CAPITOLO 3 Purificazione e separazione . . oe oe 0* di principi attivi Bruno Tasso, Simona Collina 1 Metodi di purificazione fi Estrazione liquido-liquido e ripartizione Tecniche cromatografiche tradizionali ® Estrazione in fase solida (SPE) Sanne unnnnneal ancetti essenziali ‘one ¢ sublimazione sono metodi di purificazione dei composti solidi, cost come la distilla:ione @ un metodo di purificazione dei composti liquidi. Essi, con oppor- tuni accorgimenti, possono essere utilizzati anche per frazionare miscele di due com- posti che abbiano caratteri chimico fisici sufficientemente differenziati. La separazione di miscele pit complesse pud essere attuata mediante la riparti- zione per estrazione 0 ri a tecniche cromatografiche. La ripartizione si basa sul frazionamento di compost, sciolti in un determinato solvente, che si ripartiscono in un altro solvente, immiscibile con il primo, in fun- zione delle rispettive solubilita. Su questo principio si basa il metodo di smistamento di una miscela di composti in frazioni di component aventi lo stesso carattere chi- mico. Una miscela complessa si pus pertanto differenziare nelle frazioni acida, basica ¢ neu- tra. | component tali frazioni, aventi lo stesso carattere chimico, possono essere ul- teriormente smistati sfruttando le diverse proprieta chimico fisiche (metodi sopra é citati o cromatografia). La cromatografia & un metodo di separazione basato sulla distribuzione dei com- Ponenti fra due fasi, una fissa ed una mobile. ~ La fase fissa pud essere costituita da un solido (cromatografia di adsorbimento) 0 da un liquido opportunamente supportato da un solido (cromatografia di ripar- tizione); ~ La fase mobile & costituita da un fluido che scorre sulla fase fissa. II fluido pud es— sere un gas (gaseromatografia, v. Cap.7.1) 0 un liquido (cromatografia in fase liquida) Ja cui tecnica pid avanzata @ !HPLC (Cap.7.2). — | paragrafi 3.1-3.3 sono elaborati dai {i ompost di interese farmaceutico, ECIG. Paragrafo 3.4 @ elaborato dalle lezioni on-line di O. Bruno. ~~ | - i Cap.1 € Cap. 7 di: F. Savelli, A. Boido; Guida all’analist44 @ Caprroio 3 - PurIFICAZIONE SEPARAZIONE DI PRINCIPL ATTIVL Ja cromatografis a scombo ionico offre la possibilita di separare composti ionici ° fortemente ionizzabili, mentre la cromatografia di esclusione dimensionale/gel permea. Zone & in grado di separare i componenti di un campione in base alla loie diffe, rente dimensione molecolare. Vestrazione in fase solida (SPE) & una tecnica estrattiva alternativa in quanto Tr eal enediante semplici operazioni, la separazione dell'analita in piccoli tolmea di solvente idonei allanalisi mediante teeniche cromatografiche (GC, HPLO). La tecnica pud essere ritentiva, in cui viene trattenuto l'analita e now { compo- Pat a eprent © non ritentioa in cui vengono trattenuti i componenti into, renti ed eluito ’analita, Per tale tecnica vengono impiegati adsorbenti polimetici contenuti in appro- riata cartuccia. L'idoneo abbinamento adsorbente-eluente garantisce Pefficienza della separazione. 4] Metodi di purificazione 1.2 determinazione delle proprieta fsiche dei composti organici & operazione indispensabile per la loro identificazione ¢ risulta significativs sole se eseguita su FpmPosti puri ottenibili mediante metodi di purificazione: cristallimavinee vane blimazione se solidi, distillazione se liquidi. I metodi cromatografici, efficacemente impiegati per la purificazione di composti solidi o liquidi, reppresentane, inoltre, con alti che verrenne illustrati, un indispensabile mezzo analitico e preparative, Tprocessi connessi ai passaggi di stato sono cosi risssuntis brinamento (_--->->72. "'. + solidficazione condensazione SOLIDO LiquIDo. VAPORE ] fusions ‘evaporazion@ LC" —______ ‘sublimazione i388 Cristallizzazione Be *fstallizzazione La cristallizzazione & una tecnica di purificazione che consente di ottenere una sostanza solida, allo stato cristallino, che si separa da una sua soluzione in cui restano disciolte le impurezze. Una sostanza solida pud essere purificata mediante cristallizzazione semplice solo se essa rappresenta, nella miscela, il componente maggioritario e le impu- Tezze costituiscono, al massimo, il 5-10% della miscela, Se non ci si trovasse in tale condizione ¢ la componente estranea fosse in percentuale maggiore occorre attuare una cristallizzazione frazionata o ricorrere ad altri metodi separativi. La cristallizzazione viene effettuata secondo una sequenza di passaggi: - scelta del solvente; ; ~ solubilizzazione, a caldo, della miscela seguita, se necessario, da filtrazione, per eliminare eventuali tracce di sostanze insolubili, o da decolorazione con carbone attivo;METODI DI PURIFICAZIONE @ 45 _ raffreddamento della soluzione; filtrazione dei cristalli separatis ~ essiccamento dei cristallis = controllo della purezza del solido cristallino ottenuto. Il processo di cristallizzazione si basa sul principio che, da una soluzione sa- tura a caldo, si separa, per raffreddamento, la sostanza in essa disciolts, Da que- sta premessa si intuisce Pimportanza che la scelta del solvente di cristallizzazione riveste: il solvente prescelto deve rispondere a determinate caratteristiche quali: — essere inerte nei confronti della sostanza da purificare; - possedere, nei riguardi della stessa, un elevato potere solvente a caldo € basso a freddo; essere caratterizzato da volatilita intermedia, non bassa, per poter essere facilmente allontanato dalla superficie dei cristalli formatisi, e non ele- vata, onde evitare una rapida concentrazione della soluzione; — essere poco tossico. Altri paramezri che non devono essere trascurati sono il costo del solvente, Ja sua infiammabsilita ¢ la capacita di fornire cristalli ben formati della sostanza. Alla scelta de! solvente ed alla definizione dei rapporti di cristallizzazione so- lutoholvente si procede, per sostanze gia note, riferendosi a dati riportati in let- teratura ed, in mancanza di questi, a saggi, eseguiti in via preliminare su piccole quantita di sostanza, attenendosi al principio che i composti, particolarmente se di semplice struttura, vengono efficacemente solubilizzati da solventi chimica- mente affini (v. solubilita: § 5.1.4). In tal caso sono utili informazioni sulla struttura della molecola, come la pre- senza di gruppi funzionali. Spesso, pero, la contemporanea presenza di diffe- renti gruppi funzionali rende necessaria l’esecuzione di alcuni saggi preliminari. In tab. 3.1-1 sono riportati, in ordine di polarita crescente, i solventi pitt co- munemente utilizzati nella cristallizzazione e ne viene indicato il grado di tos- sicith ed infiammabilita. Cristallizzazione semplice La sostanza finemente polverizzata viene posta in beuta e sciolta nella mi nor quantita del solvente prescelto alla temperatura di ebollizione’, in prossi mit’ della quale ciascun liquido raggiunge il suo massimo potere solvente. Se la sostanza presentasse difficolta a sciogliersi completamente, @ opportuno non insistere nell'aggiunta di solvente, ma filtrare a caldo l’indisciolto che potrebbe riferirsi ad impurezze insolubili nel solvente. La soluzione filtrata e limpida’ viene lasciata raffreddare lentamente in maniera che, venendo a diminuire il po- ——____ Per liquidi infiammabili e volatili non si impieghino fiamme dirette ma fonti di calore diverse some bagni-maria, mantelli riscaldanti, bagni ad olio o silicone, ece. In caso di soluzioni brune o in presenza di sospensioni fini si pud chiarificare la soluzione ag- Biungendo sostanze adsorbenti inerti (carbone attivo, kieselgur 0 cellulosa in misura dell']-5% ispetto al soluto) e quindi riscaldando con cautela per qualche minuto (attenzione: posubiliea dt schiumeggiamento). Si filtra su carta a pieghe. Per evitare la formazione di solido sull"imbuto oc- corre preriscaldare lo stesso imbuto e mantenere calda la beuta di raccolta ponendola su bagno "aria durante la filtrazione. Sulla soluzione, ove non nisultasse sufficientemente limpida, pud es- Sere ripetuto il trattamento descritto. ~~~ 46m CarrroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI EBISEA soiventi di cristallizzazione Solvente pe. _Infiammabilita_| ___Tossicit3 Esano oo +++ +++ Etere di petrolio 40-60 +++ ++ Benzene 80 ++ +t44 Toluene ul + +++ Carbonio tetracloruro 17 - tHt4 Diclorometano 40 - ++ Etere etilico on +t+4+ ++ Acetone 56 ++ + j Cloroformio 61 ~ Fat Tetraidrofurano 65 ++ +++ Etile acetato 7 | ++ ++ Diossano ior | ++ +++ Etanolo | ++ +44 Acido acetico 18 | a +444 Acqua 100 | tere solvente del liquido, si separi il solido in forma cristallina, mentre le im- Purezze restano, di solito, disciolte nella soluzionc: in quanto, a caldo, essa aveva Taggiunto il grado di saturazione rispetto alla sostanza da purificare ma non ri- spetto alle piccole quantita di impurezze in essa contenute’. Pud rivelarsi necessario, nel caso di soluzioni soprassature, innescare il pro- cesso di cristallizzazione aggiungendo un cristallino della sostanza (germe) da cui procede l'accrescimento del solide, Germi di cristallizzazione possono essere a trimenti ottenuti per fregamento con una bacchettina di vetro sulle pareti interne del recipiente di cristallizzscione. Quanto pit lento @ Vaccrescimento dei cristal, tanto maggiore risultcrs i! loro grado di purezza, poiché un accrescimento OPPO rapido potrehbe provocare occlnsioni di solvente nelledificio cristallino. II solido cristailizzato viene raccolto, a temperatura ambiente, per filtrazione in imbuto con setto poroso ¢ ia soluzione filtrata (madri di cristallizzazione) Posta in frigorifero per consentire, mediante un ulteriore raffreddamento, il i cupero di restanti porzioni di sostanza che potrebbero rivelarsi di un grado di purezza meno soddisfacente.* Alternativamente, il recupero delle porzioni pe solubili potrebbe essere effettuato per concentrazione delle stesse madri di cri stallizzazione. j * In genere un grezzo si definisce unitario quando un composto contenuto in misura di cit# i 90-95% accanto ad altri prodotti di reazione, di alterazione o di natura accidentale. . erat * Una sostanza pud definirsi pura se, sottoposta a processi di purificazione, mantiene inal i suoi caratteri fisici (pf, pe). aMETODI DI PURIFICAZIONE M47 Il frazionamento nella raccolta del cristallizzato permette l’ottenimento di una frazione soddisfacentemente pura e, soprattutto, risulta necessario allorché si debba operare la separazione di una miscela di due componenti solidi, sfruttan- done la diversa solubilita nel solvente prescelto (cristallizeazione frazionata). Nella frazione di testa (1° cristallizzato) si ritrova il componente meno solul ed in quella di coda il pid solubile. I cristalli, raccolti mediante filtrazione, possono contenere piccole quantita di solvente. Per eliminare completamente il/i solvente/i di cristallizzazione si sono utilizzare vari metodi di essiccamento (cfr. 3.2.2). Se il prodotto é termostabile e non ossidabile all'aria i cristalli possono es- sere essiccati all’aria o in stufa ad una temperatura circa 30°C inferiore al pf dei cristalli. Quando il prodotto é termolabile, bassofondente o sublimabile (possiede ele- vata tensione di vapore) i cristalli devono essere posti in essiccatore (v. 1.2-9a € § 3.2.2) con adatti agenti essiccanti (Tabella 3.1-2). Cristallizzazione da due solventi Se non fosse stato individuato il solvente idoneo per il composto da purifi- care, si pud ricorrere ad una miscela di solventi miscibili fra loro, di cui il primo deve risultare efficace (alto potere solvente a freddo) ed uno inefficace (basso po- tere solvente a caldo) nei confronti del soluto. Tra le miscele di solventi pitt co- munemente impiegate vi sono: benzene-etere di petrolio (da evitare per l’ele- vata tossicita del benzene), esano-acetato di etile, etanolo-acqua, etanolo-etere etilico, acetone-acqua. Il metodo di cristallizzazione consiste nello sciogliere il composto nella minor quantita di solvente efficace, quindi, aggiungere, goccia a goccia a caldo, il solvente meno efficace fino a che, nel punto di gocciolamento, si nota comparsa di un precipitato che stenta a ridisciogliersi per agitazione. La soluzione, limpida a caldo, dopo eventuale filtrazione, viene lasciata raffreddare, operando quindi nella maniera descritta per la cristallizzazione semplice. Ove, dopo una cristallizzazione, la sostanza non risultasse sufficientemente pura, si ripete ’operazione fino a che la differenza nel pf fra un cristallizzato e quello proveniente dalla precedente purificazione risulti inferiore a 2°C. Se, malgrado ripetute cristallizzazioni, la sostanza non si rivelasse sufficien- temente pura, sara necessario individuare un diverso solvente di cristallizzazione © ricorrere ad altro metodo di purificazione. HABER] Agenti essiccanti per essiccatori Agenti essiccanti Solventi da essiccare y CaCl, gel di silice, ‘Acqua e alco! POs KOH (gocce) CH,COOH Idrocarburi (benzene, xileni, esano ecc.) Paraffina a fette Eteri (etere etilico, etere isopropilico ecc:) Solventi alogenati (CHCl, CH,Cl,)O—— 48° @ Caprroro 3 - PURIFICAZIONF F SEPARAZIONE DI PRINCIPL ATTIVI Filtrazione | La filtrazione @ il metodo pit: comunemente usato per separare un solido da un liquid o per isolare partielle in esso sospese. Ove queste a causa del loro peso o perché centrifugate, si depositassero sul fondo, si pud procedere ad una semplice decantazione o ad una filtrazione in un comune imbuto di vetro (v. Fig. 1.2-6) al quale sia stato adattato un filtro, a cono o a pieghe, di carta po- rosa, a filtrazione rapida, inumidita col solvente da separare. Quando bisogna Tecuperare un composto cristallino, la normale filtrazione su carta, risultando poco adatta, viene sostituita con la filtrazione sotto vuoto in cui l’aspirazione del liquido é favorita da una depressione idonea a consentire una moderata ve- locita di filerazione. A tal fine viene utilizzata una pompa aspirante collegata con una idonea beuta da vuoto (Fig.1.2-2b) 0 una provetta da vuoto munite, a se- conda delle quantita di liquido da filtrare, con filtri a setto di vetro di varia po- rosita (Gooch) o imbuti di Buchner di porcellana a piastra forata su cui deve essere fatto aderire, prima della filtrazione, un disco di carta tale da coprire tutti i pori (Fig.1.2-14b). Liaspirazione @ determinata abitualmente da una pompa a caduta dacqua (12-20 mm Hg) (Fig. 1.2-10b) 0 da una pompa ad olio che, per il vuoto in grado i produrre (1-0,01 mm Hg), non risulta idonea per filtrazioni di solventi vo- in quanto, oltre a causare una concentrazione delia soluzione filtrata, pud produrre, in presenza di particelle fini di solido, un intasamento dei pori del setto poroso. Il vantaggio di una filtrazione per aspirazione si riscontra nella ra- pidita dell’operazione ¢ nella possibilita di allontanare, in maniera quasi com- pleta, la soluzione (acque madri) dalla superficie dei cristalli, in qualcosa pud comunque essere realizzata lavando i cristalli con piccole porvioni di solvente Puro e pressandoli, sotto aspirazione, con spatola o tappo di vetro. bad] Sublimazione F il passaggio di una sostanca direttamente dallo stato solido a quello gassoso. _ Anche questo processo rappresenta una tecnica di purificazione per compo- sti solidi, ma presenta una applicabilith limitata solo a sostanze solide serps stabili¢ dotate di tensione di vapore sufficientemente elevata a temperance feriore a quella di fusione. I solidi, come i liquidi, possiedono una tensione di vapore i cui valori, di- Tettamente dipendenti dalla temperatura, risultano generalmente peck ov sendo le energie di legame maggiori nei solidi che na liquid. Esistono tutta. via sostanve solide che, carattetizzate da modesti valori di energia di lngame o possedendo, a temperature relaivamente basse, tensioni di vapoee aporeenel Possono essere facilmente portate allo stato di vapore che, per rinse nisee un solido suffcientemente puro, Il metodo presenta anche il wren i a essere eseguibile su piccole quantita di sostanza, eee Si esamini il diagramma di stato dell acqua (Fig. 3.1-1): le linee OA, OB ed OC delimitano i campi di esistenza di due fasi che coesistono hungo ciascuna li- nea su cui 2 sulficiente fissare un parametro per definire lo sate (fare ee che, nel caso, é monovariante (varianza = numero dei Componenti — numero delle fas + 2)- Dal diagramna si pd osservare che le curve Oa ed OB, che eonacs Sentano rspettivamente i punt di coesistenza delle fai solido-vapore ¢ lavila. vapore, rivelano, per la accentuata pendenza, che i processi di teblina tgMETODI DI PURIFICAZIONE @ 49. di evaporazione sono dipendenti da pur piccole variazioni di pressione. La curva OC, leggermente inclinata, rivela, invece, come la pressione eserciti un trascu- rabile effetto nel passaggio fra gli stati solido e liquido. 1 punto O (punto triplo) di incontro delle tre curve che delimitano i campi di esistenza delle tre fasi individua la sola coppia di valori di pressione ¢ tem- peratura in cui le fasi solido, liquido € vapore coesistono (sistema zerovariante). Ogni composto possiede un valore di pressione, corrispondente al punto triplo, al di sotto del quale, possedendo esso una tensione di vapore non trascurabile, @ realizzabile il processo di sublimazione. Pur segnalando l’esistenza di qualche sostanza che, assumendo la pressione relativa al punto triplo valori maggiori di un’atmosfera, sublima spontaneamente a temperatura ambiente (es. anidride carbonica) e di altre sublimabili per ri- scaldamento a pressione atmosferica (ac. benzoico: 100°C; ac. salicilico: 95-135 °C; caffeina: 178°C, timolo: 40°C; teobromina: 290°C), la maggior parte dei compo- sti possono essere sublimati sotto vuoto (a valori di temperatura inferiori a quelli del punto di fusione) ed i loro vapori brinati per raffreddamento, utilizzando per tale processo !’apparecchio rappresentato in fig. 3.1-2. Essenzialmente, tale apparecchio é costituito da un tubo chiuso e munito di connessione per praticare il vuoto. Nel suo interno é inserito un condensatore raffreddato ad acqua € dotato di connessione laterale per il collegamento ad una pompa da vuoto. I] vuoto deve essere realizzato lentamente, perché la presenza di umidita 0 di solventi pud causare schizzi del solido sulla superficie del con- densatore, causando contaminazione del sublimato. L’esterno del tubo é riscal- dato, nel settore terminale ove é posta la sostanza da sublimare, con bagno ad olio di silicone. L’uso di Bunsen, come fonte di calore, pud provocare decomposizioni termiche dovute a surriscaldamenti locali. E buona norma aumentare lentamente la temperatura fino ad un valore di circa 30°C inferiore al punto di fusione della sostanza da purificare. La sostanza subli- mata si deposita sul fondo del tubo con- densatore interno. @T Un semplice metodo di sublimazione a pressione atmosferica pud essere ese- guito ponendo Ia sostanza in una capsula Coperta da un imbuto capovolto il cui gambo é chiuso a tenuta lasca con un tam- Pone di ovatta ed utilizzando come fonte Gicalore un bagno di sabbia. Per evitare hei subtimato ricada nella capsul, siin- Setisce, fra questa ¢ l'imbuto, un foglio di arta da filtro in cui sono stati praticati al- Cuni piccoli fori, em disponibili anche microsublima- a | per Piecole quantita di campione (2- one in tali casi, la sublimazione é pit) ¢ della cristallizzazione, consenten- Fig. 3.1-2 - Apparecchio di sublima- ese circa quantitative. vione a pressione ridotta Fig. 3.1-1 - Influenza della pressione sul passaggi di stato dell’acqua.iD 50 CaPrroLo 3 - PURIFICAZIONE a3] Disti EPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVE Mazione E un metodo di purificazione di sostanze liquide, mediante riscaldamento, alla temperatura di ebollizione, e condensazione in refrigerante del vapore pro’ dotto. Esistono due procedure general distillazione in equicorrente (distillazione semplice): il vapore ed il liquido con- densato si spostano nello stesso senso; distillazione con rettifica: il condensato scorre in senso inverso al vapore; que- Sta tecnica consente di separare una miscela di liquidi la cui differenza nei punti di ebollizione pud essere inferiore a 80°C. La separazione di una miscela di liquidi la cui differenza nei valori dei pe ésu- periore di 80°C, pud essere invece effettuata mediante distillazione semplice. Sia la distillazione semplice che quella con rettifica o frazionata Possono es- sere condotte a pressione atmosferica 0 sotto vuoto. Un liquido @ caratterizzato da una tensione di vapore (P) che rappresenta la pressione (in torr) esercitata dal vapore, in equilibrio con il liquido, e che esprime |a tendenza a passare in fase vapore, mediante Penergia acquisita con la som. ministrazione di calore che vince le forze di attra7: ne Intermolecolare. Durante il riscaldamento la tensione di vapore aumenta fino ad eguagliare 4a pressione esterna alla temperatura di ebollizione, pe, ailorché il liquid inizia a bollire. Il valore della temperatura di ebollizione di un tori, caratterizzanti la struttura, che, termolecolari, comportano un aumento della temperatura di ebollizione, Analogo incremento delle interazioni avviene con Paumento del peso mole- colare ¢ con Vinserimento di gruppi funzionali polari, liquido dipende da vari fat- incrementando le forze di attrazione in- Distillazione semplice Si esegue generalmente a pressione atmosferi di ebollizione siano comprese fra 35-150 verificare decomposicioni delle sostanze ica con liquidi le cui temperature °C poiché, oltre tale limite, si potrebbero comp ’ (particolarmente se termolabili) dovute a Feazioni di pirolisi, polimerizzazione o condensazione. Per ovviare a tale inconve- niente ¢ limitare Yapporto di calore, le sostanze termolabili o altobollenti vengono distillate a pressione ridotta. Per una stima grossolana della variazione della tem- peratura di ebollizione in funzione del vuoto, si calcola che, ad ogni dimezzamento della pressione, corrisponda un abbassamento di citea 15°C: del valore dpe Il punto di ebollizione a pressione ridotta pud essere ricavato, per i pili Co- ’ muni solventi, ricorrendo alle curve pressione di vapore (P)/temperatura (7) tracciate applicando espressione [3.1-1] (ricavata dalla integraziore dell'equa- zione di Clausius-Clapeyron). B logP=A~ = Ae B: costanti B.1-1] Riportando in ordinata il logaritmo delle pressioni di vapore in funzione del reciproco della 7, si ottiene una retta da cui si pud ricavare il valore di un pe Tametro, noto Valtro. Nelle curve relative a comuni solventi riprodote, a titolo esemplificativo in fig. 3.1-3, sono stati, per praticita, riportati direttamente i ¥@ lori di pressione e temperatura.Si possono utilizzare anche nomogrammi come quello illustrato in figura 3.1-4, ‘La scala B riporta i pe a pressione atmosfe- rica, la scala C la pressione in torr.. La proiezione sulla scala A della linea che congiunge il valore della pressione (?"), a cui si conduce la distillazione, con il valore di te a 760 torr. (pressione atmosferica), individua la te alla pressione P’. In fig. 3.1-5 viene schematizzato un appa- rato per distillazione adatto per operazioni sia a pressione ambiente che a pressione ridotta. E costituito da un pallone di distillazione, dove & posto il liquido da distillare, collegato, tra- mite un raccordo a tre vie, ad un termometro ead un refrigerante. Quest’ultimo, tramite un secondo raccordo di raccolta o angolare, col- legato ad un palione di raccolta, Infine, il raccotdo angolare é dotato di col- legamento latezale per il sistema da vuoto (pompa ad acqust, meccanica o ad olio). Le fonti di calure (bagno ad acqua 0 ad olio), devono in ogni miodo assicurare una tempera- tura di almeno 20”C superiore a quella di ebol- lizione. Il riscaldsmento deve essere costante METODI DI PURIFICAZIONE @ 51 Torr 200) 20: 10- 20 60 °c Fig. 3.1-3 - Temperatura di di- stillazione in rapporto alla pres- sione di: a: etere etilico, b: ace- tone, ¢: benzene, d: acqua. per consentire una velocit di distillazione ideale; infatti, una distillazione veloce ne riduce l'efficienza separativa. E opportuno evitare la completa distillazione del liquido dato che il riscaldamento a secco del residuo di natura sconosciuta, ri- masto nel pallone di distillazione, pud risultare inquinante oltre che pericoloso. I raccordo tra pallone e refrigerante viene effettuato, per le operazioni sotto vuoto, con il dispositivo in figura, dove il capi illare, immerso nel liquido da di- stillare, ha la funzione di produrre bollicine atte a rimescolare il liquido ed evi tare fenomeni di surriscaldamento che possono portare ad improwvisi schizzi di liquido. Nelle distillazioni a pressione atmosferica, vengono adoperati raccordi Temperatura i ebollzione alla pressione “P" “OA Fig. 3.1-4 - Nomogramma. ° .. Pressione ‘Temperatura di ebollizione a760tor °c52M Caprroto 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI ig. 3.1-5 ~ Apparato di distillazione. con un unico cono per I'inserimento del termometro, il cui bulbo deve trovarsi leggermente al di sotto della confluenza del vapore nel refrigerante; nel pallone contenente il liquido da distillare, si aggiungono, a freddo, frammenti di por- cellana o di pietra pomice (ebollitori) che, consentendo Ja fuoriuscita di bollicine di aria, favoriscono una uniforme ebollizione del liquido. La scelta del refrigerante, per quanto riguarda la superficie di condensazione, deve essere suggerita dal pe, dal calore di evaporazione del composto da distil, lare € deve, inoltre, tener conto della velocita di distillazione che si intende man- tenere. Nelle operazioni a pressione ridotta, ove si renda necessario cambiare il recipiente di raccolta senza interrompere il voto, si suggerisce Pimpiego del di- spositivo riprodotto in fig. 1.2-8b, “porcellino” o dell"apparecchio di Anschutz Thiele (Fig. 1.2-8b). Operativamente il liquido da distillare viene posto nel pallone di distillazione che va riempito per non pitt di 2/3 della sua eapacita € non deve comunque avere dimensioni eccessive. Si crea quindi il vuoto prima di iniziare jl riscalda. mento che va regolato in maniera da far distillare due gooce al secondo, Seguendo, durante una distillazione, l'andamento della temperatura, indicata dal termometro al contatto dei vapori col bulbo dello stesso, si apprezza, dap- prima, un rapido aumento cui segue un lento incremento e quindi. distillando il liquido puro, costanza della temperatura che corrisponde al valore di punto di cboliizione. Verso la fine della distillazione si possono verificare fenomer di sor Fiscaldamento che causano piccoli incrementi della temperatura indicate, Landamento di una distllacione pud essere registrato su grafico riportando, in ascisse, i volumi delle varie frazioni di distillato raccolte ed, in ontinate, lx teraperatara alla quale esse sono raccolte, Nelle separazioni di due component distllacione frazionata) Vefflusso di distllato si arresta quando & passatonl com ponente pit volatile; si nota quindi incremento della temperatura mentre di- stilla qualche porzione intermedia; quindi la temperatura si stabilizea allorché inizia la distillazione del componente piii altobollente. Ultimata loperazione, si allontana la fonte di calore e si lascia raffreddare prima di eliminare il vuoto, se si opera a pressione ridotta. ; La distillazione a pressione ridotta é una operazione di comune impiego nei laboratori chimici, specie quando si debbano evaporare medie o elevate quan~ METODI DI PURIFICAZIONE. M53 tita di solvente per il recupero delle sostanze disciolte: l'apparecchiatura utiliz~ rata a tale scopo @ chiamata rotavapor (Fig. 1.1-1!). La distillazione di piccole quantita di sostanza (< 1 grammo) si effettua in adeguate apparecchiature (tipo apparecchio a bolle o Kugelrohr). Fra queste, quella pid funzionale, in quanto @ adattabile anche a piecolissimi volumt di li- guido e consente una distillazione veloce e con moderata perdita di sostanza, & Ustituita da tre bolle di vetro unite mediante raccordi, Nella bolla pit interna § pone il liquido da distillare, mentre quella pit esterna pud essere collegata sd.una pompa aspirante, La bolla contenente il liquido da distillare e quella in- fermedia vengono immerse in un bagno d’aria scaldato da un bunsen; la fra- one di testa del distillato si raccoglie nella bolla che emerge dal fornello e che iene raffreddata con un getto d’acqua; si porta quindi al di fuori del bagno d’a- wa la bolla intermedia, dove viene raccolto il corpo del distillato, mentre le code restano nella bolla terminale. Apes wvortel ‘Nel caso di una miscela binaria di liquidi, A e B, completamente miscibili, che nel mescolarsi non provocano variazioni di volume e di temperatura (mi- scela ideale), le interazioni tra molecole diverse (4-B) sono identiche a quelle fra molecole uguali (4-4 0 B-B). Il comportamento di miscele ideali viene de- scritto dalle legei di Dalton e di Raoult. La legge di Dalton stabilisce che la tensione di vapore di una miscela ideale di due liquidi, A e B, & uguale alla somma delle tensioni di vapore parziali dei due componenti: P=Py+ Py [3.1-2) La tensione di vapore parziale di un componente la miscela viene espressa dalla legge di Raoult come prodotto della tensione di vapore del composto puro (P2) per la sua frazione molare x, [x4 = moli di A/ (moli di A + moli di B)] Py = P34 B.1-3] Sostituendo nell’equazione 3.1-2 i valori di P, ¢ Ps ottenuti con Pequazione 3.1.3, si ottiene: P= Po-x4 + PB xp B.1-4] Da cui si deduce che la tensione di vapore di una miscela ideale di due li- quidi dipende dalla loro tensione di vapore e dal loro rapporto molare. Ricorrendo alla legge di Raoult si pud stabilire la composizione della fase li- quida e di quella vapore; infatti, durante la distillazione, la fase liquida si arric- Chisce del componente pit altobollente e, quella vapore, di quello pit basso- ollente. Per una miscela di liquidi A e B (A pit: bassobollente) si ha: Py=P3+xy Pp = PR-Xe P4, Pp + pressioni parziali di A e B; Pi, Pa: tensione di vapore dei liquidi A e B puri; 4% + frazioni molari dei componenti A ¢ B nel liquido; Ja\Je + frazioni molari dei componenti A e B nel vapore. a54m Caprroto 3 - PURIFICAZIONE & SEPARAZIONE DI PRINCIPE ATIVE Ponendo, in una miscela binaria, la concentrazione uguale ad 1, si avri: xytxp=1 quindi p= 1-44 operando il rapporto fra le pressioni parziali dei due componenti € sost. tuendo il valore di 5 Pa Pa, ta Bas) Py Pe ln ¥4 La pressione parziale di un componente pud anche essere espressa dala su frazione molare nel vapore per il valore della pressione totale (P): Py=P+yq Pp = Pye = Pl — ya) B.1-6 Sostituendo la relazione [3.1-6] nella [3.1-5] si ottiene: M4 Pit dove Phang Bain l—y, Pe ln ay Ph La 3.1-7 consente di mettere in relazione il rapporto fra le frazioni molari dei due componenti nella fase vapore ¢ nella fase liquida. Nel caso in cui i due component abbiano la stessa tensione di vapore (@ = 1), le concentrazioni dei componenti A e B si eguaglieranno sia nella fase liquida che in quella vapore, per cui i due liquidi non risultano smistabili. Se, invece, la tensione di vapore del liquido A (si é ammesso A pit bassobollente) ha un valore superiore a quella di B (a > 1), la concentrazione relativa di 4 risulter’ maggiore nella fase va- pore. Da questa osservazione si deduce, in generale, che quanto pid a é diverso da 1 (maggiore di 1 se si pone al numeratore il componenie pid bassobollente), tanto pitt i due liquidi risultano smistabili, Una miscela binaria eterogenea é costituita da due liquii solo parzialmente miscibili 0, nel caso limite, completamente immiscibili. I= tale condizione non vi é alcuna interazione intermolecolare fra molecole diverse, e la tensione di va- pore della miscela risulta uguale alla somma delle tensiowi «i vapore dei singoli componenti allo stato puro: P=Pi+ PZ B18) _ Da questa relazione si pud dedurre che la temperatura di ebollizione (te) della miscela & sempre inferiore a quella del liquido pitt altobollente ed @ indipen- dente dalla composizione molare. Caratteristica che viene sfruttata nella tec- nica della déstillazione im corrente di vapore. Distillazione con rettifica Alla distillazione con rettifica si ricorre per smistare miscele di liquidi la cut differenza nei pe sia inferiore a 80°C. Si utilizzano ‘opportune colonne di ret fica in cui si instaurano numerose serie di processi di evaporazione/condens’- Zione, regolate da equilibri liquido/vapore, con conseguente aumento dell et cienza della separazione. Ogni processo di evaporazione/condensazione contribuisce all’arricchimente del composto pitt volatile (bassobollente) nella fase vapore, mentre il compo nente meno volatile (altobollente) tende ad arricchirsi nel condensato ¢ # tornare nel pallone di distillazione. Si realizza cosi una mutua punificaziane atMeron pt purinicazione @ 55 hguxlo condensato e vapore, che si spostano teeantrocorrente, il primo rifluendo ed il v secondo distillando. 1 Ti processo descritto & rappresentato gra- a ficamente nella fig. 3.1-6 in cui é riprodotta_T.' bs fa variazione del punto di ebollizione della mmiscela di hiquidi 4/8 in funzione della cot posione percentuale, T',€ Ty sono i pe dei Faquudh A € B puri, La tensione di vapore della miscela liquida di composizione m, sottopo- sta a riscaldamento, eguaglia la pressione esterna alla temperatura T,, a cui la compo- qa nm 8B sizione del vapore, in equilibrio con il 100% 100% guido m, sara m’, Ber condensazione del va- pig. 3.1.6 - Diagramma di equi- pore m’ si otterra un liquido di uguale j48;o ‘tiquido-vapore per. liquid composizione che, all‘cbollizione (T,'), Si giseibilic trover’ in equilibrio con il vapore di com- posizione m”. Quest'ulrimo vapore pud essere sottoposto allo stesso processo di condensazione-evapor dione, ottenendosi, per ciascuna di queste operazioni, un arricchimento nel cornpcnente pid volatile. Interpretando attravesso Ia relazione 3.1-7 le varie fasi del proceso di eva- porazione-condensazione, descritto in fig. 3.1-6, si ricaveranno le equivalenze seguenti. Alla temperavsa di chollizione T,., la miscela liquida m (=A,) si trova in equilibrio con un vapore, dalla cus condensazione si ottienc il liquid m1’ (=A) M, xy x, = condensaio ~ — uM + i, Tm xy, I fiquido condensato verra quindi a trovarsi in equilibrio con il vapore: Wi Te vapore: __ Ripetendo “n” volte il processo di evaporazione € completa condensazione, si otterra: : 3.19} | I= ya, 1x4, Br} I proceso & realizzabile con una colonna di rettifica, la cui efficienza @ va- abile in aumero di piatti teorici, assimilabili ad ogni settore di colonna in cui ) # completa un arricchimento del componente piit volatile nella misura indicata | i dalla relazione [3.1-7], 0 nel passaggio m > m’ (Fig. 3.1-6) 0, ancora, rica- vabili dall’esponente n della relazione [3.1-9] che puo essere calcolato, risol- vendo la stessa rispetto ad m, per una data composizione del liquido in caldaia © Per una composizione richiesta del distillato, Quanto maggiore @ il numero di piatti teorici di una colonna, tanto mag- fiore ¢ il numero di processi di equilibrio evaporazione /condensazione che si “inno € tanto maggiore é I'efficienza della separazione. eett (Height Equivalent of Theoretical Plate), altezza equivalente del piatto (Exo € un parametro che mivura 'efficienza di una colonna: il suo valore deve i” fe il pit piccolo possibile; infatti, a parita di lunghezza della colonna, pitt ' Fisulta il valore di HEP, piit alto sara il numero di piatti teorici, apparato di rettifica (Fig, 3.1-7) & composto da un pallone in cui viene po- ~~ee 56 @ CarrroLo 3 - PURIFICAZIONE F SEPARAZIONE DI PRINCIPE ATTIVI sto il liquido da frazionare, dalla colonna di rettifica dal raccordo dove @ inserito il termometro, da ung colonna di condensazione, collegata con una pompa da vuoto nelle distillazioni a pressione ridotta, ¢ da un recipiente di raccolta. Le colonne di rettifica pos- sono essere di varia foggia e la loro efficienza é fun. ione della superficie di contatto liquido/vapore che sono in grado cli consentire. In genere si distinguono in colonne vuote e colonne a riempimento. Nelle prime lo scambio controcorrente avviene solo sulla superficie della colonna, mentre nelle colonne a riem. pimento (anelli o palline) si ha un notevole aumento della superficie di scambio, Particolarmente efficiente risulta la colonna di Vigreax costituita da una canna di verro con delle introflessioni. Durante la distillazione, |a fase vapore, a contatto con la superficie fredda dell, colonna di rettifica, lascia condensare la sua porzione meno volatile che, rifluentio, cede al vapore caldo, che si muove in controcorrente, le sue frazioni pit 7 Apparato di _volatili; analogamente il vapore scambia con il con, distilavione con retufica, densato, cedentio le sve frationi meno volecle, Gli scambi liquido/vapore fanno si che il vapore, sa- tendo lungo la colonna di retifca, si arricchisca sempre pit nel componente pit ita condensatore, Il condensato, che Tifluisce nella colonna di rettfica si arricchisce, invece, del componente meno vo- latile che si ritrovera quasi puro, a fine operazione, particolari mi- i ad una data composizione percentuale, formano miscele azeotropiche, la cui carateristica & di dean inalterate (il rap- Porto fra le frazioni molari dei due componenti nella fee liquida e nella fase va- ore sisults uenale) ad una temperatura pit bassa 0 pity ele wey quella di ebol- izione di ciascun componente, evidenziando, rig ttivamente, un minimo (Fig. 3.1-8a) quando E, A-B < E, A-A/ B-B oun mania (Fig. 3.1-8b) se E, es B A~A 1 B-B. In questo punto (di minino/massimo) Ie miscele, avendo un de- rerminato valore di pe e di composizione, si comportano eae un liquido puro. Nella Tab, 3.1-3 sono riportati comuni esempi di mica azeotropiche con pe minimo (a) e massimo (b), Per scindere una miscela azeotropica si pud ricorrere a metodi alternativ quali: ~ distillazione della miscela binaria in presenza di un te grado di dare origine ad una miscela ternaria in cui i componenti entrano in percentuali diverse: aggiungendo, ad esempio, benzene all’azeotropo eta- nolo-acqua, si pud distillare la miscela azeotropa etanolo-acqua-benzene ed ottenere etanolo assoluto (Tab. 3.1-3); — aggiunta di un composto in grado di reagire con uno solo dei componenti la miscela: CaO @ in grado di sottrarre acqua all'azeotropo etanole aequt, consentendo di ottenere per distillazione etanolo assoluto, 20 componente innee METODI DI PURIFICAZIONE 57 A z B a z By 100% 100% 100% 400% Fig. 3.1-8 - Curve di equilibrio vapore/liquido in funzione di temperatura/ composizione percentuale; ‘T,: temperatura di ebollizione 2: composizione percentuale dell” azeotropo. a [ERE] Miscele azeotropiche a p.e. minimo (a) e massimo (b) e composizioni percentuali — . : s- Miscelaancorropica | Componenti pe fee Meee, Sead acetone-carbonio tetracloruro 768 88,5 11,5 56,1 acetone-metanolo 7 88,0 12,0 55,7 acqua-etere etilico 64,7 12 988 342 acqua-ac. acetico | 1000 118,5 97,0 3,0 76,6 benzene-etanolo | 80,1 78,5 67,6 32,4 67,8 2) cloroformio-etanolo [61.2 78,5 93,0 7,0 59,4 etanolo-acqua 78,5 100,0 95,6 44 78,2 fenolo-acqua 182,0 10,0 9.2 90,8 99,5 Propanolo-acqua 97,2 100,0 718 28,2 88,1 toluene-ac. acetico 110,6118,5 72,0 280 105,4 EtOl-benzene-H,0 78,3 80,6 100,0 | 19,0 74,0 7,0 | 64,9 ) acctone-cloroformio 56,2 61,2 20,0 80,0 64,7 Distillazione in corrente di vapore (c.v.) Questo efficiente metodo di purificazione e separazione permette di distil- are, in condizioni blande, sostanze idroinsolubili che hanno tensione di vapore ion trascurabile alla temperatura di ebollizione delPacqua. La distillazione di iia miscela eterogenea di aqua ¢ di una sostanza con essa immiscibile si rea- | come abbiamo visto nellequazione 3.1-8, quando la somma delle tensioni Parziali (P2) dei due componenti A e B eguaglia la pressione di operazione (P): P= Pj + Pj vig {elatione evidenzia che la temperatura di ebollizione della miscela dovra ulate inferiore a quella del componente pit bassobollente. Infatti la tensione Yapore dellacqua (P3) eguaglierebbe la pressione esterna (P = 760 mm Hg) a 100% y : 4 f : 90°C, ma essendovi anche il contributo non trascurabile del componente B om58 CaprroLo 3 - PURIFIGAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI (Pj), la somma delle tensioni di vapore dei due componenti eguaglier’i la pres- sione esterna ad una temperatura inferiore. Cid consente di distillare in cor- rente di vapore d’acqua, a temperature moderate, sostanze altobollenti (con pe anche molto superiore a 100°C) o termolabili ed immiscibili con acqua (oli em. senziali, aldeidi aromatiche, fenoli, ecc. Le sostanze, oltre ad essere immiscibili con Pacqua, devono avere tensione di vapore significativa a 100°C, in genere > 10 torr ed essere stabili alPazione idrolitica anche a caldo. Una esemplificazione di quanto illustrate pud essere fornita dal bromobenzene (pe 155°C) che, in corrente di vapore d’acqua, di- stilla a 95°C (760 mm Hg), venendosi ad eguagliare, a tale temperatura, la somma della sua tensione di vapore (121 mm Hg) e di quella dell’acqua (639 mm Hg) con la pressione esterna, Le quantita dei due componenti presenti nella fase vapore si troveranno nello stesso rapporto delle loro tensioni di vapore. Ponendo A= acqua e B= composto organico Moliy _ Pg Moli, P@ P10) dallequazione 3.1-10 si pud ricavare la quantita di acqua necessaria all’opera- zione: 8a _ My,P, a Mp, B.-M] & — quantiti dei componenti “A” e “B", pE Pesi molecolari dei componenti “A” ¢ «B%, Pr tensioni di vapore dei componenti “A” ¢ “B", __,_Lapparato per la distillazione in corrente di vapore é simile a quello riprodotto in fg. 51-5 dove, al posto del capillare, viene insenve a, tubo che raggiunge quasi il fondo del pallone caldaia ed attraverso cui & inthe y to il vapore dotto da una caldaia di rame (vapore prodotto allege wit) Ce qua) che possono essere separate per stratifies. J one, estrazione o, nel caso in cui il componente distillato solidifichi, Per filtrazione. Se la stratifi- cazione 0 separazione delle fasi fosse assai lenta, ud essere conveniente aggiungere cloruro sodiea (effetto salatura) per favorimne la separazione. In pratica, la distillazione in cx. pud essere f ugualmente attuata mescolando nel pallone ac- 7 qua in miscela con il composto da distillare ¢ scal- Fig. 3.1-9 - Caldsia per la dando il contenuto del pallone; in questo caso il produzione di vapore d’acqua. vapore viene generato in situ. Utilizaande ona 4ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO E RIPARTIZIONE @ 59 normale apparecchiatura per la distillazione semplice, si condensa il vapore e si raccoglie il distillato, costituito dai due componenti da separare, con le tecni- che gia illustrate sopra. Se la sostanza fosse particolarmente termolabile, la di- stillazione potrebbe essere eseguita a pressione ridotta per operare ad una tem- peratura di circa 40°C. [:2]_Estrazione liquido-liquido e ripartizione Li estrazione & un processo di trasferimento di uno o pitt composti da una fase li- quida, nella quale sono sospesi 0 disciolti, ad una diversa fase liquida inemiscibile com la prima. I solventi_ pid utilizzati sono Pacqua o sue soluzioni (HCI, NaOH, NaHCO, e Na,CO;) e fasi organiche quali etere etilico, diclorometano, clo roformio € acetato di etile, Esso @ realizzabile in quanto il composto si riparti- sce fra le due fasi in un rapporto regolato dalla legge di ripartizione di Nernst: ar B.2-1] K 8 il rapporto fra ie concentrazioni con cui una stessa specie chimica si ri partisce nei due solventi 4 e B ed @ chiamato coefficiente di ripartizione o di distribuzione. I] suo vaiore numerico @ una costante valida: — per un determinate vatore di temperatura; ~ per basse concentrazioni; — se la sostanza disciolta possicde nelle due fasi lo stesso grado di associazione. Per sostanze poco solubili il rapporto fra le concentrazioni del soluto nelle due fasi & pressoché coincidente con quello fra le solubiliti dello stesso in cia- seuna fase. Il processo di ripartizione consente di smistare due sostanze, con coefficienti di ripartizione diversi (K, e K;), che si ripartiscono fra due fasi liquide indi- pendentemente una dall’altra. Se K,/K, > 100 (si divide il coefficient di ri- partizione maggiore per il minore), & possibile separare le due sostanze me- diante una semplice estrazione. Dalla relazione di Nernst si rileva che ’estrazione o trasferimento di un so- luto, da una fase all’altra, é tanto meglio realizzabile quanto pit il coefficiente di ripartizione K si discosta da 1. Se ¢4 é la concentrazione del composto nel li- Guido estraente, per valori di K inferiori a 100, non é sufficiente una sola ope- Tazione di estrazione, per cui l'operazione va ripetuta pid volte con nuovo estraente (estrazioni in discontinuo). _ Quando il coefficiente di ripartizione @ favorevole per il solvente estraente, si pud pervenire al recupero della sostanza quasi completo e pud essere suffi- ciente un numero limitato di estrazioni. In una estrazione discontinua é pid efficiente suddividere la stessa quantita di estraente in pit estrazioni piuttosto che utilizzarla in una sola volta. Se, in- ‘atti, una quantita di sostanza g viene sciolta in un dato volume di solvente v, ed estratta con il liquido estraente ¢, immiscibile con il primo, di essa, dopo la Prima estrazione con un determinato volume di estraente, una parte g, si tra- sferir’ nella fase e, mentre g — gi, non estratto, restera nella fase v,. Il coeffi- Ciente di ripartizione sara espresso da: _NT 60 CaprroLo 3 - PURIFICAZIONE. F SEPARAZIONE DI PRINCIPL ATTIVTE ale da cui gi = —e_. g~ Bile, Bee a+ Ke Dopo la seconda estrazione con uguale volume di estraente ¢ sostanza di nuovo estratta gp sara fornita da: _ Ke 8 [ Ke I BB oy Ke & |v, + Ke Dopo estrazioni con il medesimo volume di estraente ¢ stanza estratta g, sari fornita dalla relazione: ke |" =,|—> 3.2- Bk [= = al B22} Per far si che la quantita di composto estratto gn tita complessiva di estraente, @ indispensable mante La conferma @ fornita dall’esempio riportato: 1 g di sostanza viene sciolto in 50 ml di solvente % ed estratto con 200 ml di solvente e: il coefficiente di ripartizione K @ uguale a 1. Calcolare la quantita di sostai ‘tivamente, con una estrazione, utilizzanco io stesso volume x= Ia porzione di Ja porzione di so- sia grande, fissata una quan- nere ¢ piccolo ed n grande. nza estratta, rispet ) utiligeando Fintero volume die, € con 4 estrazioni, totale di e. ] Ae slicando la relazione 3.2-2, per untunica estrazione si ho: 1-200 200 «1 [westo0 = 1559 = 088 Invece, calcolando ¢ sommando le quantita estratte per ciascuna delle quat- tro estrazioni, si ha: 1-50 50 | |=) 100 7 OE w= ls 41-50. 1:50 7] oat [3 ? _, [tse f - 1 [22] = 1-5] = 02 a [weal p be te[5] = 0256 1-507 1p o1-(| 2] = [2] 2 0125 gol [weal 2 8 4 = 0,062 g -,.f 2] = HT 1504150 Be = 0,5 + :0,25 + 0,125 + 0,062 = 0,938 g In genere si effettuano 3-4 estrazioni, dal momento che di esse porta ad un minimo incremento della quantita di sostanza recuperata, un sensibile aumento nel consumo di solvente e del tempo impiegato- 3, che permette " Con analogo ragionamento si pud oteenere Ia relazione 3.2- di calcolare la quantita di soluto che non viene estratta dal processo estrattivo- In essa, rispetto alla relazione 3.2-2, risultano invertite le posizioni di ¢ ¢ %# mS [; aT B23) un numero maggiore con —:ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO E RIPARTIZIONE @ 61 La fine dell’estrazione di sostanze colorate @ rivelabile dal fatto che l’estraente resta incolore, mentre nei casi pitt frequenti di sostanze incolori, per accertare che l’estrazione sia stata esauriente, & necessario eseguire saggi su piccole por- zioni dell’estratto pid recente (0 della soluzione da esaurire) con semplici tec- niche: TLC, assorbimento UV dell’estratto, valutazione del residuo proveniente dalla evaporazione del solvente di estrazione. [b.z2]_Metodologie estrattive a) Estrazioni in discontinuo, Lesecuzione di estrazioni discontinue liquido/liquido si effettua mediante im uti separatori (Fig, 3.2-1) in cui viene posta la soluzione da estrarre vi si ag- giunge Destraente (~ 1/5 in volume rispetto alla soluzione da estrarre), procu- rando di riempire !imbuto separatore non oltre i 2/3 del suo volume complessivo. Si chiude Pimboccawura con il tappo e, reggendo limbuto sull’imboccatura € sul rubinetto, si sbatte prima con cautela € poi, mantenendo limbuto con lo scarico rivolto verso Valto, si apre cautamente il rubinetto per sfiatare eventuali vapori ed eliminare la sovrapressione. Si richiude il rubinetto, si sbatte energicamente € quindi si sfiata di nuovo. Lo scambio di materia si realizza nella superficie di se- parazione fra le fasi, pertunto lo sbattimento favorisce linstaurarsi dell’equilibrio, in quanto rende pitt estesa ia superficie di contatto fra esse. Dopo lo sbattimento, si lascia 'imbuto a riposo per permettere la separazione delle fasi, si scarica quella inferiore dal rubinetto e la superiore si travasa attraverso Pimboccatura'. La posizione relativa dei solventi @ determinata dalla densita. Prendendo la densita dell’acqua pura (d = 1g/ml) come riferimento (occorre ricordare che la densita di soluzioni acquose contenenti sali, acidi, basi o sostanze organiche idrofile pud aumentare notevolmente), tutti i solventi organici con d < 1g/ml, come Petere etilico (#9 = 0,713 g/ml), si stratificano sopra la fase acquosa, men- tre quelli con d > 1g/ml, come il diclorometano (d’} = 1,3255), si raccolgono nello strato inferiore. La scelta de! solvente estraente (immisci- bile con la fase da estrarre) deve essere ef- fettuata in base a: ~ favorevole coefficiente di ripartizione; — possibilita di estrazione selettiva di un composto rispetto ad altri presenti nella soluzione da estrarre; ~ basso pe, al fine di facilitare il recupero della sostanza per evaporazione del sol- vente; ~ bassa tossicita; ~ elevata differenza nella densita, per avere rapida separazione delle fasi ed evitare la Fig. 3.2-1 - Estrazione con imbuto formazione di emulsioni. separatore. 1 " ‘ di liquide “estracnte” con un Al termine dellestrazione é consighabile lavare le porziont riunite dt piccolo volume di iquido puro costivuente la fase “da estrarre", onde rimuovere eracce dt fase ongine eventualmente presente.Mm 62 @ CaPrvoLo 3 - PURIFICAZIONE. F. SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI Un inconveniente comune, durante le estrazioni liquido-liquido, & Ia for mazione di emulsioni, specie in presenza di sostanze tensioattive 0 di soluzioni alcaline, che non consentono una pronta separazione delle due fasi. Alcuni accorgimenti per rompere le emulsioni ed ottenere la stratificazione delle fasi sono: — agitazione dell’emulsione o rotazione a vortice dell’imbuto separatore; — centrifugazione; ~ aggiunta di sali di sodio (NaCl): effetto salatura per diminuire le possibilita di associazione estraente — acqua; ~ aggiunta di piccoli volumi di etanolo. In caso di sospensioni di materiale solido, pit o meno fine, si pud filtrare su carta e poi riversare le due fasi nell’imbuto separatore. b) Estrazione in continuo. Per valori bassi della costante di Nernst (K = 1,5), non risultando conve- niente l’operazione in discontinuo mediante imbuto separatore, si opera in con- tinuo utilizzando, per fasi liquide, particolari estrattori detti perforatori. Essi consentono di impiegare per ’estrazione una modesta quantita di solvente che viene costantemente evaporato da un pallone-caldaia, condensato da un re gerante, fatto rifluire attraverso la soluzione da estrarre . guindi, rinviato nel pallone di evaporazione, mediante un troppopieno diversamente posizionato a seconda che l'estraente sia pitt leggero o pitt pesante della soluzione da estrarre. Infatti, per liquidi estraenti pit: densi del liquido da estrarre, !’estraente, con- densato, cadendo dall’alto sul liquido da estrarre, lo attravers: dall’alto al basso, dove si raccoglie collegandosi con un troppopieno o mediante un rubinetto come in fig. 3.2-2b, che garantisce I’efflusso continuo dell’estraente nel pallone-caldaia. Nel caso di un estraente pit leggero del liquido da estrarre, esso, dopo condensazione, gocciola in un imbuto, collegato sul fondo con un setto poroso (Fig. 3.2-2a), da cui fuoriesce ed attra- versa (essendo immiscibile e pitt leggero) il li- quido da estrarre dal basso. $i stratifica nella parte superiore ed, attraverso un troppopieno, confluisce nel pallone-caldaia. Il processo di estrazione @ comunque lento ¢ deve essere condotto per molte ore o addi- rittura giorni. _Per estrazioni continue solido/liquido si ri- corre agli estrattori di Soxhlet (Fig. 3.2-20), in cui la sostanza solida viene costantemente irrorata dal solvente evaporato da un pallone € condensato da un refrigerante. Questo svol- ge la sua azione estruente a contatto con ilso- ido da estrarre e, quando ha raggiunto il go- mito superiore del sifone, posto all’esterno del Fig. 32-2 -Estrattorisa. liquide / Y@R0 di estrazione, viene sifonato dal vano di liquido con estraente pitt leggero, ¢Sttazione al pallone di evaporazione per ¢s b. liquido/liquido con estraente _S¢te riciclato, I materiale da estrarre deve p* pitt pesante; c. solido/liquido. sedere peso specifico superiore a quello del li- a b c I j eeESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO E RIPARTIZIONE @ 63 guido. L’estrattore di Thielepape (Fig. 3.2-2b) 8 utilizzabile sia come perforatore, per estraenti pitt pesanti, sia per estrazioni da solidi. (3.22) Essiccamento E un’operazione volta ad eliminare solventi dalla superficie di solidi e, pit comunemente, acqua da solidi, da soluzioni di solventi organici o da gas. Un essiccante efficace deve possedere buona intensita ed elevata capacita di essiccamento. solidi per essere essiccati vengono mantenuti a temperatura ambiente in es- sicatori (Fig. 1.2-9) in presenza di comuni essiccanti. Un essiccamento pitt efficace e completo, oltre che con la pistol per essicca- mento, si pud ottenere con stufe elettriche termoregolabili e capaci di mantenere 4 un vuoto abbastanza elevato. Molte sostanze, che non hanno particolare ten- denza a trattenere acqua, possono essere essiccate semplicemente all’aria od in stufa a moderata temperatura L liquidi puri e le soluzioni organiche provenienti da processi di estrazione da soluzioni acquose, anche se immiscibili con Pacqua, ne contengono sempre Piccole quantita (Vetere etilico scioglie 11,5% di acqua). Per eliminare tali quantita di scqua dalle soluzioni organiche, queste ultime vengono seccate per diretto contatto con un agente essiccante inorganico so- lido, che deve risultare inerte rispectu alla sostanza disciolta ed al solvente in cui deve, peraltro, essere insolubile. L’essiccante, aggiunto in opportuna quan- titd alla soluzione da essiccare, vi si mantiene per qualche tempo, tenendo il re- cipiente protetto dall’umidita con una trappola ed agitando, occasionalmente, allontanandolo quindi per filtrazione o decantazione, prima di procedere alla distillazione del solvente. 1 gas vengono essiccati a seconda della loro natura: ~ 42010, acido cloridrico, anidride solforosa, cloro, idrogeno, ossigeno: possono essere fatti gorgogliare attraverso un cilindro di lavaggio (drechsel) (Fig. 1.2-3c) con- tenente acido solforico concentrato, come essiccante; ammoniaca convogliandola attraverso una colonna di essiccamento riempita con essiccanti solidi (cloruro di calcio, soda). . Gli essiccanti pit comunemente impiegati per le soluzioni organiche, con le loro Principali caratteristiche, sono raccolti in Tabella 3.2-1. Baw Separazione di miscele La separazione di una miscela di composti organici pud essere realizzata, a Seconda della complessita, sfruttando, dapprima, il carattere chimico dei com. Ponenti mediante estrazioni selettive, se la miscela é in soluzione organica, 0 solubilizzazioni selettive per una miscela di solidi. Con tale procedura si otten- £00 frazioni in cui sono presenti componenti aventi lo stesso carattere chi- Mico, per la cui ulteriore separazione si ricorre a metodi in grado di differen- f3t¢ i componenti sulla base del diverso carattere fisico, quali cristallizzazioni Zonate o sublimazioni per i solidi, distillazione frazionata per i liquidi ed an- “Me cromatogratia o estrazioni selettive con appropriato solvente. coEE OO 64 @ Caprroto 3 - PuRIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI ESBESZ Agenti essiccanti per soluzioni Essiccante ....| Capacita* | Intensita® |-Velocita® |... Uso/Note 7 Magnesio +++ ay +++ | Generale/Debole acido di solfato Lewis, non si pud utilizzare per composti sensibili agli acidi. Lo ione Mg’* pue provocare isomerizzazioni, Sodio solfato | 444 + ++ | Generale / Meno efficiente | del magnesio solfato. Calcio +44 + + Si usa solo con idrocarburi e cloruro alogenuri. Pud formare com- plessi con composti che con- tengono No O. Assorbe an- che metanolo ed etanolo. Calcio solfato | + | +++ | +44 | Generale Potassio ++ ++ | ++ | Reagisce con composti acidi; carbonato utilizzato per ammine, basi, esteri e chetoni. Potassio +++ — | Solo per composti basici idrossido | (ammin Setacci | 44 +++ +++ | Generale / Devono essere molecolari attivati di fresco, in genere | utilizzati in soluzioni gia sec- | cate con altri agenti (conser- vazione). * Quantita di acqua assorbita per unita di peso. & Fa niferimento alla quantita di acqua che rimane in soluzione in equilibrio con Pessiceante. *Velocita con cui Pessiccante agisce. - 1 componenti a carattere basico insolubili in acqua vengono estratti (da solu- zione organica) o solubilizzati (da miscela solida) con soluzioni diluite di acido cloridrico, operazione mediante la quale essi vengono trasformati in cloridrati generalmente idrosolubili. Per alcalinizzazione della choewne at. quosa acida, si liberano i Componenti a carattere basico che vengono raccolti per filtrazione, se solidi, o estratti con etere etilico o diclorometano, se oleosi. ~ Leomponenti a carattere acido insotubil in acqua vengono estratti o solubiliz~ zati con soluzioni diluite di idrossido di sodio, operazione mediante la quale éssi vengono trasformati in sali sodici generalmente idrosolubily sali sodiciae ESTRAZIONE LIQUIDO-LIQUIDO E RIPARTIZIONE 65 La frazione ottenuta contiene sia gli acidi forti (tipo acido carbossilico) che gli acidi deboli (tipo fenolico), che possono essere ancora selezionati, essendo i primi solubili in soluzione 5% di sodio bicarbonato, da cui possono essere riprecipitati per acidificazione. ; an I composti a carattere anfotero vengono estratti o solubilizzati indifferente- mente, come acidi o come basi, nella prima frazione (quella a carattere acido © quella a carattere basico) che viene estratta o solubilizzata. T composti a carattere anfotero vengono riprecipitati al valore di pH corti spondente al punto isoelettrico, cid che si pud ottenere semplicemente aci dificando con acido acetico la loro soluzione acquosa basica. - I composti a carattere neutro restano indisciolti o inestratti nella soluzione or- nica iniziale e, in quest’ultimo caso, si ottengono come residuo della di- stillazione del solvente. ; La componente aldeidica pud essere separata dagli altri componenti neutri ' idroinsolubili sfruttando la proprieta di formare con soluzione di bisolfito sodico il sale di Bertagnini (§ 5.2), idrosolubile e stabile in ambiente basico, da cui, per acidificazione, ia si riottiene come tale e la si estrae con solvente organico. 1 Se una frazione fosse costituita da pit di un componente si ricorre, come prima anticipato, ai metodi che ne consentano lo smistamento sulla base del di- verso carattere fisico. Il metodo di separazione di una miscela di componenti in soluzione orga- nica, appena illustrato, & esemplificato nello Schema 3.2-1. Dalla soluzione eterea viene estratta con HC] 2N la componente basica che passa nella fase acquosa sotto forma di cloridrato. Da questa, per alcalinizza~ zione con NaOH 2N, si libera la base libera (dimetilanilina) che viene recupe- rata per estrazione con solvente organico. Dalla soluzione eterea, da cui @ stata eliminata la componente basica, si estraggono gli acidi, con NaOH 2N, che passano, pertanto, nella fase acquosa basica'come sali sodici. Per acidificazione della fase acquosa si liberano gli acidi, che vengono recu- perati per filtrazione od estrazione, a seconda che siano in forma solida o liquida. i Nel caso di miscele di acidi forti e deboli, si possono differenziare i composti con soluzione 5% di NaHCO; (cfr. solubilita: § 5.1.4). Nella soluzione eterea origi- nale, estratte le componenti basica ed acida, restano i composti neutri. Nel caso riportato nello schema, i componenti neutri (alogenoaromatico e composto car- bonilico) possono essere differenziati sfruttando la reattivita chimica (cfr. § 5.2.2). { componenti a basso peso molecolare idrosolubili possono comunque, indipen- dentemente dalle caratteristiche chimiche, essere efficacemente smistati sfrut- tando la diversa volatilita, come viene esemplificato nello Schema 3.2-2. t Tcomponenti con un solo gruppo funzionale distillano nella corrente di vapor eta. mentre quelli con due o pit: gruppi funzionali (Vacido Jattico per la sua élevata temperatura di ebollizione non distilla in corrente di vapor d’acqua) sono eno volatl. La miscela di piperiina ed n-propanolo ed acido acetico pud infatti es- Sete smistata fssando la base piperidina per salifcazione con acido solforico o fo- fees quindi, distillando acido acetico ed n-propanolo in corrente di vapore. Per rewtalizazione del residvo non distilato si liber Pammina, che viene recupe- at eet distillazione in corrente di vapore o per estrazione. I componenti distil- Possono essere separati fissando I’acido con una base e distillando l’alcool. "wee66 ‘APITOLO 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPL ATTIVI Miscela | insolE,0 | wee {Tt nol}-[ anno | i I 1 Nao “+ NaOH | I ‘imetianiina | srH,0] [Swexo | I i | =Aes0.] [T NeHs0, | B-nafiole srH,0 }L{Sreno ‘ac. benzoico q I + HCI} [clorobenzene| + WaliGO5 4:0 fanisalceide uo ‘Sol HO i pas + HCl : T I | prattoe | [pe benzoco] | Schema 3,2-1 - Separazione di miscela di dimetilanilina - ac. benzoico- B-naftolo - anisaldeide - clorobenzene in soluzione cterea. | miscen | | invateyo | cae Reskiuo _T osiavo Disuate e K NaOH con ‘ac. acetlco Schema 3.2-2 - Separazione miscela di ac. lattico (pe > 300) - ac. acetico (pe 118)- piperidina (pe 106) ~ n-propanolo (pe 97) in soluzione acquosa.pO i TECNICHE CROMATOGRAFICHE TRADIZIONALL @ 67 Bil Tecniche cromatografiche tradizionali Sono metodi chimico-fisici di separazione basati sulla diferente distribu- sione dei componenti una miscela fra due fasi immiscbili, una fissa ed una me- pile. La prima @ costituita da un solido o da un liquido, opportunamente sup- weato (fase stazionaria), mentre la seconda & costituita da un fluido, liquido 0 fas, che scorre sulla prima (fase mobile) Inizialmente la cromatografia fu usata per la separazione di componenti ve- gecli; ateualmente,differenziata in numerosi metodi operativi,&efficacemente Frpiegata per fini analitici o preparativi in diversi settori ‘AlPinizio degli anni ‘40 cominciarono i primi studi teorici sulla cromato- grafia che portarono allo sviluppo dis 1944 cromatografia su carta; 1950 cromatografia in fase liquida; 1951 gas cromatografia. La diversificazione dei metodi e lelaborazione della teoria della separazione cromatografica da parte di Van Deemter ne misero in luce le notevoli poten- zialita sia per fini preparativi che analitici. Teeniche cromatografiche, quali HPLC (bigh pressure liquid chromatography) © GC (gas chromatography), hanno raggiunto efficienze molto elevate; il loro uti- lizzo ® ormai consolidato in tutti i campi dell’analisi chimico-farmaceutica. Per tale motivo esse vengono trattate in dettaglio in 7.1 € 7.2. Tl processo di separazione cromatografica si basa sui fenomeni fisici ¢ chimico- fisici dell’ adsorbimento e della ripartizione, oltre che su interazioni di tipo elet- trostatico (cromatografia di scambio ionico) © sulla differenziazione delle molecole di soluto in base alle loro dimensioni (cromatografia di esclusione dimensionale). Processi cromatografici I diversi processi cromatografici possono essere eseguiti in colonna (crvma- tografia su colonna), contenente l'opportuna fase stazionaria, 0 su lastra di vetro, di alluminio o di materiale plastico che costituisce il supporto della fase stazio- aria stessa (strato sottile). ‘Cromatografaiquida Sol ladsorbimento {Fase stazionaria ‘romatografe iquda Law diriparizione ‘Gromatografa, vaso liquid (L.) (Fase mobite Gromatografia “ Seon 65) Cromatogatiag 53088 Soido di adsorbimento Fase sazionara ‘romatograiagassosa Schema 3.3-1 Ee Sipaicione68 @ CaprroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE. DI PRINCIPI ATIVE Baal Cromatografia di adsorbimento Nella cromatografia di adsorbimento, definita cromatografia solido-liquido, il meccanismo di separazione si attua tramite P'adsorbimento selettivo dei compo. nenti di una miscela, disciolta nella fase mobile liquida, sui centri atti Present sulla superficie della fase stazionaria solida, finemente suddivisa. Ladsorbimentg & un fenomeno superficiale che si differenzia dall’assorbimento consistente in una penetrazione che interessa l'intera massa dell’assorbente. Il processo di adsorbimento @ attribuibile a interazioni che si vengono a sta- bilire fra gli atomi che si trovano sulla superficie delle particelle dell’adsorbente € le molecole organiche disciolte nella fase mobile. Esaminando il camy forze che circonda ciascun atomo componente I’edificio cristallino dell’adsor- bente, si pud comprendere che il campo di potenziale elettrostatico associato agli atomi che si trovano alPinterno del cristallo ha una componente nulla, la qualcosa, invece, non si verifica per quegli atomi che si trovano sulla superficie del granulo dell’adsorbente. Essi, infatti, non possedendo un intorno elettro- staticamente uniforme, creano all’esterno un campo di forze residuo capace di sbilanciare le cariche elettriche delle molecole che vengono a gravitare sul campo, respingendo quelle di segno uguale ed attraendo quelle di segno oppo- sto, pitt o meno efficacemente, (adsorbimento) in dipendenza del valore del mo- mento dipolare di cui esse sono dotate. Sulle molecole prive di momento di- polare (i! baricentro delle cariche positive coincide con quello delle cariche negative), in prossimita del campo superficiale delladsorbente ed in virta delle forze che esso esercita sulle cariche molecolari di segno opposto, si verra a creare un momento dipolare indotto il cui valore é legato alle dimensioni della mole- cola, oltre che alle caratteristiche dell’adsorbente. La molecola pud cosi essere adsorbita, pur se meno saldamente rispetto a quelle dotate di un momento di- polare proprio. I composti adsorbiti vengono quindi sclezionati per azione di una fase mobile liquida, la cui polarita dovrebbe essere inferiore a quella di cia- scun componente la miscela perché, se cid non fosse, si sostitairebbe in ciascun centro di adsorbimento al componente di minor polariti che verrebbe eluito con il fronte dell'eluente. Normalmente l’eluente sostituisce, per azione di massa, il composto adsorbito sul centro attivo, in misura direttamente dipen- dente dal grado di adsorbimento del componente ¢ dalla polarita dell’eluente. I diversi componenti la miscela, sottoposti ad una serie continua di processi di adsorbimento — deadsorbimento, migrano con velocita relative diverse in base all’affinita per Ja fase stazionaria. Dal momento che i materiali adsorbenti comunemente usati per la fase sta- zionaria, allumina e silice, sono polari, i composti con gruppi funzionali polari sono maggiormente trattenuti perché adsorbiti con maggiore forza, mentre i componenti meno polari si spostano, da un centro attivo all’altro, pitt veloce- mente di quelli dotati di maggiore polarita e vengono eluiti per primi. L’elemento determinante in un processo cromatografico di adsorbimento @ il potere eluente della fase mobile. ; . Una fase stazionaria efficiente (Tab. 3.3-1) deve avere le seguenti caratteri- stiche: = capacita di adsorbimento selettivo per numerose sostanze; — attivita adsorbente riproducibile; . = mancanza di fenomeni di adsorbimento irreversibile;Fn “TECNICHE CROMATOGRAFICHE TRADIZIONALI #69 _. jnerzia chimica nei confronti sia dei soluti che dei solventi utilizzati come fase mobile; _ elevata superficie adsorbente; ; 7 farticelle di granulometria uniforme per permettere un efficace impaccar mento. 11 potere adsorbente delPallumina & elevato e dipende dalla quantita di ac aqua libera adsorbita alla fase stazionaria; sso pud essere variato e graduato Pet STgiunta di acqua. Operativamente si pone in beuta la fase stazionaria & 2 ave see ageiunge la necessaria quantita di acqua in base alla scala di Brockmann (Tabella 3.3-2). [ESISEA Fasi stazionarie classificate in base al potere adsorbente Potere adsorbente T Fore __Medio Debole “Alumina Tdrossido di calcio Celhulosa Carbone attivo [Tarossido di magnesio | Taleo Florisil | Fosfato di calcio ‘Amido Gal di silice ~[ Carbonate di calcio Saccarosio Si tappa la beuta e si scuot fino alPottenimento di una massa asciutta, Occorre fare attenzione perché il processo di disattivazione 2 forte- mente esotermico (sviluppo di calore). Tn commercio sono disponibili tre forme di allumina: acida, basica € neutra, adatte alla separazione di composti con differenti caratteristiche di acidita ¢ ba~ sicita. Lallumina possiede anche il vantaggio di avere un'elevata superficie attiva (90 m’/g). I due principali svantaggi dell’allumina sono: ~ adsorbimento irreversibile di composti fortemente polari; ~ possibile catalisi di reazioni indesiderate di decomposizione, condensazione (aldeidi e chetoni) ¢ idrolisi (esteri). Il gel di silice pud essere utilizzato per separare numerose classi di compo- sti organi , Gli altri adsorbenti elencati, specie HSER scala di Brockmann: quelli con potere adsorbente medio-de- =< = : bole, sono consigliabili per la separa- Attivita _ | _% di acqua (in peso) | zione di composti naturali sensibili ad I 0 interazioni acido-base. 7 7 Le unita di misura utilizzate per 1 esprimere la granulometria delle parti- a 57 celle di fase stazionaria sono: IV \ 8-11 — lineari: esprimono le dimensioni del Vv aap diametro delle particelle (es. 0.2-2 mm).NN 70 ™ CaPrroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPE ATTIVI — intervalli di mesh (di derivazione anglosassone), esprimenti il numero di ma- alie per pollice lineare (2.54 cm) di un setaccio. Quindi, minore é il numero di mesh, maggiore & la grandezza dei pori (es. 70-230 mesh: i granuli attra- versano completamente un setaccio da 70 mesh, mentre sono totalmente trattenuti da un setaccio da 230 mesh). La fase mobile pud essere rappresentata atid Serie eluotropa da un’singolo solvente o da una miscela Secondo Trappe di due, o pitt solventi, miscibili ed in pro- Solventi porzioni variabili (e/nizione a gradiente) e {ordine crescente dipotere eluente)| deve avere le seguenti caratteristiche: - presentare inerzia chimica nei con- Esano h Cicloesano fronti della fase stazionaria: . Carbonio tetracloruro — Mon avere potere solvente nei con- Toluene fronti della fase stazionaria, Diclorometano = permettere la separazione dei com- | ponenti la misceia loroform | p 5 . ae = avere basso punto di eholhvione per einna essere tacilinente alontanata € per- Tetraidrofurano mettere if recupero dei sclutis Acetato di etile — avere bassa tossicitd. Acetone ‘ * Tl potere eluente di ua solvente é pro- Metiletilchetone porzionale alla sua costante dielettrica, %-Butanolo | ma varia anche a seconda dell'adsor- | Propanolo bente utilizzato e della remperatura. Etanolo Esistono varie classiticazioni dei sol- é Acqua venti in base al potere eluente (serie Acido acetico eluotrope). In tabella 3.3-3 € riportata quella elaborata da Trappe. 3.3.1.1 Cromatografia su colonna La separazione cromatografica dei componenti di miscele, in scala prepara- tiva, puo essere realizzata su colonna e consente di isolare quantita che vaviano da pochi mg a centinaia di mg per ciascun componente. La cromatografia su colonna é condizionata da alcune variabili: 'adsorbente, fa miscela eluente, il diametro della colonna, la quantiti di campione da ana. lizzare, la temperatura, ecc.. La stramentazione pitt semplice consiete in una co. Jonna di vetro, con diametro interno da 0,5 cm fino a 5-10 cm, aperta alle. stremita superiore e munita, in quella inferiore, di un rubinetto, La colonna viene riempita con l'opportuno adsorbente, scelto, unitamente alla fase mobile, mediante rapide prove preliminari eseguite su lastra suppor- tante il materiale adsorbente da saggiare. Tali prove consistono nel deporre ona Piccola quantita della soluzione da cromatografare in una serie di macchie ou iascuna delle quali si fa quindi scorrere, per mezzo di un capillare (Fig. 3.3- 1), ognuno degli eluenti o miscele di eluenti da saggiare. Dallo sviluppo ti- portato nella figura 3.3-1b si pud dedurre che la migliore risoluzione, otteni- bile con Padsorbente scelto, é fornita dall’eluente 2. Per la definizione del diametro della colonna esistono apposite tabelle che Permettono, seelto l'adsorbente ¢ fissato il rapporto miscela adsorbente (in ge-‘TECNICHE CROMATOGRAFICHE TRADIZIONALI 71 ccapillare a) ») Fig. 3.3-1 - Saggi preliminari per la scelta di adsorbente ed eluente. nere 1/20-50), di stabilire, per una data quantita di miscela da separare, il dia metro della colonna. Stabilito il diametro, risulta indirettamente fissata anche Valtezza che Padsorbente occupa nella colonna, tenendo presente che il rap- porto ottimale altezza/diametro & di circa 8:1. Operativamente il riempimento della colonna (impaccamento) pud essere ef- fettuato mediante due mctodiche. Impaccamento “a secco”: si versa nella colonna dapprima l’adsorbente ¢ guindi Peluente. Impaccamento “a umido”: si realizza versando Padsorbente, a piccole porzioni, all'interno della colonna gia riempita con Popportuna quantita di eluente o pre~ parando una sospensione adsorbente-eluente che viene versata nella colonna. a entrambi i casi occorre lasciar sedimentare in modo uniforme il materiale solido. Alla fine dell’operazione si deve ottenere uno strato di sedimento uniforme e compatto (Fig, 3.3-2), privo di zone disomogenee come crepe, bolle daria o di cluente in fase gassosa che possono costituire vie preferenziali al passaggio della fase mobile e abbassano lefficienza della separazione Cromatografica. Il volume di solvente trattenuto dal- Tadsorbente rappresenta la eapacita della colonna e cor- Tsponde ad un intero percorso del fronte del solvente 'ungo il tratto di colonna occupato dall’adsorbente. _La miscela da cromatografare viene sciolta nella minima quantiti di eluente e la soluzione @ intro- spony, mediante una pipetta, nella colonna pred He ian fuccessivamente per aggiunta, alla sommita vita colonna, della fase mobile (percolazione per gra- Zion iitettua leluizione che consente la separa- a ia componenti (sviluppo). . nent 1 £28¢ di sviluppo di una miscela, i compo- rene STan© lungo la colonna in maniera diffe- dalla leee G0" ,velocita. inversamente dipendente mente r9, tdsorbibilita. I componenti pit efficace- compon lsorbiti migrano pit lentamente, mentre i nel qeucntd meno adsorbiti entrano pit’ facilmente \ base dei tet cluente scendendo verso zone pid quilibsig colonna, In ogni istante si instaura un Continyo,t? tdsorbimento e deadsorbimento che 3.3-2 - Cromatografia ‘ente si rinnova. su colonna, Fase mobile Cotone 0 sabbia Absorbente —-Cotone - sabia setto porosoés 72 @ CaPrroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI Si realizza cosi quella migrazione differenziata che porta alla separazione de} singoli component, i quali si localizzeranno in zone diverse della colonna e, quindi, saranno via via eluiti e frazionati, in recipienti di raccolta, in volumi uguali alla capacita della colonna o a parti di essa. L’andamento della separazione pud essere valutato mediante analisi su strato sottile (TLC, vedi oltre) delle singole frazioni raccolte. Oltre alla tecnica a colonna aperta, occorre ricordare anche la cromatogra- fia flash che impiega colonne corte, impaccate con particelle di diametro com- preso tra 40 e 63 jim, collegate all’estremiti superiore ad un apposito sistema in grado di applicare una modesta pressione (mediante flusso di aria o di azoto), La fase mobile deve infatti fluire attraverso la colonna ad una velocita di citca 5 cm/min, La colonna pud essere impaccata con omogeneiti con le metodologie gia de- scritte per la cromatografia su colonna aperta. Il principale vantaggio di questo tipo di separazione rappresentato dalla rapidita del processo ¢ dal buon po- tere risolvente. Anche la separazione ottenuta mediante cromatografia flash pud essere controllata mediante analisi TLC delle singole frazioni raccolte. 3.3.1.2 Cromatografia su strato sottile (TLC: thin layer chromatography) Si esegue su lastrine di vetro, alluminio o materiale plastico su cui & stato steso un uniforme e sottile strato di adsorbente tniscelato ad un opportuno le- gante, quale gesso, per conferire una adatta compattezza al materiale. Questa tecnica, caratterizzata da rapida esecuzione, elevata sensibilita e buon potere ri- solutivo, consente Pimpiego di minime quantita di sostanza (1-20 pg = 1-20 10° 9). Essa rappresenta una tecnica prevalentemente analitica, utile per I'- dentificazione di composti, per saggi di purezza, per controlli qualitativi, per seguire ’andamento di una reazione (scomparsa delle macchie dei reagenti ¢ comparsa di quelle dei prodotti) e, come anticipato, sia per stabilire in via pre- liminare le condizioni pit efficaci per Pesecuzione di una separazione cromato- grafica su colonna che per analizzare le frazioni di eluato raccolte durante !'e- secuzione di una cromatografia. Con un appropriato spessore (2 mm) dello strato adsorbente depositato sulla lastra, questa tecnica pud anche essere utilizzata pet la separazione, con fini preparativi, di miscele di sostanze (amminoacidi, anti- biotici, oli essenziali, steroidi ecc.). Le soluzioni da analizzare vengono applicate su lastre disponibili in com- mercio in varie dimensioni (5 x 10, 5 X 20, 20 X 20 cm), con uno strato di adsorbente da 0,25 mm di spessore, mediante sottili capillari, in punti distant! 1,5-2 cm dai bordi inferiore ¢ laterali. Si deve depositare Ia soluzione sv st” perfici le pid piccole possibili (diametro 2-3 mm). La lastra cromatografica vien quindi inserita in una camera, detta camera di sviluppo, la cui atmosfera & ot saturata con i vapori della fase mobile impiegata. Per favorire la saturazione, © Pareti interne della camera di sviluppo devono essere rivestite con strisce © carta da filtro imbevute della fase mobile che si trova sul fondo della camer ha un’altezza di circa 1 cm, Lo sviluppo della lastra & dovuto al passaggio 4 ; fase mobile che sale lungo la lastra per capillarita (cromatografia ascendem'’’ In questo modo V’eluente trascina con sé i component la miscela che migram® con velocita differente in funzione della diversa affinit’ per la fase mobile ¢ P* la fase stazionaria da cui dipende la loro separazione. : Peer aPam ‘TECNICHE CROMATOGRAFICHE TRADIZIONALI @ 73 Rivelazione dei componenti la miscela Icomponenti la miscela possono essere localizzati sulla lastra sviluppata me- diante varie tecniche: — radiazione ultravioletta (lampada di Wood); questa tecnica & utilizzabile per sostanze fluorescenti o che posseggono gruppi funzionali che assorbono la radiazione UV, quali nuclei aromatici e sistemi coniugati. Se nell’adsorbente steso sulla lastra é stato disperso un indicatore di fluorescenza (A: 254 nm), Je zone in cui si sono localizzati i componenti la miscela appaiono scure per- ché la radiazione UV non raggiunge l’indicatore ¢ non da fluorescenza. Lo sfondo appare chiaro. — esposizione a vapori di iodio che si sviluppano da cristalli di iodio posti sul fondo di un recipiente chiuso: lo iodio forma complessi bruni in corrispon- denza delle zone dove é presente la sostanza. Tali complessi si decompon- gono all’aria e, lentamente, le macchie scompaiono. ~ impiego di reattivi cromogenici che vengono spruzzati sulla lastra, mediante opportuni nebulizzatori. Venendo a contatto con le sostanze cromatografate, danno luogo a composti colorati grazie a reazioni selettive con determinati gruppi funzionali (es: ninidrina per gli amminoacidi, reattivo di Dragendorff per alcuni alcaloidi), F, evidente che questa tecnica si pud utilizzare quando si conosca gid la natura delle sostanze da separare;, = carbonizzazione della sostanza organica per riscaldamento della lastra a 300- 400°C, per trattamento con soluzioni di H,SO, concentrato o per ossida- zione con HNO, 0 bicromato di potassio (K,Cr,0;). Determinazione del fattore di ritenzione (0 rapporto frontale): Ry Il rapporto tra la distanza percorsa dall’analita e quella percorsa dal solvente (fronte del solvente), definito fattore di ritenzione Rg & una grandezza caratte stica del composto e dipende sia dalle condizioni operative che dalle caratteri- stiche della fase stazionaria e dell’eluente. Prendendo lesempio di fig. 3.3-3 dove A e B sono sostanze incognite (X) € C& uno standard I’ Ry@ dato dal rapporto: Il suo valore varia da 0 (la sostanza non migra) a 1 (la sostanza non viene trattenuta e migra insieme al solvente). _Occorre precisare che, pur entro li- miiti ristretti, i valori di Ry di una so- Stanza possono subire delle variazioni ©, quindi, risultano difficilmente ri- Producibili; pertanto si ricorre sovente al confronto del valore con quello di Una sostanza standard (R,) che, deposta Sulla stessa lastra cromatografica, ga- Tantisce una efficace comparazione. R, (rapporto standard) rappresenta il Tapporto fra il percorso dello standard © quello della sostanza in esame. Punto di semina Fig. 3.3-3 - TLC con parametri essenziali,a a, 74m Caprroio 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI E utile ricordare che sostanze diverse possono, in determinate condizion; sperimentali, avere valori di Ryidentici o molto simili. In questi casi, per con. fermare l'identificazione di una sostanza, & consigliabile eseguire diverse TLC variando la fase mobile e/o la fase stazionaria. Una tecnica evoluta, "HPTLC é illustrata nel § 7.3.3. ° [3.3.2] Cromatografia di ripartizione Beeeei Cromatografia di ripartizione Diversamente dalla cromatografia di adsorbimento, in cui una delle due fasi & solida (adsorbente), in questa si attua una ripartizione della sostanza tra un li- quido, adsorbito su un supporto solido inerte a formare un film liquido, e la fase mobile, costituita da liquido (ripartizione liquido-liquido) 0 gas Criparti- zione liquido-gas). La cromatografia di ripartizione & quindi di tipo liquido-liquido ed attual- mente impiega fasi stazionarie in cui un liquido é chimicamente legato, e non semplicemente adsorbito, ad un supporto solido. Questo processo cromatugrafico é assimilabile ad una ripartizione in molti stadi in cui le due fasi liquide si muovono in controcorrente, il che vuol signi- ficare che un estratto della sostanza viene in contatto con una soluzione della sostanza nell’altro solvente, mentre una soluzione gia parzialmente estratta si viene a trovare a contatto con estraente fresco. Il processo enunciato pud es- sere riprodotto con una batteria di imbuti separatori (Schema 3.3-2): nel primo di essi si mette la soluzione contenente 1 g della sostanza da ripartire sciolta in un certo volume del solvente A (pitt pesante ed assimilabile alla fase fissa, cioé al solvente adsorbito su un supporto solido) ¢ si sbatte con un egual volume di solvente B (immiscibile con il primo, di esso pit leggero ed assimilabile alla fse mobile), fino ad equilibrazione della fase. Per K = 1, (coefficiente di riparti- Zione della sostanza nei solventi prescelti c4/ep = 1), si avri un’eguale riparti- zione del composto fra i due liquidi. La fase superiore (solvente mobile B) viene guindi trasferita in un nuovo imbuto separatore in cui si trova un ugual volume di solvente A fresco (fase fissa); la fase inferiore (A), rimasta nell'imbuto ini- ale, viene messa a contatto, nello stesso, con ugual volume di solvente B fre- sco, Si cos) attuato il primo trasferimento. Dopo aver ripartito e stabilito le quilibrio fra le due fasi nei due imbuti, si opera un nuovo trasferimento € cos! via. Nello schema 3.3-2 si pud osservare che, dopo solo 6 trasferimenti, gid 180% della sostanza si & localizzata negli imbuti centrali. Per un valore del coefficiente di ripartizione diverso da uno, la sostanza si verrebbe a trovare in percentuale rilevante negli estrattori di testa 0 di coda “ pitt precisamente, per K = ¢/ey = 3 la maggior parte di sostanza si trove ne recipienti di coda, in quanto la sostanza, risultando pit solubile nella be mo A; viene da questa trattenuta. Per un valore di K = 0,3 la sostanza,risultundo pitt solubile nella fase mobile B, sara da questa trascinata e verra a trovarsi recipienti di testa. ta complessita di una tale serie di estrazioni é evidente ed & stata supers sostituendo la fase fissa (solvente A) e gli estrattori con una colonna contents un materiale poroso su cui @ stato fatto adsorbire il solvente A. La fase mol eee“TECNICHE CROMATOGRAFICHE TRADIZIONALI @ 75 +A (0.250) “A (0.125 [0-125 TN [5250] [O25] “A 187] [0.062] fo1e7| 0.06: 1 vs O18) [o187) [f 0.187] [o.062) A O17] [o125) [os loter} (0125) [0.031 NT ON GUN [0125] [0187] [015] [o.0sT ‘oie7| (0-125) [0.031] “A (O156] [OTS] [O07] [O.0I5] lots) [ose loozs) [001 SU B+ (pOIS] [O07e) [OIs6) [156] [O07—) [oor (oo7s| [o078) [0156] [0356 loozs) [oor “A 0.015 0.093 0.234 0.312 0.234 0.093 __0.015 Schema 3.3-2 10% 80% 10% Golvente B) viene fatta scorrere nella colonna e la miscela di sostanze, intro- dota in testa alla colonna, verri a ripartirsi tra le due fasi fino a raggiungere Yequilibrio, In tal modo una sostanza verri trascinata dalla fase mobile tanto pit rapidamente quanto maggiore sari a solubilita in essa (o quanto minore la solubilit’ nella fase stazionaria), per cui la migrazione dei vari componenti sari Tegolata dal loro coefficiente di ripartizione fra le due fasi. Nella cromatografia di ripartizione, la fase stazionaria viene classificata come: ~ fase normale (0 diretta) se il liquido legato sul solido di supporto é polare (ac- ‘qua su cellulosa); in questo caso si impiega una fase mobile non polare (etere, diclorometano); ~ fase inversa se il iquido legato sul solido di supporto @ apolare, costituito ad €sempio da catene alifatiche di lunghezza variabile: ottile (C8) 0 ottadecile (C18); la fase mobile @ polare (acqua 0 alcool). Nelle due tecniche, i composti presenti nella miscela da separare si differen- Zano, a seconda delle differenti polarita, nell’ordine evidenciato dalla fig. 3.3-4. ‘Se76m Caprrovo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIP! ATTIVI | Eluente polare | . fw on 0 A00 | stazionaria agg 68 oe Jou 1s 'CHy Sve [Ot Aaa ooo iO,“ apoure | tou composto 1oH DS clans OH OOO 000 oa jOH composto joa © OO mediamente low OOo aaa tou OOO “apoare Fig.3.3-4 - Ilustrazione grafica del meccanismo di separazione nella cromatografia a fase normale (a) ed a fase inversa (b). Il supporto della fase stazionaria liquida non deve risultare adsorbente nei Tiguardi della sostanza in esame onde realizzare separazioni nette, evitando la formazione di code. I materiali di supporto solitamente utilizzati nella cromatografia a fase nor- male sono: © gel di silice, preparato mediante precipitazione dal silicato sodico con HCI 10 € mescolato con il 53% di acqua; * amido, che pud adsorbire acqua dal 35 al 100% del suo peso; non @ del tutto inerte poiché pud dare origine a fenomeni di adsorbimento, © cellulosa, adoperata per la cromatografia su carta. nella cromatografia a fase inversa sono: slice 0 cellulosa, i cui gruppi ossidrilici superficiali vengono derivatizzati con diclorometilsilano o con altri reagenti costituenti un residuo non polare (ottadecil, ottil, feniletil, cianopropil, ecc,). In questo caso si parla di “fase ‘cgata” che possiede il vantaggio di avere elevata resistenza mepoanica, T solventi pitt utilizzati sono: per la cromatografia a fase diretta: miscele butanolo-cloroformio, buta- nolo-benzene, acetato di etile-esano; per la cromatografia a fase inversa: metanolo, acetonitrile, vetraidrofu- Fano, acqua, in miscela, molto pit diffusa la tecnica a fase inversa che consente Putilizz0 di tuna varieta di fasi stazionarie molto ampia e fasi mobili costituite da solventi con bassa tassicita (es. acqua), Le tecniche di cromatografia di ripartizione su colonna e su strato sottile S < NO; < $O%7< citrato _ Lo scambio fra la resina ¢ la soluzione, contenente la specie ionica da scam- biare, awviene attraverso tre fasi: - diffusione dello ione dalla soluzione alla resina ed al suo interno; ~ Teazione di scambio fra lo ione (Na* 0 Cl) ed il gtuppo polare della resina R-SO;/H* + Na* == R—SO>INe* + HY scambio cationico R—N*(R'),/OH~ + Clr R-N® (R'),/CD + OH™ scambio anionico [736i3.3-4] Resine scambiatrici lizzabile; forti possiedono diverse Resina scambiatrice | Gruppo funzionale Acido forte — (CH,),SO; H* Acido moderato - PO;H* Acido debole — CH,COO- Na* Base forte ~ CH,NR}CI- Base debole ~ CH,CH,NH(CH,CH,)} Cri TEGNICHE CROMATOGRAFICHE TRADIZIONALI M79) - diffusione dello ione scambiato dalPinterno della resina alla soluzione eluente. Al fine di ottenere una buona separazione cromatografica, occorre scegliere Jo scambiatore ionico in funzione di: | Scarica del solute: soluto anionico = > scambiatore anionico soluto cationico => scambiatore cationico i - peso molecolare del soluto: i pori delle resine devono permettere il libero mo- vimento del soluto; dimensione e carica del soluto: \e molecole organiche di grandi dimensioni pos- sono dare fenomeni di adsorbimento irreversibile. ‘ Per cercare di minimizzare i problemi relativi agli ultimi due punti, si pos- sono utilizzare cellulose, destrani poliacrilammidi- . Operativamente la tecnica di eluizione pitt utilizzata segue le modalita della cromatografia di adsorbimento. In commercio sono disponibili colonne preim- paceate che devono essere “condizionate” con la fase mobile scelta, sia per far awenire il proceso «i rigonfiamento sia per attivare i siti di scambio. La mi- scela delle specie ioniche v ionizzabili viene caricata in colonna; quindi si pro- cede alleluizione con citente di forza ionica maggiore. Gli ioni formano bende a causa della loro differente velocita di migrazione i legata alla loro minore © maggiore affinita per i siti di scambio. Si pud eseguire anche: un’eluizione a gradiente variando la forza ionica 0 il pH dell’eluente. In quest’ultimo caso é fondamentale la scelta del pH della fase mobile; in genere si utilizzano miscele tampone a pH < pKa della base o pH > pKa dellacido di una o due unita. Cromatografia di esclusione dimensionale/gel permeazione Questa tecnica, originariamente utilizzata per la separazione di materiali bio- logici, permette la separazione dei componenti di un campione in base alla loro differente dimensione molecolare. I riempimenti delle colonne di esclusione si comportano come setacci (Fig. 3.3-6), consentendo alle molecole di soluto una maggiore o minore velocita di cluizione a seconda della loro dimensione e della loro forma. Non si hanno uindi interazioni chimiche fra soluto, fase stazionaria e fase mobile, : In base al tipo di eluente utilizzato questa tecnica viene differenziata in: ~ eromatografia di permeazione su gel (Gel Permeation Chromatography: GPC) in cui sono utilizzati eluenti di tipo organico; ~ eromatografia di esclusione dimensionale (Sive Exclusion Chromatography: SEC) in cui sono utilizzati eluenti acquosi. Le fasi stazionarie sono costituite da gel, idrofili o lipofili, rigidi ed insolu- bill In genere sono polimeri con dimensioni controllate dei por, | gel idrofili pits utilizzati sono a base di destrano o di agar, polisaccaride éstratto da alghe, Le fasi mobili utilizzate sono acquose (soluzioni tampone). Si Possono ottenere gel lipofii per acilazione o alchilazione dei gruppi idrossilici ci gel a base di destrano o per polimerizzazione di uniti stirene-divinilbenzene. “a ee80m CaPrroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPL ATTIVI Questi ultimi sono i pit diffusi e possono essere usati con eluenti or- ganici come tetraidrofurano, to- Tuene, diclorometano o dimetilfor- mammide, mentre solventi polari come acqua o metanolo possono danneggiarne l'impaccamento. Operativamente, occorre “con- dizionare” la colonna con Poppor- tuno solvente in modo da rigonfiare Fig. 3.3-6 - Cromatografia di esclusione di-_j pori, Si carica poi il campione e si mensionale: a) colonna e particolare del i T'eluizione con la fase mobile, materiale di riempimento; b) frazionamento la cui sola funzione 2 di trascinare sulla base delle dimensioni molecolari. le molecole di soluto. Le molecole di dimensioni mag- giori (alto peso molecolare) sono escluse dai pori, attraversano velocemente la colonna e vengono eluite per prime; invece le molecole di dimensioni minori (basso peso molecolare) penetrano nei pori, li attraversano compiendo un per- corso pitt tortuoso ¢ quindi vengono eluite successivamente. Occorre ricordare che, oltre alla dimensione, anche la forma, globulare o li- neare, pud influenzare la separazione; inoltre possono verificarsi tenomeni di interazione soluto-fase stazionaria che possono portare a volumi di ritenzione maggiori. Per tarare le colonne, si esegue una separazione di polimeri standard a peso molecolare noto, misurando i tempi o i volumi di eluizione. Questi si riportano in un grafico in funzione del logaritmo dei pesi molecolari. Mentre il primo picco @ dato dalle molecole di dimensioni maggiori, l'ultimo @ dato dalle mo- lecole pit piccole. Le applicazioni pit! comuni della cromatografia di esclusione sono in campo biologico (separazione di enzimi, proteine da matrici complesse) e lo studio ed il controllo dei polimeri. [3.4] _Estrazione in fase solida (SPE) 1 problemi associati con la estrazione in fase liquida possono essere mini- mizzati usando la estrazione in fase solida (Solid Phase Extraction, SPE), una tecnica che si sta imponendo come tecnica estrattiva alternativa in quanto con- sente di raggiungere, mediante poche e semplici operazioni, tre scopi essenciali nelle tecniche di purificazione: - separazione dell’analita di interesse dai componenti della matrice interferenti; ~ concentrazione dell’analita in piccoli volumi di solvente; ~ otenimento di soluzioni adatte all’analisi cromatogratica (che normalmente segue il processo estrattivo). In base al meccanismo di separazione si distinguono due tipi di SPE: - SPE ritentiva: prevede il passaggio della soluzione, contenente analita ¢ ma- ce, attraverso una fase stazionaria solida su cui P’analita viene trattenuto mentre gli interferenti sono lavati via; in un secondo momento, |’analita viene TeeTe 'STRAZIONE IN FASE soLIDA (SPE) 81 recuperato mediante eluizione con piccoli volumi di un solvente diverso da elo usato nel caricamento (che solitamente & gia il solvente pit: adeguato Sia successiva separazione cromatografica). SPE nom ritentiva: in questo caso sulla fase stazionaria solida vengono trat- uti tutti i componenti interferenti, mentre l'analita viene eluito insieme al teivente, La SPE non ritentiva consente di ottenere solo la purificazione del La concentrazione non @ molto spinta perché sono necessari pitt fivagei per recuperare completamente l'analita, Inltre il cambio di solvente monet puo fare, perché si usa per I'eluizione lo stesso solvente del caricamento. Per le sue migliori caratteristiche la SPE ritentiva é quella pitt urilizzata, ed in questo testo, si fardriferimento esclusivamente ad essa. [aad] Evoluzione della SPE Ball Evoluzio! a prima versione di SPE consisteva semplicemente nel riempire una pipetta i Pasteur con gel di silice trattenuto con lana di vetro. Il campione era posto o Gina a questa mini-colonna. I componenti indesiderati erano eluiti con un i interesse erano poi eluiti con un solvente di solvente apolare ed i composti di data polarita. Tali colonnine davano pero risultati poco riproducibili e, per Slcuni eampioni estremamente diluiti (ad es. urine), il campione stesso poteva aiterare le proprieti della colonna. L’affermarsi delle fasi chimicamente legate per HPLC ha fornito nuovo materiale per questo particolare tipo di estrazione. Proltre & stata perfezionata la tecnica mettendo a punto contenitori pitt adeguati per una filtrazione rapida e riproducibile. ‘Attualmente i utilizzano piccole colonnine, simili a siringhe, di teflon o po- lipropilene; la fase stazionaria @ trattenuta nelle colonnine tra due frit o setti porosi (Fig. 34-1). Talvolta le cartucce sono protette con un adatto rivesti- mento che le rende resistenti ad alte pressioni. ‘Tutte le operazioni di condizionamento, caricamento e lavaggio, sia in SPE ritentiva che in SPE non ritentiva, sono solitamente eseguite in depressione, cioé aspirando i solventi a valle delle cartucce. La strumentazione richiesta (di cui si riporta uno schema semplificato in Fig. 34-2) @ molto semplice ¢ si com- pone generalmente d campione. = una camera 0 “vasca” (in vetro ¢ simile a quelle usate per TLC); - un coperchio che chiude ermeticamente la camera e fa da supporto per le cartucce; ~ un supporto per le provette di raccolta all'interno della camera; ~ un sistema che crea il vuoto all’interno della vasca; ~ un sistema di valvole per la regolazione della pressione; ~ Un vacuometro per leggere la pressione; tra il sistema che fa il vuoto € la vasca € OP- corpo della cartuccia Portuno inserire una trappola che trattiene somata, volt eventualmente “risuc- ssatbenoio chiate” dalla pompa da vuoto. setti porosi it solvente Sono disponibili anche piattaforme per adsorbente estrazione dotate di 96 pozzetti che permet no di purificare numerosi campioni con- temporaneamente. Fig. 3.4-1 - Cartuccia per SPE.82 @ CarrroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE, DI PRINCIPI ATTIVI Sistemi pitt evoluti di SPE prevedono Vinserimento delle cartucce (modificate opportunamente) on-line con le colonne per cromatografia liquida. Un sistema di valvole, regolato tramite elaboratore, con- seite di eseguire la purificazione e la suc~ cessiva separazione cromatografica senza interruzione. Uno dei maggiori vantaggi dell’automazione @ il risparmio di tempo, Ja migliorata precisione ed accuratezza, la minore esposizione dell’operatore a cam- pioni e/o reagenti pericolosi. D'altra parte, tra gli svantagg) delle tecniche au- tomatizzate dobbiamo ricordare la possi- bilita di intodurre errori sistematici ed il costo di tali appareechiatare. Fig. 3.4-2 - Apparecchiatura per SPE. (3.4.2) Modalita di esecuzione La SPE si esegue in cinque fasi (schematizzate in Fig. 3.4-3) La cartuccia contenente la fase solida viene “condizionata” con un solvente opportuno (i pori della fase solida si devono riempire di solvente). . Tl campione (matrice + analita), sciolto in un solvente che abbia basso po- tere eluente nei confronti dell’analita, viene caricato sulla cartuccia; analita e matrice vengono bloccati sulla fase solida. Il solvente viene aspirato (alcuni component della matrice possono essere allontanati gia in questa fase). 4, Si eseguono dei lavaggi con solventi (organici o acquosi aventi un oppor- tuno valore di pH) che hanno lo scopo di allontanare tutti i component in- desiderati della matrice. 5. Con piccoli volumi di un solvente diverso dai precedenti (avente alto potere lita dalla fase solida e lo si recupera, Il sol- eluente per l’analita) si stacca l’anal Vente deve essere possibilmente adatto all’analisi successiva (cromatografica © spettrofotometrica). Fase 1 Fase 2 Faso3 Fase4 = FasoS Etuizione Condizionamento Caricamento Elminazione _Lavaggio ‘con solvente anaita+matrice sohvente 1 eliminazione analta con con solvente 2 solvente 3 7 OT - Fig. 3.4-3 - Fasi di esecuzi diuna SPE ritentivas \ es5 UU ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE) © 83 padl Materiali adsorbenti e meccanismi di ritenzione La “fase solida” utilizzata in SPI ituita da piccole particelle, presso- ché sferiche, sulla cui superficie attiva I’analita viene trattenuto in seguito a fe- ar rent di adsorbimento. In genere la superficie ativa @ rugosa ¢ presenta nu- netosi pori (micropori, del diametro di 1-2 nm, o mesopori, del diametro di 3150 nm). In dipendenza dalla forma e grandezza dei port e dalla loro tortuo- sith varia Parea superficiale. La scelta appropriata del materiale adsorbente @ critica per ottenere un ef- ficignte recupero dell’analita, Un buon adsorbente deve essere in grado di ad- sorbire rapidamente, ed in maniera riproducibile, quantita definite dei compo- enti di interesse presenti nel campione. Inoltre deve: — avere grande superficie di contatto; ~ eeere esente da impurezze rilasciabili al momento dell’eluizione; | etre stabile nei corfronti dei componenti del campione ¢ del solvente di eluizione. In realta un adsorbente universale non esiste, ¢ quindi & sempre attuale la ricerca di nuove fasi solide per particolari applicazioni. “Attualmente gli adsorbenti usati in SPE sono essenzialmente di due ti ‘Adsorbenti su base silicea (gel di silice): sono costituiti da particelle di si- lice aventi un diainetvs di 40-60 jum, a superficie rugosa e irregolare con pori 4i 65-75A e con un'area superficiale di 300-500 m’/g. Sono i materiali pit tra- dizionali, sono poco costosi e possono essere facilmente funzionalizzati legando ai gruppi ossidrilici della silice gruppi polari, apolari o ionici (silice in fase le- gata). Le fasi legate sono stabili a pH compresi tra 1.0 ¢ 8.5. “Adsorbenti su base polimerica: il supporto @ un polimero stirene-divinil- benzene altamente reticolato, con un’area superficiale di 700-1000 m’/g e pori di 80-100A. Rispetto ai precedenti hanno una sfericita pit regolare e presen- tano una superfice pitt omogenea. Normalmente danno interazioni idrofobiche (egami nn tra i numerosi anelli benzenici e parti aromatiche dell’analita), ma possono essere anche funzionalizzati sugli anelli benzenici con gruppi po- lari ionici. Avendo un’area superficial maggiore, consentono dicaricare quan- titi maggiori di campione (praticamente hanno una capaciti doppia). Gli ad~ sorbenti polimerici possono essere utilizzati in un vasto intervallo di pH (da 2.0 2.12.0). In genere si hanno prestazioni migliori con fasi solide di tipo polime- Tico rispetto a quelle di tipo siliceo. In sostanza, gli adsorbenti usati in SPE sono del tutto simili alle fasi stazio~ natie usate in HPLC (§ 7.3.1.3). I meccanismi di ritenzione dell’analita sulla fase solida vengono classificati come in HPLC. Pertanto si possono avere ~ Ritensione in fase diretta: interazione tra analita polare ¢ fase stazionaria polare, Si usano: gel di silice; silice Iegata con alchili a basso n° di atomi di C portanti gruppi ossidrilici, amminici, ciano, ecc; polimeri funzionalizzati con gruppi fenolici o amminici. L'adsorbimento avviene tramite: * interazioni dipolo-dipolo (8-15 kJ/mole); * legami idrogeno (20-50 kJ/mole).iJ 84 @ CaprroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPL ATTIVI ~ Ritenzione in fase inversa: interazione tra analita apolare ¢ fase stazionaria apolare. Si usano: silice funzionalizzata con alchili ad alto n° di atomi di C, resine polimeriche. L'adsorbimento avviene tramite: © forze di Van der Waals (2-10 kJ/mole). Ritenzione in fase ionica: interazione tra analita ionico (basico 0 acido in forma salificata) € fase stazionaria ionica, Si usano silice resine polimeri- che funzionalizzate con: © Gruppi acidi deprotonati (~COO”, —SO}) salificati con cationi metal lici (Na*) — scambatori cationici deboli e forti, rispettivamente. _ © Gruppi basici_ protonati_ (~NH}, —NHR3}) salificati_ con anioni (Cl")sscambiatori anionici deboli e forti, rispettivamente. L'adsorbimento avviene tramite: @ interazioni elettrostatiche (attrazione tra cariche opposte, 100-400 kJ/mole). Liadsorbimento avviene secondo i principi di equilibrio acido-base. I pH della matrice deve essere aggiustato in considerazione del pKa dell'adsor- bente ¢ dell’analita in modo che abbiano cariche opposte. Com si pad ve- dere dalle forze di legame, Vinterazione ionica é la pitt forte. 1 * cinetiche dei processi di scambio ionico, perd, sono piit lente di quelle cass meceani- smi di interazione polare o non polare, per cui sia la fase di caricanicnto che quella di eluizione devono essere lente per consentire un compieto 2-1sorbi- mento, prima, € deadsorbimento, dopo, dell’analita. Inoltre, la ritenzione ionica dell’analita é influenzata dalla teres ‘oraca della matrice in quanto gli altri ioni presenti competono con |'analits di mteresse mediante meccanismi di scambio ionico. ' = Ritensione in fase mista: fase stazionaria € analita con grupyi polari, apo- lari o ionici contemporaneamente. Tutti gli adsorbenti esibiscono, accanto a meccanisini di ritenzione pri- mari, anche meccanismi secondari. Ad es. la silice, legata covalentemente a gtuppi non polari, trattiene in primo luogo gli analiti per mezzo di intera- zioni idrofobiche, ma esibisce anche un meccanismo di ritenzione secondario a causa sia dello scheletro siliceo sia della presenza di gruppi silanolici super- ficiali non reagiti. Il Ficonoscimento molecolare dovuto a questo doppio meccanismo pud e- sere vantaggioso per l'analisi, Come logica evoluzione delle osservazioni sulle interazioni secondarie, sono stati prodotti adsorbenti in miscela basati su mec- canismi di ritenzione multipla. Cosi ad es., sono stati prodotti adsorbenti con- tenenti sia catene alchiliche idrofobiche sia gruppi ionici. Vi sono altri modi per ottenere la ritenzione mulupla, Diversi tipi di ad- sorbente (ad es. adsorbenti idrofobici ed ionici) possono essere mescolati omo- geneamente oppure strauficati gli uni sugli altri in una medesima colonna. Ancora, si possono mettere in serie colonnine di estrazione: in questo modo st Taggiunge una selettivita di separazione molto elevata.| | ESTRAZIONE IN FASE SOLIDA (SPE) 85, [5aA|_altri adsorbenti Il problema che si pone nello sviluppo di nuovi adsorbenti sempre pit se- lettivi é di minimizzare Pestrazione di prodotti interferenti, presenti nella ma- trice, che talvolta hanno concentrazioni molto pit grandi rispetto all’analita di interesse presente in tracce. Sono stati pertanto studiati nuovi materiali adsor- benti aventi affinita specifica per determinati analiti. Tra questi ricordiamo: adsorbenti per immunoaffinita (anticorpi); $ adsorbenti ad impriting molecolare (Molecular Imprinting Molecules, MIP). Adsorbenti per immunoaffinita (anticorpi) ‘Anticorpi specifici verso un determinato farmaco-antigene vengono immo- bilizzati mediante legame covalente sul supporto (ad es. silice). L’uso di tali i munoadsorbenti garantisce un efficiente recupero degli analiti di interesse da matrici complesse quali i campioni biologici. Gli anticorpi possono legare anche analiti strutturalmente vicini a quello di interesse. Cid pud essere vantagernso in SPE. Infatti, pud succedere che un an- ticorpo, disegnato per wn claco as lita, possa estrarre dalla matrice sostanze stret- tamente correlate quali, ad esenypio, i metaboliti di quell’analita. Adsorbenti polimerici ud “imprinting” molecolare (MIP) Il metodo consiste nel costraire un polimero attorno alla molecola dell’ana- lita; questa viene poi stazeata dal polimero lasciando una caviti che é “impronta” delPanalita stesso (Fig. 3.4-4). I polimero ottenuto, quando viene utilizzato come adsorbente, @ in grado di legare l’analita in modo altamente specifico, gra- zie al riconoscimento della forma e alla formazione di legami di idrogeno, in- terazioni elettrostatiche ed interazioni idrofobiche. Questi polimeri sono pit Smo templato monomen ju > + 0A. ‘eross-linker CD > CD te 3.4-4 - Esempio di sintesi di fase stazionaria ad “imprinting molecolare”. L’analita {templato) viene legato a “pezzi” di polimero (monomeri) i quali vengono ‘uccessivamente “cross-linkati” per dare una struttura complessa tridimensionale. Da te Vanalita viene poi staccato in modo da ottenere una caviti che & impronta ‘IPanalita stesso.86 @ CAPrroLo 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI facilmente ottenibili ¢ meno costosi degli immunoadsorbenti precedentemente descritti; sono stabili sia in solventi acquosi che organici ¢ consentono di trat- tare grandi volumi di campione. L’elevata affinita, tuttavia, pud causare pro- blemi di eluizione ed incompleto recupero. B45] Scelta delle cartucce e ottimizzazione del metodo Oltre che per la fase stazionaria contenuta, le cartucce si differenziano sulla base di alcuni parametri, la cui conoscenza é importante per poter effettuare la scelta del materiale pitt adeguato. Tra questi si ricordano: ~ volume della cartuccia: corrisponde alla quantita totale di solvente che il tubo della cartuccia pud contenere (ogni lavaggio potra essere effertuato con un volume di solvente massimo corrispondente al volume della cartuccia); — massa del letto: & la quantita (in peso) di materiale adsorbente contenuta nel tubo. Varia da 50 mg a 10 g. La massa determina la capacit3 di carico volume del letto e si sceglie in funzione della quantita (in peso} di analita che deve essere caricato; — volume del letto: 2 il volume di solvente necessario a riempire gli spazi inter- stiziali (tra una particella ¢ Paltra) + il volume dei pori. Esso corrisponde a: © circa 120 microlitri ogni 100 mg di massa del letto nei materiali a base silicea; circa 250 microlitri ogni 100 mg di massa del letto nei materiali polime- rici — capacitz: & la quantita di analita che pud essere trattenuta. Corrisponde a: «circa § mg ogni 100 mg di massa nei materiali a base silicea (9%); @ circa 10 mg ogni 100 mg di massa nei materiali a base polimerica (10%); ~ volume minimo per Veluizione: ° il volume minimo di solvente richiesto per eluire Panalita. Corrisponde circa a 2-4 volumi letto; ~ volume di lavaggio: & il volume di solvente richiesto per eliminare la ma- trice. Corrisponde a circa 1 ml ogni 100 mg di massa del letto. Quale esemplificazione: supponendo di dover purificare un campione con- tenente 10 mg di analita: — se si usa una cartuccia a base silicea: esi deve scegliere una cartuccia avente massa = 200 mg; il volume letto sara circa 250 microlitri (volume minimo per il condizio- namento); il volume di lavaggio sara di almeno 1 ml; il volume minimo di eluizione sara 0,5-1 ml (500-1000 microlitri); si usa una cartuccia a base polimerica: si deve scegliere una cartuccia avente massa = 100 mg; il volume letto sara circa 240 microlitri (volume minimo per il condizio- namento); * il volume di lavaggio sara di almeno 2 ml * il volume minimo di eluizione sara 0,5-1 ml (500-1000 microlitri); Inoltre @ sempre necessario conoscere preliminarmente: * caratteristiche chimico-fisiche dell’analita (peso molecolare, solubilit3...); ' eogee j |ESTRAZIONE IN FASE SOLIDS (SPE) @ 87 natura dei gruppi funzionali (polarita, acidita..); natura della matrice (viscositi, composizione chimica); forze di interazione analita-adsorbente; ° forze di interazione analita-matrice (es. pioni biologici); , © proprieta eluente dei solventi (v. Tab. 73.2), Si deve inoltre ricordare che: legame farmaco-proteine in cam- = il solvente per il caricamento deve: © sciogliere tutto il campione; non eluire l’analita; - il solvente per il lavaggio deve: e non eluire l’analita; eluire gli interferenti; e creare l’ambiente adatto alla successiva eluizione dell’analita; - il solvente eluente deve: ¢ avere forte potere solvente per Panalita; © essere possibilmente volatile (nel caso si dovesse concentrare ulterior- mente); © essere adatto all’analisi successiva. La forza eluente «li un solvente, talora, dipende non solo dalla sua polarita, ma anche da altri fictori quali, ad esempio, la “bagnabilita”. Con questo si in- tende la capacita dle! solvente di mescolarsi e rimuovere dalla fase stazionaria trace di altri solvent: precedentemente adsorbiti, Ad esempio: se una cartuc- cia stata caricata con una soluzione acquosa contenente un analita apolare, la forza eluente del benzene nei suoi confronti pud risultare minore di quella del- Vetere di petrolio; questo ¢ dovuto al fatto che il benzene si mescola male con Pacqua e, quindi, non riesce a raggiungere tutte le molecole di analita. La conoscenza di tutti questi parametri ¢ la scelta corretta delle cartucce sono essenziali al fine di ottenere un buon recupero dell'analita. Il recupero dell’analita da un cartuccia di estrazione viene calcolato misu- rando la quantita di analita eluita dalPadsorbente rispetto a quella originaria- mente caricata. Quindi, il recupero totale (RT) dipende sia dalla efficienza del- Padsorbimento (EA) che dalla efficienza del deadsorbimento (ED): RT =EAXED Per ottimizzare Vintero proceso di recupero si pud intervenire sui pitt si- gnificativi fattori che influenzano sia la ritenzione che ’eluizione di un analita, in particolare: ~ tempi di caricamento e di eluizione: dipendono dalle cinetiche di forma- zione o rottura dei legami tra fase stazionaria e analita, in genere legami de- boli si formano e si rompono pit rapidamente e, quindi, richiedono tempi di eluizione minori, In ogni caso la eluizione deve sempre essere “a goccia”; = pH dei solventi: ha una grande influenza nel caso di eluizione di analitiacidi © basici, Regolando in modo opportuno il pH dei solventi (sia quelli usati per condizionare che quelli per lavare ed eluire)rispetto al pKa degli analiti §i pud aumentare il recupero o anche migliorare la selertivita del metodo.OO . 88 ™ Carrroio 3 - PURIFICAZIONE E SEPARAZIONE DI PRINCIPE ATTIVI — volume del campione: esiste un certo volume di campione (breakthrough vo. lume) al di sopra del quale non possibile ottenere il 100% di recupero (pur introducendo lo stesso numero di molecole di analita nella cartuccia). Tale volume massimo dipende sia dalla natura dell’adsorbente che da quella de- gli analiti e viene determinato sperimentalmente aumentando via via il vo. Tume caricato e misurando il recupero corrispondente. Bae Tecniche di microestrazione __ Vengono brevemente descritte alcune tecniche di estrazione che si basano, in generale, sugli stessi principi della SPE, ma si differenziano dalla tecnica clas- sica in quanto utilizzano materiali e supporti diversi ¢ sono destinate ad usi par- ticolari. Micro-Estrazione su Fibra Rivestita (MEFR) II metodo micro-estrattivo su fibra rivestita (MEER) si awale di una fibra di silice fusa rivestita con adsorbenti apolari, quali il polidimetilsilossano (PDMS), © adsorbenti polari, quali il Carbowax. La lunghezza della fibra & in genere di 1 cm, sebbene ce ne possano essere di diversa lunghezza. Oltre alle fibre stan- dard in silice fusa vi sono alcune fibre rivestite di plastica. La plastica rende la fibra silicea pid flessibile, ed il rivestimento di adsorbente si lega meglio alla plastica rispetto alla silice muda. La MEER & compatibile con i pit: comuni sistemi cromatografici e pud es- sere facilmente automatizzata. I sistemi di campionatura per MEER sono facil- mente trasportabili, cosicch¢ il loro utilizzo @ semplice anche al di fuori del la- boratorio. La SPE convenzionale riesce ad estrarre ca. il 90% di un analita dal cam- pione, ma solo I'l 0 2% viene solitamente iniettato nello strumento per l’ana- lisi, La MEER @ un sistema di estrazione non esaustivo che estrae solo il $-20% delPanalita, ma questa quantita viene tutta inserita nello strumento per l’analisi. Inoltre la MEFR rende possibile indagini particolari, quali lestrazione da campioni molto piccoli, ¢ risulta particolarmente indicata per indagini nei si- stemi viventi, in quanto non disturba i delicari equilibri biochimici. Estrazione con agitatore rivestito (ECAR) E un recente metodo di estrazione, teoricamente simile alla MEFR, che pre- senta il vantaggio di poter arricchire i campioni biologici acquosi di composti organici presenti in tracce. Tl metodo consiste nell’immergere nel campione, da cui si vuole estrarre un analita di interesse, una barretta magnetica di acciaio, incapsulata in una guaina di vetro, a sua volta ricoperta con PDMS quale adsorbente. La lunghezza della barretta pud variare da 10 a 40 mm, mentre il PDMS forma uno strato che va- ria da 0.3 ad 1.0 mm. II campione viene sottoposto ad agitazione magnetica per il tempo necessario a raggiungere un equilibrio tra analita adsorbito analita in soluzione. Questo tempo dipende dalla velocita di agitazione e dal volume del campione. Al termine, la barretta viene rimossa dal campione ed é termi- camente deadsorbita se l'analita deve essere introdotto in un gascromatograto: in alternativa, se si vuole procedere con analisi HPLC, é conveniente usare il“TEST DI AUTOVALUTAZIONE M89 deadsorbimento mediante ultrasuoni, ponendo la barretta in acetonitrile 0 ace- tonitrile/acqua. Dopo il deadsorbimento la barretta pud essere riutilizzata. Fino ad oggi ladsorbente pitt usato per la ECAR é il PDMS, sebbene siano stati provati anche adsorbenti pitt polari. II meccanismo primario di interazione ton i soluti organici @ la ripartizione tra adsorbente (ad es. PDMS) ed acqua. E stato dimostrato che la costante di ripartizione-polidimetilsilossano/acqua (Kpovtsaqu) © proporzionale al coefficiente di ripartiaione-ottanolo/acqua (Pyne fa). La conoscenza di questo, del volume e della massa di adsorbente sono es- fenziali per calcolare la quantita di analita che pud essere trattenuta nell’adsor- bente. Quando gli analiti posseggono una bassa Pyrjque Si Ottiene un miglior recupero con la ECAR rispetto alla MEFR. Sebbene Puso della ECAR sia ancora agli albori, é intuibile che potra avere in- teressanti sviluppi nel campo delle analisi farmaceutiche, alimentari ed ambien- tali, La ECAR é particolarmente attraente in quanto @ una tecnica che non ado- pera solventi (con deadsorbimento termico), é rapida e di facile uso per P'operatore. [2d Tests di autovalutazione YU J parametri utilizzati per Vanalisi qualitativa in TLC sono: a) Ry b) RreR, ¢) Diametro delVarea rilevabile occupata dalla sostanza d) Intensita della colorazione dell’area rilevabile occupata dalla sostanza ¢) Pit di uno dei parametri elencati Nella cromatografia di adsorbimento quando la polaritc della fase mobile ¢ mag giore di quella det vari componenti la miscela: a) T composti vengono eluiti con il fronte del solvente b) I composti non vengono eluiti ©) I composti vengono eluiti in base alle loro dimensioni 4) Vengono eluite le sostanze ioniche ©) Nessuna delle precedenti situazioni EB Le classificazione tra cromatografia di permeazione su gel ¢ quella ad esclusione dimensionale si basa su: a) Differente tipo di eluente utilizzato b) Differente tipo di fase stazionaria utilizzata c) Intervallo di dimensioni molecolari dei soluti da separare 4) Meccanismo del processo separativo ©) Nessuno dei precedenti Un composto solido pud essere purificato tramite: a) Cristallizzazione b) Cromatografia su colonna ©) Estrazione liquido-liquido ) Distillazione in corrente di vapore ) Piu di una tecnica elencataaw 90m CaprroLo 3 - PURIFICAZIONE F SEPARAZIONE DI PRINCIPI ATTIVI EXE Un composto liquido pud essere purificato tramite: a) Distillazione frazionata b) Sublimazione c) Filtrazione d) Nessuna delle tecniche precedenti ) Pit di una delle tecniche precedenti (Bl Si distillano due liquidi A e B con tensione di vapore, rispettivamente, di 135 e 45. Si calcoli dopo un unico processo di distillazione la composizione della fase va- pore partendo da un liquido di composizione A = 0.5 e B = 0.5. 40 ml di soluzione eterea contenente 2 g di acido organico vengono estratti con 60 ml di soluzione alcalina. Sapendo che K = 1, calcolare la quantita che rimane nella fase organica dopo un unico processo estrattivo e dopo tre estrazioni utiliz- zando to stesso volume di fase alcalina suddivisa in tre porzioni. EXE Costruire uno schema di separazione per le seguenti miscele di sostanze: a) Acido benzoico, Cloramfenicolo, p-Amminofenolo, Benzaideide b) Fenacetina, Procaina, Acido acetico, Acido acetilsalicilico ¢) Esilresorcina, Efedrina, Acido salicilico, Benzile benzoato EB] Nella SPE il meccanismo di ritenzione ionico é quello in cui si verific interazione tra analita e fase stazionaria a) Vero b) Falso EE Se una cartuccia per SPE a base silicea comtiene 300 mg di materiale adsorbente il suo volume letto corrisponde a circa a) 750 microlitri b) 350 microlitri ¢) 0.45 millilitri d) 600 microlitri EEE La massa del lerto di una cartuccia per SPE dipende da: a) volume della cartuccia b) natura dell’adsorbente ¢) temperatura di esecuzione della separazione d) volume del letto Bruno. Tasso@unige.it