructuran espacialmente de
forma similar.
Un tercer grupo significativo de familias son las que agrupan enzimas relacionadas con
la hidrlisis del almidn. La mayora de las amilasas estn clasificadas en las familias 13, 14 y
15. Cada una de estas familias incluye de forma preferente cada uno de los tres principales tipos
de actividad amilasa: -amilasa, -amilasa y glucoamilasa, respectivamente. Los enzimas de la
familia 13 estn representados en todo tipo de organismos vivos. La presencia de enzimas de la
familia 14 se limita a bacterias y plantas, y las de la familia 15 a bacterias y hongos.
Una peculiaridad interesante de la clasificacin por homologa de secuencia es la
existencia de cuatro familias distintas, las designadas 22-25, que incluyen enzimas con actividad
lisozima. Esta enzima es un importante agente antibacteriano que acta hidrolizando el enlace glicosdico existente entre unidades consecutivas de N-acetilglucosamina y cido Nacetilmurmico en el entramado glicoproteico que forma la pared celular de muchas bacterias. La
familia 22 incluye enzimas muy extendidas en el Reino Animal. Las otras tres enzimas incluyen
distintas formas de lisozima bacteriana. Entre las enzimas de la familia 24 existen un conjunto de
ellas codificadas por genes incorporados en genomas de virus bacterifagos.
Respecto a la hidrlisis de otros polisacridos relevantes, las quitinasas aparecen
clasificadas en las familias 18 y 19. La familia 18 incluye enzimas presentes en organismos de
todo tipo, mientras que la familia 19 incluye predominantemente quitinasas de plantas,
relacionadas con el mecanismo de defensa frente a la infeccin por hongos. La mayor parte de
las mananasas aparecen en la familia 26, si bien hay enzimas con esta actividad en las familias
5 y 44.
3. MECANISMOS DE HIDRLISIS DEL ENLACE GLICOSDICO
La hidrlisis del enlace glicosdico catalizada por las distintas variedades de glicosil
hidrolasas est mediada por la accin de dos residuos catalticos presentes en el centro activo,
uno de los cuales acta como donador de protones y el otro como nuclefilo o base. En la mayor
parte de los casos son dos residuos carboxlicos. El enlace glicosdico puede hidrolizarse de dos
formas distintas, atendiendo a cual sea la configuracincin del carbono anomrico resultante de
la hidrlisis. Una primera posibilidad es que la configuracin anomrica cambie. A la reaccin
hidroltica que se desarrolla de esta forma se la designa como mecanismo de inversin (Figura
2A). La posibilidad alternativa es que la configuracin anomrica se mantenga. Es lo que se
denomina mecanismo de retencin (Figura 2B). En las glicosidasas que operan mediante
inversin, la distancia de separacin de los dos carboxilos catalticos es de aproximadamente 10
, mientras que en las enzimas que retienen la configuracin del enlace, la separacin es
alrededor de 5 . El mecanismo de inversin tiene lugar en una sola etapa, mediante un proceso
cataltico cido-base. Uno de los dos residuos catalticos opera como base, facilitando el ataque
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enzimas estn situados en las cadenas cuatro y siete, de las ocho que constituyen el barril
(/)8 que caracteriza su estructura. Por este motivo, al clan GH-A tambin se le denomina clan
4/7. La Figura 4 muestra la estructura terciaria de una enzima representativa del clan GH-A, la
-glucosidasa A de P. polymyxa, perteneciente a la familia 1. Puede observarse la caracterstica
configuracin en barril (/)8. Otros clanes caracterizados por la presencia de este mismo motivo
son los GH-D (familias 27 y 36), GH-H (familias 13, 70 y 77) y GH-K (familias 18 y 20).
Figura 4. Estructura de la
unidad monomrica de la glucosidasa
A
de
P.
polymyxa (cdigo PDB:
1BGA). En rojo se muestran
las -hlices, en amarillo las
cadenas y en gris la zona
sin estructura secundaria
definida (27).
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El motivo 6-fold -propeller caracteriza al clan GH-E (familias 33, 34 y 83). La actividad
enzimtica caracterstica de estas tres familias es sialidasa o neuraminidasa. Esta actividad
desempea un importante papel en la hidrlisis de glicoprotenas. La Figura 7 representa la
estructura de la neuraminidasa de Salmonella typhimurium, perteneciente a la familia 33.
El motivo 5-fold -propeller caracteriza a los clanes clanes GH-F (familias 43 y 62) y
GH-J (familias 32 y 68). La actividad ms caracterstica de las enzimas del clan GH-F es
arabinofuranosidasa y la del clan GH-J es invertasa. La Figura 8 muestra la estructura de la
invertasa de la bacteria Thermotoga martima, perteneciente a la familia 32.
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la biologa molecular durante los ltimos 25 aos ha aportado una pltora de procedimientos
experimentales y computacionales que permiten analizar y manipular el material gentico. Esto
hace tcnicamente posible, al menos en teora, reescribir el texto de una secuencia gnica para
modificar a voluntad las propiedades de la protena codificada. La principal limitacin para
conseguir este objetivo es que la relacin entre estructura y funcin de las protenas es de una
gran complejidad, y en la mayor parte de los casos es imposible saber a priori que alteracin
estructural sera necesaria realizar para conseguir determinado cambio de funcin. En trminos
operativos, podemos definir la ingeniera de protenas como la modificacin estructural realizada
mediante la manipulacin del gen codificante, por la cual se consigue un cambio funcional
determinado. La mxima expresin de la ingeniera de protenas es el diseo de protenas, que
consiste en la definicin y creacin de novo de una secuencia proteica cuya estructura la haga
apta para desempear determinada funcin. La ingeniera de protenas opera de forma iterativa,
siguiendo un proceso cclico que alterna etapas en las que se planean y ejecutan los cambios a
realizar con otras en las que se evala el resultado de los mismos. A este proceso se le ha
denominado ciclo de diseo (Figura 9)
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utilizando tcnicas de modelado comparativo, que deducen la estructura terciaria de una protena
mediante comparacin con otras protenas de secuencia homloga y estructura conocida.
Existen en Internet diversos servidores informticos que proporcionan modelos estructurales de
protenas a partir de su secuencia. Un recurso especialmente recomendable es SWISS-MODEL
(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html). La estrecha vinculacin existente entre
la estructura de una protena y su funcin hace insoslayable el disponer de una slida
informacin estructural para acometer con cierta garanta de xito cualquier planteamiento de
ingeniera de protenas.
7. MODIFICACIN DE LAS PROPIEDADES DE CARBOHIDRASAS MEDIANTE INGENIERA
DE PROTENAS
Como cualquier otro tipo de molcula proteica, las carbohidrasas son susceptibles de ser
modificadas mediante las tcnicas de ingeniera de protenas. La ingeniera de carbohidrasas
tiene dos vertientes bien definidas. Una determinada por la investigacin bsica, debido al hecho
de que con frecuencia estas enzimas sirven como modelo para distintos estudios bioqumicos.
La otra vertiente es biotecnolgica, derivada de la importancia comercial de muchos de estos
enzimas, cuya estructura puede ser modificada para mejorar su rendimiento en los procesos
industriales en los que son empleadas.
Las carbohidrasas han servido como modelo experimental para el estudio de un
importante problema bioqumico, como es la estabilidad conformacional de las protenas. El
trabajo de B. W. Matthews y colaboradores con la lisozima del fago T4 permiti dilucidar algunos
de los factores estructurales que determinan la resistencia de las protenas a la desnaturalizacin
trmica. Una vez resuelta la estructura tridimensional de la enzima, estos autores utilizaron el
anlisis racional para disear e introducir variaciones en la secuencia, que aumentaran la
resistencia a un incremento de temperatura. Sus resultados demostraron que la estabilidad
trmica se ve favorecida por la introduccin de puentes disulfuro, que actan reduciendo la
diferencia de entropa entre las conformaciones nativa y desnaturalizada de la protena. Efectos
anlogos fueron demostrados para sustituciones de aminocidos que estabilizan elementos de
estructura secundaria (-hlices) y otras que incrementan el nmero de interacciones
hidrofbicas en el ncleo de la protena (19-21). Una aproximacin experimental mediante
mutagnesis aleatoria y evolucin dirigida, realizada con las dos -glucosidasas homlogas de
Paenibacillus polymyxa, sirvi para identificar distintos cambios estructurales producidos por
determinadas sustituciones de aminocidos que favorecen la estabilidad de las protenas. La
combinacin de las mutaciones individuales condujo a la obtencin de nuevas variantes de estas
enzimas con resistencia trmica notablemente incrementada (4;13). Mediante una aproximacin
parecida, Flores y Ellington (12) generaron y analizaron variantes termoresistentes de la glucuronidasa de E. coli. Sus resultados aportan interesantes conclusiones sobre la relacin
entre la estabilidad de la estructura cuaternaria de las protenas y su termoresistencia.
La evolucin molecular ha demostrado ser una metodologa particularmente til para
modificar la especificidad de substrato, lo que permite obtener nuevas capacidades enzimticas.
Utilizando esta aproximacin se ha conseguido convertir una fucosidasa en galactosidasa (31).
Modificar la especificidad de substrato es un objetivo difcil de conseguir mediante diseo
racional y mutacin dirigida, porque el cambio necesario generalmente requiere una
reestructuracin del sitio cataltico que afecta a varios residuos e implica un nmero muy elevado
de interacciones atmicas. No obstante, existen casos en los que se han obtenido importantes
xitos. Por ejemplo, se ha conseguido convertir una xilanasa en glucanasa (3).
Un importante hito en la ingeniera de glicosil hidrolasas ha sido la transformacin de
enzimas hidrolticas en sintticas, susceptibles de ser utilizadas para la biosntesis industrial de
oligosacridos. Un caso notable ha sido la manipulacin realizada con una -glucosidasa de
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