Antgeno p24

Este es un anlisis que se usa para detectar la infeccin con VIH despus de una
exposicin reciente o para controlar la respuesta del cuerpo al tratamiento contra
el VIH. Este estudio se realiza si se estuvo expuesto recientemente al VIH.
El anlisis de p24 identifica partculas virales del VIH en la sangre (p24 es una
protena que se encuentra en el VIH). No obstante, el resultado generalmente solo
es positivo despus de una a tres o cuatro semanas aproximadamente a partir de
la infeccin con el VIH. La protena p24 no se puede detectar hasta pasada una
semana despus de la infeccin porque, por lo general, el virus tarda ese tiempo
en establecerse y multiplicarse en cantidad suficiente para que sea detectable.
Posteriormente, la protena p24 vuelve a ser indetectable despus de que se
hayan producido suficientes anticuerpos contra el VIH, que se unen a dicha
protena y la eliminan de la sangre. Una vez que se crearon anticuerpos, el
anlisis de p24 arrojar un resultado negativo aunque la persona est
infectada con el VIH. En ese momento, la prueba comn de anticuerpos contra el
VIH ser positiva. Ms tarde, en el transcurso de la infeccin con el VIH, los
niveles de la protena p24 vuelven a ser detectables.
Se puede solicitar un anlisis de p24 si ha estado expuesto al VIH recientemente y
desea saber el estado del virus. Tambin se puede solicitar si dona sangre, o si ya
tiene el VIH y su mdico desea controlar su respuesta a la terapia o determinar si
el VIH se est manifestando como SIDA.
Qu es lo que se analiza?
El VIH es el virus causante del SIDA (sndrome de inmunodeficiencia adquirida). El
antgeno p24 es una protena vrica y sus niveles en sangre estn
caractersticamente elevados al inicio de la infeccin por el VIH, antes de que el
organismo haya tenido tiempo de desarrollar anticuerpos. Esta prueba detecta el
antgeno p24 y sirve como cribado de una infeccin reciente por el VIH.
Tpicamente se realiza en combinacin a otras pruebas (VIH anticuerpos) y mucho
menos frecuentemente se realiza de manera aislada como prueba nica.
Cuando el VIH penetra en el organismo, ya sea por el contacto con sangre,
secreciones o fluidos de una persona infectada ya sea por exposicin a una
jeringuilla contaminada, el virus empieza a replicarse de manera que se produce
un elevado nmero de copias del virus idnticas. Durante las primeras semanas
tras la infeccin, la cantidad de virus (VIH carga viral) y los niveles de antgeno
p24 en sangre pueden ser muy elevados. La persona afectada suele presentar
sntomas y signos similares a los de una gripe, que por lo general se resuelven a
medida que el sistema inmune del organismo produce anticuerpos dirigidos contra
el VIH. Cuando la infeccin inicial se resuelve, los niveles de antgeno p24 y el
nmero de partculas vricas disminuyen al mismo tiempo que los anticuerpos
frente al VIH van aumentando. En caso de no tratarse, la infeccin va siguiendo su

curso durante aos (diez o ms), causando pocos sntomas pero afectando
progresivamente al sistema inmunitario del individuo.
A medida que disminuye la capacidad de respuesta del sistema inmune, los
sntomas y signos de la infeccin por el VIH pueden ir aflorando y empeorando.
Los niveles de protenas virales y de la carga viral aumentan. La debilitacin del
sistema inmune hace que el individuo sea especialmente vulnerable a infecciones.
Los tratamientos empleados en el SIDA tienen por finalidad disminuir la cantidad
de virus en sangre, limitando su capacidad de replicacin y por lo tanto
disminuyendo la agresin contra el sistema inmune. Los aumentos y
disminuciones del VIH se traducen en aumentos y disminuciones de los niveles de
antgeno p24.
A pesar de que el uso aislado de la prueba del antgeno p24 ha disminuido, se han
desarrollado pruebas en las que se combina la deteccin del antgeno p24 y la
deteccin de anticuerpos frente al VIH; con estas pruebas se consigue aumentar
la probabilidad de detectar una infeccin por VIH de manera precoz despus de
una exposicin al VIH. En reas con falta de recursos y en las que no puede
disponerse de pruebas moleculares, la prueba del antgeno p24 se sigue
utilizando.
FUNDAMENTOS DEL METODO
Los pocillos de la poli cubeta estn recubiertos con protenas recombinantes y pptidos
sintticos de HIV-1 (gp41) y HIV-2 (gp36) y anticuerpos monoclonales anti-p24(*). La
muestra se incuba en los pocillos, si la misma contiene antgeno p24 y/o anticuerpos
contra HIV-1 o HIV-2 se unirn a los antgenos y/o anticuerpos del pocillo. El material no
unido es removido por lavado. En el paso siguiente se agrega el Conjugado 1 que
contiene anticuerpos y antgenos marcados con biotina que se unirn a los
antgenos/anticuerpos si estn presentes en la muestra. Luego se agrega el Conjugado 2
(peroxidasa conjugada a estreptavidina) que se unir al Conjugado 1. El conjugado no
unido se remueve por lavado.
A continuacin se agrega una solucin conteniendo tetrametilbencidina (TMB) y perxido
de hidrgeno. Las muestras reactivas desarrollan color azul que vira al amarillo cuando la
reaccin se detiene con cido sulfrico (Stopper).
REACTIVOS PROVISTOS

Policubeta sensibilizada: policubeta de 96 pocillos recubiertos con protenas

recombinantes y pptidos sintticos de HIV-1 y HIV-2 y anticuerpos monoclonales
humanos anti-p24.
Diluyente de Muestra: buffer Tris 0,02 M conteniendo protenas bovinas, cloruro de
sodio y agente tensioactivo, pH 7,2, color azul.
Conjugado 1: solucin conteniendo antgenos recombinantes y pptidos sintticos
de HIV-1 y HIV-2 y anticuerpos monoclonales humanos anti-p24 biotinilados en
buffer fosfato 10 mM con protenas bovinas, cloruro de sodio y agente tensioactivo,
pH 7,2.
Conjugado 2 concentrado: estreptavidina conjugada con peroxidasa, color naranja.

Diluyente de Conjugado 2: buffer fosfato 10 mM con protenas bovinas, cloruro de

sodio y agente tensioactivo, pH 7,2.
TMB: solucin de tetrametilbencidina 36 mM en dimetilsulfxido (DMSO) 100%,
(100x).
Diluyente de TMB: buffer citrato 40 mM y perxido de hidrgeno 1,27 mM, pH 4,3.
Stopper: cido sulfrico 1 M.
Buffer de Lavado concentrado: buffer fosfato 250 mM, cloruro de sodio 3,45 M y
agente tensioactivo, (25x), pH 6,4.
Control Positivo: suero humano inactivado, conteniendo anticuerpos anti-HIV, color
rojo.
Control Positivo p24: solucin de antgeno p24 de HIV-1 en buffer fosfato 10 mM,
con protenas bovinas, cloruro de sodio y agente tensioactivo, pH 7,2.
Control Negativo: suero humano normal no reactivo, inactivado, color amarillo.

MATERIAL REQUERIDO (no provisto)

- Micropipetas automticas o semiautomticas, regulables o fijas
- Tips descartables
- Material volumtrico para preparar diluciones
- Cronmetro
- Estufa a 37 C
- Guantes descartables
- Papel absorbente
- Hipoclorito de sodio
- Sistema de lavado de policubetas (manual o automtico)
- Espectrofotmetro para lectura de policubetas
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
1- Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras 30 minutos antes de iniciar
la prueba.
2- Preparar el volumen necesario de Buffer de Lavado.
3- Sacar el nmero de pocillos requeridos para el ensayo y volver a colocar el resto de la
policubeta en su bolsa cerrada y con desecante, colocarla inmediatamente a 2-10 C.
4- En los pocillos a utilizar de la policubeta dispensar el Diluyente de Muestra, luego la
muestra (M), el Control Negativo (CN) por triplicado, el Control Positivo (CP) por duplicado
y el Control Positivo p24 (p24) segn el siguiente esquema:

Para evitar la evaporacin cubrir la policubeta con cinta autoadhesiva.

5- Incubar durante 60 minutos a 37 C.
6- Despus de la incubacin eliminar el lquido de cada pocillo por completo. Lavar 5
veces segn instruccin de lavado (ver Procedimiento de Lavado).
7- Agregar Conjugado 1 listo para usar:

Para evitar la evaporacin cubrir la policubeta con cinta autoadhesiva.

8- Incubar el Conjugado 1 durante 30 minutos a 37 C. En forma paralela, preparar el
Conjugado 2 diluido.
9- Despus de la incubacin eliminar el Conjugado 1 de cada pocillo por aspirado o
invirtiendo la policubeta y golpendola sobre papel absorbente. NO LAVAR LA
POLICUBETA ENTRE LA INCUBACION CON CONJUGADO 1 Y CONJUGADO 2.
10- Agregar el Conjugado 2 diluido:

Para evitar la evaporacin cubrir la policubeta con cinta autoadhesiva.

11- Incubar durante 30 minutos a 37 C.
12- Preparar el Revelador.
13- Despus de la incubacin eliminar el Conjugado 2 lavando 5 veces segn instruccin
de lavado (ver Procedimiento de Lavado).
14- Agregar el Revelador:

15- Incubar 30 minutos a temperatura ambiente (18- 25 C). Mantener la policubeta

protegida de la luz y luego agregar:

16- Leer la absorbancia de la solucin de los pocillos en espectrofotmetro a 450 nm o

bicromtica a 450/600-650 nm.
Nota: se recomienda efectuar siempre la lectura en forma bicromtica. En caso de que la
lectura sea monocromtica, realizar un blanco de reactivos (omitiendo el Conjugado 2
diluido) que luego deber ser restado de todos los valores de las muestras.
PROCEDIMIENTO DE LAVADO
Los pocillos se lavan con 350 ul de Buffer de Lavado diluido. Asegurar que la altura
alcanzada al llenar los pocillos no cause desbordes. El tiempo mnimo que debe estar la
solucin de lavado en contacto con el pocillo es entre 30 y 60 segundos. Garantizar que
luego del ltimo lavado no quede lquido residual. Realice un doble aspirado para eliminar
el excedente de buffer, si persiste luego de este procedimiento, invertir la policubeta sobre
papel absorbente y golpearla varias veces.
Nota: el procedimiento de lavado es crtico para el resultado del ensayo. Si queda buffer
de lavado en el pocillo o si los pocillos no estn completamente llenos se obtendrn
resultados errneos. No dejar que los pocillos se sequen durante el procedimiento. Los
lavadores automticos deben ser enjuagados con agua destilada o desionizada al final del
da para evitar obstrucciones debido a las sales presentes en el buffer de lavado.
RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Muestras no reactivas: se consideran aquellas cuyo valor de absorbancia es menor al
valor Cut-off. Muestras inicialmente reactivas: se consideran aquellas cuyo valor de
absorbancia es mayor o igual al valor Cut-off. Estas muestras deben ser reanalizadas por
duplicado usando la muestra original.
Si los dos duplicados son negativos, la muestra se considera no reactiva para HIV.
Si por lo menos uno de los duplicados es positivo, la muestra se considera repetidamente
reactiva y contiene antgeno p24 y/o anticuerpos contra HIV-1 o HIV-2.
Los resultados repetidamente reactivos deben corroborarse por un mtodo confirmatorio,
de acuerdo a la normativa legal vigente.
Una muestra inicialmente reactiva puede ser no reactiva en las dos repeticiones. Esto
puede deberse a:
- Contaminacin cruzada de un pocillo no reactivo por una muestra con ttulo elevado de
anticuerpos anti-HIV y/o antgeno.
- Contaminacin de la muestra durante la dispensacin, imprecisin en el dispensado de
la muestra y/o de los conjugados o TMB en el pocillo, reutilizacin de tips.
- Contaminacin del pocillo con hipoclorito u otros agentes oxidantes.
- Muestras no coaguladas completamente, con restos de fibrina o fibronectina.
En ciertos casos una muestra no reactiva puede presentar una reaccin falsamente
reactiva, tanto en el anlisis inicial como en sus repeticiones. Algunas causas de este
fenmeno pueden ser:
- Contaminacin de una muestra no reactiva por otra fuertemente reactiva.
- Contaminacin de la muestra durante la extraccin, procesamiento o conservacin.
- Presencia de sustancias interferentes, tales como autoanticuerpos, anticuerpos dirigidos
contra alguno de los componentes del reactivo, frmacos, etc.
- Contaminacin del Revelador por el Conjugado 2.
- Utilizacin de muestras hemolizadas, suero coagulado en forma incompleta, plasma
conteniendo fibrina, o muestras con contaminacin microbiana. Este tipo de muestras
pueden dar resultados falsamente reactivos.
- Dispensacin y/o aspirado ineficiente de la solucin de lavado (sistema obstruido).
- Aspirado insuficiente con un remanente de solucin de lavado en los pocillos en el ltimo
lavado.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Ver Sustancias Interferentes conocidas en MUESTRA.
No se debe utilizar pool de muestras.

No se deben utilizar otros fluidos corporales como la saliva, lquido cefalorraqudeo u

orina.
El mtodo colorimtrico de verificacin del cargado de la muestra no permite verificar la
exactitud de los volmenes distribuidos sino solamente validar la presencia de la muestra.
Ocasionalmente, al efectuar lecturas bicromticas, pueden obtenerse absorbancias
negativas que no invalidan la determinacin.
Esto se debe a que algunas muestras dan lecturas inferiores al Blanco de Reactivos.