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Validation of Microbial Recovery from Surfaces

Validacin de recobro microbiano de superficies


Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter Vol. 13 (10)
Scott Sutton, Ph.D.
Introduction
Introduccin
Last month we looked at recovery studies designed to show differences
between two putatively identical populations. These could be an old batch of
media versus a new batch of media, an inoculum into a neutralized disinfectant
compared to its control, or other comparisons that we expect to be the same.
We have established a 70% recovery (test sample to control sample) as our
criteria for these studies, unless mandated by compendial directive.
En el ltimo mes vimos en los estudios de recobro diseados para mostrar
entre dos poblaciones supuestamente idnticas. Estos podran ser un lote viejo
de medio contra un lote nuevo de medio, un inculo en un desinfectante
neutralizado comparado contra su control, u otras comparaciones que
esperamos sean las mismas. Hemos establecido un 70% de recobro (muestra
prueba, muestra control) como nuestro criterio para estos estudios, al menos lo
mandado por la directiva compendial.
A second type of recovery study that is commonly done is to evaluate the
recovery of microorganisms from a solid surface. This might be done to aid in
the development of a minimal sterilization cycle for a medical device, it might be
done as part of a disinfectant study, to qualify a method of taking environmental
monitoring samples, or for a number of other reasons.
Un segundo tipo de estudios de recobro que se hace comnmente es evaluar
el recobro de microorganismos de una superficie slida. Esto puede hacerse
para ayudar en el desarrollo de un ciclo mnimo de esterilizacin para
dispositivos mdicos, puede hacerse como parte de un estudio de un
desinfectante, para calificar el mtodo de toma de muestras para monitoreo
ambiental, o por otras razones.
Since 70% recovery is expected for microbial validation studies, we should
insist on this acceptance criterion for this study as well right? Actually, we
probably should consider that the 70% criteria came from a completely different
experimental design, with completely different conditions. Despite these
differences, there is a belief that everyone knows it is in the USP that 70% is
the acceptance criteria for recovery studies of surface sampling methods. This
turns out not to be the case. One must exercise caution in uncritical acceptance
of what everybody knows. In addition, it is always useful to bear in mind that
the compendia (USP, Pharm Eur, JP and even the BP) are written by mortals
and may not actually be correct for your application.
Ya que se espera un 70% de recobro para estudios de validacin microbiana,
debemos insistir sobre este criterio de aceptacin para este estudio no? En
realidad probablemente debemos considerar que el criterio del 70% viene de

diseo experimental completamente diferente, con condiciones completamente


diferentes. A pesar de estas diferencias existe la creencia de que todos saben
que est en la USP que el criterio del 70% es el criterio de aceptacin para
estudios de recobro de muestreos de superficie. Resulta que este no es el
caso. Hay que actuar con cautela en la aceptacin crtica de todo el mundo lo
sabe. Adems, siempre es til tener en cuenta que los compendios (USP,
Pharm Eur, JP y hasta la BP) estn escritos por mortales y en realidad puede
no ser correcto para su aplicacin.
However, in this case, the USP at least is silent in regards to reasonable
acceptance criteria for a surface recovery study.
Sin embargo, en este caso, la USP al menos no dice nada en cuanto a los
criterios de aceptacin para estudios de recobro de superficie.
So, if I am saying 70% is not a reasonable acceptance criterion for surface
recovery studies, what is? Before answering this question, lets take a step back
and try to figure out how to design a study to show microbial sampling
frequency from a surface.
Entonces, si digo que 70% no es un criterio de aceptacin razonable para
estudios de recobro de superficie, cul lo es? Antes de contestar esta
pregunta, vamos a dar un paso atrs y tratar de encontrar la manera de cmo
disear el estudio para mostrar la frecuencia de muestreo microbiano de una
superficie.
Study Designs
Diseos de Estudio
Deposition of Organisms
Depsito de Organismos
The first challenge in developing a test to measure bioburden sampling
recovery from a surface is to get some bioburden on a surface to sample. The
first thought is to do this like we do most tests, grow some cells up in culture to
use as an inoculum. We spread the cells on the solid surface, allow them to dry,
and then sample them. A problem with this approach is that vegetative cells are
susceptible to death by dessication to varying degrees (Potts 1994). In other
words, your inoculum is dying off at an unknown rate during the time you are
conducting the experiment.
El primer reto en el desarrollo de una prueba para medir el recobro de la carga
biolgica del muestreo de una superficie es obtener alguna carga microbiana
sobre la superficie a muestrear. Lo primero que pensamos es hacer esto como
lo hacemos en la mayora de las pruebas, algunas clulas crecen en un cultivo
para usarlas como un inculo. Espreamos las clulas sobre la superficie slida,
permitimos que seque, y entonces las muestreamos. Un problema con este
enfoque es que las clulas vegetativas son susceptibles a morir por
desecacin en diversos grados (Potts 1994). En otras palabras, el inculo est
muriendo a un ritmo desconocido durante el tiempo en que se est realizando
el experimento.

This situation does not seem to be well-designed to yield accurate results. One
way of approaching this problem I have heard about is to sample before the
inoculum completely dries on the surface. This certainly helps with the
dessication problem, but I have never been able to figure how sampling a
puddle is relevant to the question at hand.
Esta situacin no parece estar bien diseada para dar resultados precisos. Una
forma de enfocar este problema de la que he odo hablar es muestrear antes
de que el inculo est completamente seco sobre la superficie. Esto
ciertamente ayuda con el problema de desecacin, pero nunca he podido
entender como muestrear un charco es relevante para la cuestin que nos
ocupa.
Perhaps the problem is the organism used. Bacterial spores are easy to come
by and are resistant to dessication.
Tal vez el problema es el organismo usado. Las esporas de bacterias son
fciles de encontrar y son resistentes a la desecacin.
Several procedures use spores of organisms from the Bacillus genus for these
studies. This is a valid approach, but we must remember that this is valid only
as a lab assay it does not reflect contamination as it is likely to involve a more
firm attachment of the cells to the surface. A firm attachment of cells is easy to
envision in terms of a nascent biofilm of growing cells on a moist surface. This
concern is probably less of less importance in a clean room where we might
reasonably assume that most contamination is the result of a transient
deposition of organisms from the clean room operators, rather tan an
established biofilm firmly attached to the surface.
Muchos procedimientos usan esporas de organismos del gnero Bacillus para
estos estudios. Este es un enfoque vlido pero debemos recordar que esto es
vlido solamente como un ensayo de laboratorio esto no refleja la
contaminacin ya que es probable que incluya una firme adhesin de las
clulas a la superficie. Una firme adhesin es fcil de preveer en trminos
biopelcula naciente de clulas que crecen en una superficie hmeda. Esta
preocupacin es probablemente la menor de las menores importancias en una
sala limpia donde asumimos razonablemente que mucha contaminacin es el
resultado de una deposicin transitoria de organismos de los operadores de la
sala limpia, ms que un biopelcula firmemente adheridas a la superficie.
So perhaps we might be able to defend deposition of spores as a reasonable
model for clean room surface contamination.
As que tal vez podramos ser capaces de defender la deposicin de esporas
como un modelo razonable para contaminacin de superficies de salas limpias.
A different approach might be to take materials of construction from the facility
and allow them to be contaminated naturally. This, however, leads to questions
about how to calculate recovery if we do not know the starting concentration.
Un diferente enfoque pudiera ser tomar los materiales de construccin de las
instalaciones y permitirles contaminarse naturalmente. Esto, sin embargo,
conduce a preguntas acerca de cmo calcular el recobro si no conocemos la
concentracin inicial.

For the moment at least, lets assume we will deposit bacterial spores of some
type on the surface to be tested and allow the inoculum to dry thoroughly.
Por el momento, al menos, supongamos que depositaremos esporas de
bacterias de algn tipo sobre la superficie a ser probada y permitir que el
inculo seque completamente.
Sampling for Enumeration
Muestreo para Conteo
Contact plates are very useful, but they do have some drawbacks. One of them
is we dont know how effective they are on all surfaces (thats what we are trying
to find out). Another is that they are of finite size. This size is usually smaller
surface area tan that of a standard petri dish. The first problem to think about
then is how many CFU can actually be counted on one of those things. The 25
250 rule was developed for E. coli on standard plates (reviewed in PMF
Newsletter
of
September,
2006
at
http://www.microbiologyforum.org/PMFNews/PMFNews.12.10.0610.pdf). With a
smaller surface area the contact plate cannot support the same numbers but
what numbers are allowed in your SOP?
Las placas de contacto son muy tiles, pero tienen algunas desventajas. Una
de ellas es que no sabemos qu tan eficaces son en todas las superficies (que
es lo que estamos tratando de averiguar) Otra es que son de tamao finito.
Este tamao generalmente un rea superficial ms pequea que otras cajas
petri estndar. El primer problema es pensar, pues cuantas UFC pueden
realmente contarse sobre una de esas placas. La regla 25 -250 se desarroll
para E. coli sobre platos estndar (revisado en el PMF Newsletter de
Septiembre
del
2006
en
http://www.microbiologyforum.org/PMFNews/PMFNews.12.10.0610.pdf). Con
un rea superficial pequea la placa de contacto no puede soportar el mismo
nmero pero que nmero se permite en tu PNO?
A second problem here is that you will frequently want to use this technique to
qualify disinfectants, sanitizers or sporicides for hard surface use in your facility.
Very difficult to show a 3-log reduction if you cannot dilute the solid surface, nor
can you count 1,000 CFU on a plate.
Un segundo problema aqu es con que frecuencia quiere usar esta tcnica para
calificacin de desinfectantes, sanitizantes o esporicidas para superficies duras
usadas en sus instalaciones. Es muy difcil mostrar una reduccin de 3
logaritmos si no puede diluir la superficie slida, ni se puede contar 1000 UFC
en una placa.
This limitation must be kept in mind while we look at available designs.
Esta limitacin debe tenerse en cuenta al mismo tiempo nos fijamos en los
diseos disponibles

Available Designs
Diseos obtenibles
Direct inoculation and sampling
Inoculacin directa y muestreo
Having pointed out the shortcomings of direct inoculation, I am now going to
recommend it as a viable design for surface recovery studies. The fact that it
probably has little relation to the actual attachment of bacteria to a surface is
only of passing concern.
Tras recordar las deficiencias de la inoculacin directa, ahora voy a
recomendarla como un diseo viable para los estudios de recobro de
superficie. El hecho de que es probable que tenga poca relacin a la
adherencia real de la bacteria a la superficie es slo una preocupacin
pasajera.
First of all, as we mentioned before, people are going to be the primary source
of contamination in a wellmaintained cleanroom. People shed skin at a
prodigious rate (on this scale) with an entire layer replaced on average in less
than 24 hours (Jansen et al 1974). These particles can be measured and a
normal individual can shed enormous numbers of skin fragments. Many of
these will contain viable bacteria (Ljungqvist and Reinmuller 2000) and these
will, in all likelihood, be the primary material recovered from surface monitoring
(as well as both passive and active viable air sampling).
Primero que nada, como mencionamos antes, la gente ser la fuente principal
de contaminacin en una sala limpia bien mantenida. La gente muda de piel a
un ritmo prodigioso (en esta escala) con una capa entera reemplazada en un
promedio de menos de 24 horas (Jansen et al 1974). Estas partculas pueden
Estas partculas pueden medirse y un individuo normal puede deshacerse de
enormes cantidades de fragmentos de piel. Muchos de esos pueden contener
bacterias viables (Ljungqvist and Reinmuller 2000) y estos, con toda
probabilidad sern el material principal recuperado de la superficie monitoreada
(as como del muestreo del aire pasivo y activo de viables).
This assumption (that clean room contamination will be primarily from the
operators shedding skin flakes onto surfaces) allows us to justify the use of a
controlled inoculum to be placed in a precise area of the coupon. Several
studies have used this approach to determine recovery efficacies (see below).
However, lets look at a couple of other designs before moving on.
Esta suposicin (que la contaminacin de la sala limpia ser principalmente de
la piel de los operadores sobre las superficies) nos permitir justificar el uso de
un inculo controlado colocado en un rea determinada del cupn. Varios
estudios han usado este enfoque para determinar la eficacia del recobro (ver
abajo). Sin embargo, veamos un par de otros diseos antes de continuar.

Linear Regression
Regresin Lineal
A different approach is to use a linear regression model (Whyte 1989). The
inoculation design provided us with a starting inoculum from which we can
estimate recovery frequent by taking the recovery from the first sampling and
dividing the CFU recovered by the total. In this method, a surface is sampled
repeatedly and the number of CFU recovered is graphed against the sample
number on a log-normal scale. The slope of the resulting line is log10(1Sampling Efficacy). This method has an enormous advantage in not requiring
knowledge of the number of organisms originally on the surface. This
consideration is particularly important if the surface recovery study is being
used to prepare for a sterilization cycle of a medical device where you usually
have little idea of the native bioburden.
Un enfoque diferente es usar un modelo de regresin lineal (Whyte 1989). El
diseo de inoculacin nos proporcion un inculo de inicio del cual podemos
estimar el recobro frecuente tomando el recobro del primer muestreo y
dividiendo las UFC recuperadas entre el total. En este mtodo, una superficie
es muestreada repetidamente y el nmero de UFC recuperadas se grafican
contra el nmero de muestra sobre una escala de logaritmo normal. La
pendiente de la lnea resultante log10 (1- Eficacia del muestreo). Este mtodo
tiene una enorme ventaja en que no requiere el conocimiento del nmero de
organismos originales sobre la superficie. Esta consideracin es
particularmente importante si el estudio de recobro de superficie est siendo
usado para preparar un ciclo de esterilizacin de un dispositivo mdico en el
que por lo general tienen una pequea idea de la carga biolgica nativa.
Sampling to Extinction
A less mathematically-oriented approach that provides much the same
advantages is recommended by ISO (ISO 11737-1). In this approach the same
area is sampled repeatedly (as many as 10 times to ensure that no CFU are
recovered in the later sampling events) and each sampling event is incubated
for recovery. The CFU form the initial sampling event is then divided by the total
of the recovered microorganisms for the recovery frequency. Like the linear
regression method this does not require knowledge of the initial contamination
level, but has a huge advantage in only requiring basic math skills.
Muestreo a Extincin
Un enfoque menos orientado matemticamente que proporciona gran parte de
las mismas ventajas se recomienda por ISO (ISO 11737-1). En este enfoque la
misma rea se muestrea repetidamente (por lo menos diez veces para
asegurar que no se recuperan UFC en el ltimo muestreo) y cada muestreo se
incuba para recobro. Las UFC del muestreo inicial se dividen entre el total de
los microorganismos recuperados para la frecuencia de recobro. Al igual que el
mtodo de regresin lineal, este no requiere el conocimiento del nivel de
contaminacin inicial, pero tiene una gran ventaja en que solo requiere
conocimientos bsicos de matemticas.

Acceptance Criteria
Criterio de Aceptacin
So, after all this, what are reasonable acceptance criteria?
I dont know. There are too many variables and the point of the study is to
determine recovery frequency.
As despus de todo esto, Cul es criterio de aceptacin razonable?
No lo s, hay muchas variables y el punto del estudio es determinar la
frecuencia de recobro.
Favero (1968) describes several different methods:
Swabs
Rinses
Pads
Contact Plate
Roller Plates (agar sausage)
Flexible Film
Adhesive tape
Favero (1968) describe varios mtodos diferentes:
-

Hisopos.
Enjuagues.
Almohadillas.
Placas de contacto.
Placas de rodillo (salchicha agar)
Pelcula flexible.
Tapa adhesiva.

These are all going to have different recovery efficiencies.


Todos ellos tienen diferentes eficiencias de recobro.
In addition, even using the same method, different challenge organisms are
likely to provide different estimates of efficacy (Douglas 1968). Each must be
evaluated on its own merits. As an aside, recovery efficacies in the literature
seem to range from 10 70% depending on the organism, surface, and
sampling method.
Adems, incluso utilizando el mismo mtodo, diferentes organismos retados
pueden proporcionar diferentes estimaciones de la eficacia (Douglas 1968).
Cada uno debe ser evaluado por sus propios mritos. Por otro lado, las
eficacias de recobro en la literatura se ven rangos de 10 -70% dependiendo del
organismo, superficie, y mtodo de muestreo.

None of this helps if you are attempting to use a surface recovery design to
validate a surface monitoring procedure for a facility where you are concerned
about residual sanitizer. Clearly this is a concern. I would urge you to consider,
however, that given the vagaries of the sampling technique, this approach is not
the shortest path to your goal (or even the one most likely to be successful).
Nada de esto ayuda si est intentando usar el diseo de recobro de superficia
para validar un procedimiento de monitoreo de superficie para una instalacin
donde est preocupado por el sanitizante residual. Claramente esta es una
preocupacin, le insto a que, sin embargo, dados los caprichos de la tcnica de
muestreo, este enfoque no es el camino ms corto hacia su meta (o incluso
ms probable de tener xito).
I would recommend demonstration that a volumen of the sanitizer placed onto
the agar surface and allowed to soak-in is adequately neutralized and that the
medium is capable of supporting growth of a later inoculum by the means we
discussed last month. This is not an approach you will find in any regulatory
document, but it will allow for a meaningful and interpretable study of the growth
mediums neutralizing capability.
Yo recomendara la demostracin de que un volumen del sanitizante colocado
en la superficie del agar y absorbido es adecuadamente neutralizado y que el
medio es capaz de soportar el crecimiento de un inculo por los medios
discutidos el ltimo mes. Este es un enfoque que no encontrars en ningn
documento regulatorio, pero permitir un estudio vlido e interpretable de la
capacidad de neutralizacin de los medios de crecimiento.
Conclusion
Do not allow yourself to be committed to acceptance criteria that are
unreasonable and will doom the study to excessive deviations. A poor choice of
unattainable acceptance criteria makes what should be a relatively
straightforward study very difficult to close-out. The surface recovery study can
yield important information of great use to the environmental monitoring
program, evaluation of surface disinfectants/sporicides, determination of native
bioburden for medical devices and other applications. However, it is critical to
ensure that the study is asking the correct question, and that the design is
appropriate to answer the question being asked.
No permita comprometerse con criterios de aceptacin que sean irrazonables y
condene el estudio a excesivas desviaciones. Una mala eleccin de los
criterios de aceptacin inalcanzables hace que lo que debera de ser un estudio
relativamente sencillo sea difcil de cerrar. El estudio de recobro de superficie
puede dar informacin importante de gran utilidad para el programa de
vigilancia ambiental, la evaluacin de los desinfectantes/esporicidas sobre la
superficie, la determinacin de la carga biolgica nativa para dispositivos
mdicos y otras aplicaciones. Sin embargo, es crtico asegurar que el estudio
est respondiendo la pregunta correcta, y que el diseo es apropiado para
responder a la pregunta formulada.

Above all, make sure that established acceptance criteria for the study are well
thought-out and achievable.
Sobre todo, asegrese de que los criterios de aceptacin establecidos para el
estudio estn bien pensados y alcanzables
References
Referencias
Douglas, J. 1968. Recovery of known numbers of microorganisms from
surfaces by swabbing. Lab Practices. 17(12):1336-1337.
Favero, M.S. 1968. Microbiological sampling of surfaces. J. Appl Bact. 31:336343.
ISO 11737-1 Sterilization of medical devices Estimation of the population of
micro-organisms on product. 1995.
Jansen, et al. 1974. Improved fluorescence staining technique for estimating
turnover of the human stratum corneum. Brit J Dermatol 90:9.
Ljungqvist, B and B Reinmuller. 2000. Airborne Viable Particles and Total
Number of Airborne Particles: Comparative Studies of Active Air Studies. PDA J
Pharm Sci Tech. 54(2):112-116.
Potts, M. 1994. Dessication Tolerance of Prokaryotes. Microbiol Rev. 58(4):755805.
Whyte, W. 1989. Methods for calculating the efficiency of bacterial surface
sampling techniques. J Hosp Infect 13:33-41.
http://www.microbiologyforum.org/PMFNews/PMFNews.13.10.0710.pdf

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