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50
KD =
Cs
Cm
KD =
Ns Vm
Nm Vs
KD = k
k=
KD
k ' = t 0 VR V0
=
tR
t0
V0
El volumen de elucin de la fase mvil en el que
sale el compuesto de inters se conoce como
volumen de retencin (VR), y el tiempo
transcurrido desde que el compuesto es inyectado
hasta que alcanza el detector es conocido como
tiempo de retencin (tR). El volumen de retencin
es caracterstico de cada compuesto y est
relacionado con la constante de distribucin. Al
volumen de fase mvil requerido para eluir una
sustancia no retenida se le conoce como (Vm o
Vo).
V R = V m (1 +
k)
Cuando el factor de retencin del analito es
inferior a 1, la elucin es tan rpida que la
determinacin del tiempo de retencin es muy
difcil. Factores de retencin muy grandes
(superiores a 20) significan que la elucin
transcurre durante mucho tiempo. Se considera
que un factor de retencin ideal est entre 2 y 6.
Para llegar a una separacin ptima entre
compuestos, deben obtenerse picos agudos y
simtricos. En general, picos con bajo factor de
retencin son mejores porque se evita su
ensanchamiento
cumpliendo
mejor
las
caractersticas deseables (Figura 1).
Si se observa la Figura 2, puede verse que para
un pico perfectamente simtrico, los segmentos A
y B medidos al 10 % de la altura del pico son
iguales, por tanto el valor de asimetra (Af) segn
la frmula sera de 1:
Af =
B(10%h )
A(10%h )
A+ B
=
2A
(10%h )
Tf
Eficiencia
El modelo del plato terico supone que la columna
cromatogrfica contiene gran nmero de capas
separadas, llamadas platos tericos. Los
equilibrios para la separacin de la muestra entre
la fase estacionaria y la fase mvil tienen lugar en
estos supuestos platos. El analito se mueve en la
mvil
HEPT = L / N
El nmero de platos tericos que posee una
columna real se puede calcular a travs del pico
cromatogrfico de un compuesto dado despus de
su elucin. El compuesto es, generalmente, un
compuesto de prueba con buena separacin que
producir un buen pico cromatogrfico. (N) se
definido como:
5,54 t
2
N=
w1/2 2
t
N = R2
s
H = ( A + B) /(u +
Cu)
hv =
2
v
+v
1/ 3
RS =
Selectividad y resolucin
Se define como selectividad () a la capacidad de
separacin de dos analitos en la columna,
considerando el tiempo de retencin (o volumen
de retencin) de los mximos de los picos para
cada analito.
k2 t t
V2
2
0
=
=
k1 t t
1
0
V0
V1 V0
V2 V1
1 2(W1 + W2 )
1 k'
N
RS =
4 1+k'
10
Figura 4. Representacin de Van Deemter para establecer el flujo ptimo de la fase mvil.
TIPOS DE CROMATOGRAFA
El tipo de cromatografa en HPLC viene
determinado
por
la
fase
mvil
y,
fundamentalmente, por la fase estacionaria.
Existen diferentes tipos de fase estacionaria
disponibles en forma de soportes de distintos
materiales (polmeros, carbn, hidroxiapatita,
agarosa o slica) contenidos en una columna.
Pueden ser de diferentes tamaos, dimetros,
tamaos de poro, o que tengan unidos diferentes
anticuerpos,
Rs =
G=
t R = t 0 k '+t 0
k ' = (t R t 0 )
/t0
[(1/ 4) (( 1) )N ] [k ' /
1/2
(1 + k ')]
tG
t 0 .S
Elucin en gradiente
tg = t 0 k log 2,3 0 / k
k
Factor de capacidad k = t G / St 0 = t G F / SVm
fase mvil durante el transcurso de la
cromatografa (aumentando la fuerza inica, Resolucin R = [(1/ 4) ( 1) ( ) N 1 / 2 ] k /
Los
diferentes
compuestos
son
eluidos
modificando gradualmente la composicin de la
Tiempo de retencin
(1 + k )]
Columna
En HPLC se usan diversos tipos de columnas
secundarias que se asocian a la columna de
separacin con otros fines especficos:
-
Dimetro
(mm)
Relacin de
flujo (L/min)
Capacidad de
muestra (g)
Mxima carga de
muestra (mg)
0,075
0,25
0,05
0,15
1,0
0,2
0,30
5,0
1,0
0,50
10
2,0
Microcalibre
1,0
25 - 50
0,05 - 10
Calibre estrecho
2,1
100 - 300
0,2 - 50
Analtica
4,6
500 - 1.500
1 - 200
10
Semi-preparativa
10
2.500 - 7.500
1.000
50
Preparativa
22
10.000 - 30.000
5.000
200
Tipo
Capilar
Inyector
El inyector para HPLC consiste normalmente en
una vlvula de inyeccin y un bucle. Un pequeo
volumen de muestra (previamente disuelta) se
carga en una jeringa y es inyectada en el bucle
por la vlvula de inyeccin. Un giro del rotor de la
vlvula cierra la vlvula y pone en comunicacin el
bucle que contiene la muestra con la corriente de
fase mvil que va de la bomba a la columna. El
volumen del bucle determina la cantidad inyectada
y puede ir desde 5 L hasta 500 L.
La inyeccin a flujo parado es un mtodo especial
por el cual la bomba se detiene para realizar la
inyeccin a presin atmosfrica, este sistema se
utiliza cuando se trabaja a muy alta presin.
Bomba
Bombas de pistn recproco: constan de un pistn
conducido por una leva unida a un pequeo motor
que se mueve rpidamente atrs y adelante en
una cmara hidrulica variando su volumen entre
35-400 L. En la carrera atrs, la vlvula de
Detector
Los detectores utilizados para HPLC siempre
trabajan bajo condiciones de flujo continuo, la
muestra disuelta en la fase mvil atraviesa una
celda de flujo en la que es detectada.
Normalmente, las muestras llegan en cantidades
de ng al detector, pero en anlisis de trazas, esta
cantidad puede llegar a ser de fg e incluso de muy
pocas molculas.
La respuesta del detector al paso de la sustancia
est basada en un amplio rango de caractersticas
fsicas y qumicas de las sustancias. Es por esto
que no existe un detector universal, sino que cada
sustancia, en principio, debe analizarse con el
detector ms adecuado dependiendo de su
naturaleza fsico-qumica, del tipo de anlisis que
se lleve a cabo y del tipo de instrumentacin de la
que
se
disponga.
Los detectores
ms
ampliamente utilizados se basan en:
-
hw
R =sM
donde (h) es la altura del pico, en mV; (w) la
anchura del pico a 0,607 cm de la altura, en cm;
R=
hwF
sM
Regulador de contrapresin
El regulador de contrapresin se sita
inmediatamente despus del detector. Se disea
para aplicar una presin constante a la salida del
detector que previene la formacin de burbujas de
aire en el sistema. Esto mejora la estabilidad de la
lnea de base cromatogrfica. Se proyecta para
operar sin tener en cuenta el flujo, la fase mvil o
la viscosidad.
Colector de fracciones
El colector de fracciones es un dispositivo
automtico que recoge uniformemente los eludos
a la salida del HPLC. Los viales o tubos son
colocados en un carrusel o en una gradilla y el
usuario programa el intervalo de tiempo en el que
se recolecta cada fraccin. Cada vial contiene
fase mvil y fracciones de la muestra en el
correspondiente tiempo de elucin.
APLICACIONES
CLNICO
EN
EL
LABORATORIO
Antirretrovirales
(aciclovir,
delfinavir,
saquinavir).
Barbitricos (fenobarbital, butabarbital,
butabital, secobarbital).
Broncodilatadores (albuterol, teofilina,
teobromina, paraxantina, cafena).
Frmacos glucocorticoides (prednisolona,
betametasona).
Hormonas (dosificacin de testosteronas:
acetato, propionato y benzoato de
testosterona).
Pptidos
teraputicos
(oxitocina,
angiotensinas I y II).
Queratolticos (cido saliclico, cido
benzico).
Sedativos (nordiazepam, clordiacepxido,
oxacepam,
norclordiacepxido)
y
opiceos (morfina y sus glucornidos,
metadona).
BIBLIOGRAFA
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