LABORATORIO AVANZADO

DE FISIOLOGA VEGETAL
Curso 2006-2007

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Comisin Docente de Fisiologa Vegetal

Departamento de Biologa
Universidad Autnoma de Madrid

Francisca F. del Campo

Soledad Sanz Alfrez
Luis E. Hernndez

Mdulo de Cultivo in vitro

CULTIVO IN VITRO DE EXPLANTOS DE TABACO.

ANLISIS DE TRANSGENICIDAD
Introduccin
Diversas plantas de inters agroalimentario, ornamental o manipuladas genticamente,
han de propagarse o regenerarse vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es
preciso emplear tcnicas de propagacin vegetativa para erradicar infecciones por virus
y para introducir variaciones genotpicas que aumenten la calidad de los productos.
Estas tcnicas se conocen genricamente como cultivo in vitro.
Para el cultivo in vitro de clulas, tejidos u rganos hay una serie de factores que hay
que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que
las clulas vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgnicas, una fuente
de carbono en el caso de no poder realizar fotosntesis, vitaminas en algunos casos y
fitohormonas.
El medio inorgnico ms empleado es la mezcla de sales diseada por Murashige y
Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o
citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y clulas.
En la prctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtencin de callos de
explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones
de auxina/citoquinina que determinan, segn los casos, mayor desarrollo de la parte
area o mayor desarrollo de la raz.

Fig. 1. Diferenciacin de explantos en funcin de distintas concentraciones de auxina y citoquinina

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Kinetina

Zeatina

BAP: bencilaminopurina

Fig. 2. Estructuras moleculares de diversas auxinas y citoquininas empleadas para la preparacin

de medios de cultivo in vitro.

Una de las aplicaciones del cultivo in vitro, como se ha indicado, es la regeneracin de

plantas trasngnicas. Dado que los eventos de transformacin gentica solo afectan a
unas pocas clulas del material vegetal manipulado, es preciso incluir un GEN DE
SELECCIN. Esto es: un gen que codifica una enzima capaz de detoxificar una
sustancia letal para las clulas vegetales. As, muchas plantas transgnicas portan como
gen de seleccin el gen de resistencia a los antibiticos kanamicina y neomicina
(neomicina fosfotransferasa, nptII). La presencia de este gen de seleccin o resistencia
se puede detectar en las plantas de tabaco cultivadas mediante dos experimentos: i)
propagacin del material vegetal en un medio de cultivo in vitro suplementado con
kanamicina, y ii) deteccin del transgen mediante PCR a partir de DNA genmico.
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Mdulo de Cultivo in vitro

NOTA IMPORTANTE:
Hay que evitar en lo posible la contaminacin de los medios de cultivo por bacterias u
hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles.
Se trabajar muy cerca de la llama del mechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY
LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse
bien las manos con jabn y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %.
SI NO CUIDAIS ESTE ASPECTO OS PODEIS ENCONTRAR CON VUESTRO
EXPERIMENTO
TOTALMENTE
INFECTADO
POR
ORGANISMOS
INDESEABLES!!!!
Asimismo, es necesario ser muy pulcros al esterilizar el material vegetal que se va a
cultivar in vitro. Por favor, seguid muy atentamente las indicaciones del guin de
prcticas y las recomendaciones que hagan los profesores.

1 PARTE:

Propagacin de plantas de tabaco tipo silvestre y

transgnicas en medio con kanamicina

1.1. Material para el cultivo in vitro

Material vegetal
Plantas cultivadas en un substrato orgnico. Se emplearn plantas que han sido
previamente cultivadas en nuestro laboratorio de tabaco (Nicotiana tabacum), de las que
disponemos una lnea silvestre (no manipulada genticamente) y otra transgnica (que
sobreexpresa un gen que codifica MnSOD). Estas plantas se crecieron en un substrato
de turba ms perlita durante mes y medio.
Disoluciones para esterilizar los tejidos
De lavado: etanol 70%
Esterilizadora: hipoclorito sdico 20%, Tween-20 0.2 mlL-1
Medio de cultivo bsico
Medio MS: Es un preparado comercial que contiene las distintas sales mezcladas y listas
para ser disueltas en medio lquido. Cuando se disuelven en la cantidad adecuada, la
concentracin final de los distintos nutrientes minerales es la mostrada en la Tabla 1.
Tabla 1. Concentracin de sales minerales de la disolucin nutritiva diseda por Murashige-Skoog

Sales de macronutrientes (mgL-1)

Sales de micronutrientes (mgL-1)
NH4NO3
1650 KI
0.83
KNO3
1900 H3BO3
6.2
22.3
CaCl22H2O
440 MnSO44H2O
MgSO47H2O
370 ZnSO47H2O
8.6
KH2PO4
170 Na2MoO42H2O
0.25
CuSO45H2O
0.025
CoCl26H2O
0.025
Na2EDTA
37.3
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FeSO47H2O

27.8

Dicho medio bsico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas
estn preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolbiles, se
esterilizan por filtracin:

Vitaminas (termolbiles, STOCK 1000 v.c.):

1. cido nicotnico 5 mgL-1
2. Tiamina hidrocloruro 5 mgL-1
3. Piridoxina hidrocloruro 1 mgL-1
Mio-inositol 1 gL-1
Sacarosa 3 %
Para medio slido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 %

Medio de cultivo con fitohormonas y kanamicina

Para comprobar el efecto de una aplicacin exgena de hormonas sobre el desarrollo del
explanto vamos a preparar distintos medios de cultivo, donde la concentracin de
fitohormonas ser distinta, siguiendo el esquema de la Tabla 2. Se parte de disoluciones
stock concentradas, que se aadirn para preparar 500 mL de medio por grupo. Este
volumen de medio es suficiente para preparar al menos 20 placas Petri por grupo.

Auxina (termolbil, STOCK 1000 v.c.): cido naftalnactico (NAA) 3 gL-1

Citoquinina (termolbil, STOCK 1000 v.c.): bencilaminopurina (BAP) 1 gL-1
Kanamicina (termolbil, STOCK 1000 v.c.): 50 g L-1

Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variar la
proporcin de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volmenes de los stock de
fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.

Medio

Kan

Conc. final (mgLNA

1)
A
auxina:citoquinina

BAP

Kan Grupo

(L)

(mg L-1)
Alta auxina (AA)

NO

3.0 : 0.0

500

Media aux. (MA)

NO

1.5 : 0.5

250

250

Baja aux. (BA)

NO

0.5 : 3.0

85

1500

AA + kanamicina

50

3.0 : 0.0

500

500

MA + kanamicina

50

1.5 : 0.5

250

250

500

BA + kanamicina

50

0.5 : 3.0

85

1500

500

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Aparatos, instrumental y material vario

Autoclave
Pinzas y bistures
Placas Petri estriles
Pipetas automticas
Fitotrn (22C-17C, 16h
Puntas pipetas estriles
luz-8h oscuridad)
pHmetro
Tijeras
Mechero Bunsen

Balanza
Pulgas magnticas
Agitador magntico
Tubos Falcon
Frascos ISO de 1 L

1.2. Metodologa cultivo in vitro

DIA 1
Se prepararn las placas con medio de cultivo slido. En primer lugar se proceder a la
preparacin de 500 mL de medio de cultivo lquido MS por grupo (Cada mesa tendr los
cuatro tratamientos indicados). Las sales inorgnicas (macronutrientes y
micronutrientes) vienen mezclados en un preparado comercial (Sigma, M-5524). En un
vaso de precipitado que contenga aproximadamente 400 mL de H2O desionizada, se
disuelven 2.15 g del preparado comercial. Seguidamente se aaden 15 g de sacarosa y
0.5 g de mio-inositol. Una vez disueltos los solutos, la disolucin se ajusta a pH 6.0 y se
enrasa el volumen a 500 mL. En una botella de 1 L (Duran, tapn azul) se echan 4 g de
Phytogel y se vierte con cuidado los 500 mL del medio que se ha preparado. Se
autoclavan en ciclo corto 121C a 105 kPa durante 20 min.
Una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60C. Esta
temperatura permite coger los matraces con la mano, NO TIENEN QUE QUEMAR
AL TACTO. Cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adicin de
los componentes termolbiles que han sido esterilizados previamente por filtracin. Se
aaden los correspondientes volmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 mL,
fitohormonas o kanamicina segn se indica en la Tabla 2. SIEMPRE CUIDANDO DE
TRABAJAR MUY CERCA DEL MECHERO ENCENDIDO, MANTENIENDO
LA BOCA DE LA BOTELLA CERCA DE LA LLAMA, Y SIEMPRE
TRABAJAR CON LA MAYOR PRESTEZA POSIBLE.
Una vez aadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotacin para
homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se
solidifique el agar.
Se prepararn 15-20 placas Petri con los 500 mL de medio de cultivo estrilizado. HAY
QUE EVITAR DEJAR LAS PLACAS ABIERTAS. CUANTO MS CUIDADO
SE PONGA EN ESTE PASO, MENOS PROBLEMAS DE CONTAMINACIN
HABR.
Las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de Prafilm y ya estarn listas para
el da siguiente.

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DIA 2
Se proceder a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y
transgnico. Se cortarn secciones de tallo y hojas con bistur, que seguidamente se
transferirn a tubos Falcon de 50 mL para su esterilizacin.
Esterilizacin
Se aade 15-20 mL de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. Se enjuaga el
tejido con agua estril y se lava el tejido con otros 15-20 mL de la disolucin
esterilizadora durante 5 min. Para eliminar la leja, se lava el tejido con tres volmenes
de H2O desionizada estril, TRABAJANDO SIEMPRE CERCA DEL MECHERO.

MUCHO, MUCHO CUIDADO CON EL ETANOL Y EL MECHERO.

ES ALTAMENTE INFLAMABLE Y NO QUEREMOS TENER
BAJAS EN LA TROPA!!
Una vez esterilizado el tejido, y TRABAJANDO CON PRESTEZA Y MUCHO
CUIDADO, se cortarn ms finamente los tallos en secciones de aproximadamente 0,5
cm de espesor. Seguidamente, se transfieren a las placas Petri con unas pinzas que
hayan sido flameadas, apoyando los sectores sobre el agar. Finalmente, las placas hay
que sellarlas con Parafilm.

POR FAVOR, INSISTIMOS EN EL CUIDADO QUE DEBEIS

TENER PARA QUE SE TRABAJE CON LA MAYOR LIMPIEZA Y
ESTERILIDAD POSIBLES
Dejaremos el material en el Fitotrn. Cada 5-7 das se observar el progreso del
experimento, y cuando pasen 3-4 semanas podremos observar el desarrollo final de los
explantos, a los que se tomarn fotografas.

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2 PARTE:

Deteccin de transgenes de resistencia a kanamicina

mediante PCR en plantas transgnicas de tabaco

2.1. Fundamento del experimento

De las diversas tcnicas disponibles para detectar la presencia de un transgen hemos
optado por emplear la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), por ser una de las
ms sencillas. No obstante, se ha de disponer de informacin previa sobre la secuencia
del gen o genes que se han incluido en el genoma de la planta para poder disear los
cebadores especficos correspondientes (ver anexo con las secuencias).

Fig. 3. Esquema de amplificacin de un fragmento de DNA genmico utilizando la reaccin en

cadena de la polimerasa (PCR).

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El procedimiento consiste en la extraccin de DNA de hojas de plantas de tabaco, tipo

silvestre o NO transgnicas (WT), y de plantas transgnicas (MnSOD) que portan un
gen de seleccin de kanamicina (nptII). Para ello se utilizar el kit comercial Nucleon
Phytopure (Amersham Biosciences/GE Healthcare, Reino Unido). El DNA obtenido se
utilizar como molde de reacciones de PCR que se prepararn con cebadores especficos
mostrados en la Tabla 3. Tras realizar la reaccin de PCR en un termociclador, los
productos de amplificacin se visualizarn mediante una electroforesis en gel de agarosa
y con tincin de bromuro de etidio (SUBSTANCIA CARCINOGNICA QUE HAY
QUE MANIPULAR CORRECTAMENTE).

2.2. Metodologa PCR de DNA genmico

DIA 1
Extraccin de DNA
Cada grupo coge hojas de un solo tipo de plantas: grupos impares (1, 3 y 5) de las
plantas silvestres (WT); y grupos pares (2, 4 y 6) de las plantas transgnicas
(MnSOD). Las hojas se congelan y homogeneizan con ayuda de un mortero en
nitrgeno lquido (N2(l)). Ser suficiente con coger 4 o 5 trozos grandes de hoja. Una
vez obtenido un polvo congelado homogneo, se transfieren 0,1 g a un tubo
Eppendorf de 1.5 mL estril, que previamente contiene 600 L del tampn de
homogeneizacin o REAGENT 1 (Nucleon Phytopure, Amersham Biosciences). Se
mezcla bien con varias inversiones del tubo y se aaden 200 L del tampn de dilucin
o REAGENT 2. Se invierte el tubo nuevamente varias veces hasta obtener una mezcla
homognea. Seguidamente se incuba a 65C durante 10 min con varias agitaciones
manuales. Ubicar el tubo en un bao de hielo durante 20 min.
Para eliminar el DNA de impurezas se aaden 500 L de cloroformo y 100 L de la
Resina de Extraccin Nucleon. ESTA LTIMA, SER DISPENSADA POR LOS
PROFESORES. Se mantienen los tubos a temperatura ambiente durante 10 min, y con
agitacin suave peridica. Seguidamente se centrifugan los tubos a 12000 g, 4C durante
5 min. Se toman 600 L del sobrenadante SIN REMOVER LA INTERFASE CON LA
RESINA. Es MUY importante que los tubos una vez centrifugados se manipulen con
SUAVIDAD, para no volver a mezclar las fases y la resina.
Por ltimo, se procede a precipitar el DNA purificado aadiendo 1 volumen (600 L)
de isopropanol fro (estar almacenado a -20C), invirtiendo suavemente el tubo hasta
que el DNA precipita. A continuacin se centrifugan el tubo a 12000 g durante 5 min
para sedimentar el DNA. Se elimina con cuidado el sobrenadante y el precipitado de
DNA se lava dos veces con 300 L de etanol 70% fro (mantenido en bao de hielo).
Para evitar que flote el precipitado de DNA hay que centrifugar a 12000 g durante 2 min
entre lavados. Para no perder el DNA, lavar el precipitado y eliminar los sobrenadantes
con las pipetas de 200 L (puntas amarillas). Dejar secar el DNA al aire, y cuando est
seco (esperar 10-15 min) se redisuelve el DNA en 25 L de agua MiliRO estril.
Previamente a la realizacin de la reaccin de PCR, se diluye el DNA 1/5 (10 L de la
muestra ms 40 L de H2O) para tener la muestra molde preparada.

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Tabla 3. Cebadores especficos diseados para amplificar distintos fragmentos de DNA,

junto con el tamao esperado del fragmento y la temperatura de anillamiento.
Cebadores especficos utilizados
Fragmento

Cebador positivo

Cebador negativo

T ani.

Rubisco
(349 pb)

tccctgtttcaaggaagc
Rbcs01F

gtcgcataaaattgaaggag
Rbcs02R

59

nptII
(317 pb)

gaagagcatcaggggctc
nptII01F

gaagaactcgtcaagaaggc
nptII02R

59

35S
(234 pb)

tgccatcattgcgataaagg
35S01F

cctctccaaatgaaatgaac
35S02R

59

Nos term
(127 pb)

gaatcctgttgccggtcttgcg
nos01F

gcgggactctaatcataaaaac
nos02R

62

Reaccin de PCR
Los profesores elaborarn una mezcla maestra (tubo MM) que contendr todos los
componentes de la mezcla de reaccin de la PCR excepto el molde de DNA (obtenido
por cada grupo) y los cebadores especficos de cada fragmento a amplificar. Para cada
tubo de PCR (utilizar los tubos especiales de 200 L de pared fina estriles), se
deben poner los siguientes componentes en la MM para un volumen de reaccin final de
50 L: tampn de polimerasa 10X (ya contiene Mg2+), 5 L; 1 unidad de Taq
polimerasa (5 U/L), 0,2 L; dNTPs 10 mM (conc. final 200 M), 2 L; H2O, 27,8 L.
A los 35 L de MM hay que aadir 5 L de cada cebador (total 10 L para la pareja) y 5
L del molde de DNA. En la Tabla 4 se describen los componentes que hay que aadir
en cada uno de los 8 tubos de PCR que cada grupo ha de preparar.
Dado que cada grupo ha extrado DNA de una sola planta, se compartir por mesa
ambos moldes para que TODOS LOS GRUPOS ENSAYEN TODAS LAS
COMBINACIONES (Tabla 4).
Una vez mezclados los componentes de la reaccin de PCR se introducen los tubos en el
termociclador y se someten al siguiente programa:
Temperatura (C)

Tiempo

94

5 min

Desnaturalizacin

94

1 min

Anillamiento

59

45 s

Extensin

74

45 s

Extensin final

74

5 min

Final reaccin

10

Hasta el siguiente da

Desnaturalizacin
40 ciclos

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Tabla 4. Componentes de la mezcla de reaccin para la amplificacin de fragmentos de

DNA genmico mediante PCR.
Combinacin de componentes del medio de reaccin de PCR genmico
CEBADOR 10 M (L)

Nos termin

35S

nptII

Rubisco

Componente

Rubisc
o

WT

MnSOD

Molde de DNA

Tubos N

Molde de DNA

Tubos N

Molde de DNA

Tubos N

Molde de DNA

Tubos N

Rbcs01F

Rbcs02R

nptII

nptII01F

nptII02R

35S

Molde de DNA (L)

35S01F

35S02R

Nos termin

nos01F

nos02R

Mezcla Maestra (L)

35

35

35

35

35

35

TOTAL (L)

50

50

50

50

50

50

DIA 2
Anlisis de la PCR: separacin de los fragmentos en gel de agarosa
Los nucletidos se separarn mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de
agarosa 2% en tampn TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0). Las
bandas correspondientes al cDNA amplificado se visualizarn en un transiluminador
con luz ultravioleta teidos con bromuro de etidio (BrEt).

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Reactivos para la electroforesis de DNA

Tampn TAE. Madre 50x

Volumen de 1 L

Tris base

242 g

cido actico glacial

57.1 mL

Disolucin 0.5 M EDTA pH 8.0

100 mL

Tampn TAE de trabajo

Dilucin 1/50 del anterior

Disolucin de carga de muestras, preparada en H2O miliRO

Bromofenol azul

0.25%

Xilencianol

0.25%

Glicerol

30%

Disolucin madre de BrEt

10 mg/mL

Escalera de DNA de 100 pb, preparada directamente para cargar

En un matraz cnico de 250 mL limpio se pesan 2 g de agarosa y se aaden 100 mL del
tampn TAE. Se pone a calentar en un horno microondas hasta conseguir la disolucin
de todo el agarosa, agitando suavemente hasta que desaparezcan los grumos.
PRECAUCIN: el agarosa fundido puede estar a muy alta temperatura. Se ruega trabar
con extremo cuidado para evitar quemaduras.
Cuando la agarosa no queme al tacto (el calor soportable normal es aproximadamente de
60C), se aaden 4 L de la disolucin madre de BrEt. Temperaturas superiores pueden
hacer que se degrade, y posteriormente no veramos nada. PRECAUCIN: el bromuro
de etidio es altamente carcinognico. HAY QUE MANIPULARLO CON MUCHO
CUIDADO, siempre usando guantes, y desprendindose de los residuos (puntas de
pipeta, cintas, guantes, etc.) en el contenedor destinado a ello. NO TIRAR NADA
CONTAMINADO A LA BASURA NORMAL.
Una vez que el gel se ha solidificado se pone en la cubeta de electroforesis, se cubre
suficientemente con TAE y se cargan las muestras. Para ello, se usan 15 L del medio
de reaccin de PCR a los que se ha aadido 2 L de disolucin de carga. CON
CUIDADO DE NO PERFORAR EL POCILLO DE AGAROSA, se transfieren 15 L a
cada pocillo.
Finalizado el proceso de carga, se conectan los cables a la fuente de electroforesis. Se
enciende el equipo, se ponen a correr a 70 V y se espera aproximadamente 30 min para
que se separen los colorantes aadidos a la muestra.
Por ltimo, se visualiza el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y, si ha habido
reaccin de PCR se toma una foto con la cmara digital. El resultado ser, esperemos,
similar a lo mostrado en la Fig. 4.

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Fig. 4. Amplificacin por PCR de diversos fragmentos de DNA, utilizando como molde DNA
genmico obtenido de plantas no transgnicas (WT) y plantas transgnicas (MS) de tabaco. Se
muestran los resultados empleando cebadores contra la subunidad pequea de Rubisco (control
positivo) y el de dos componentes de un transgen: gen de resistencia a kanamicina (nptII) y contra el
promotor CaMV35S (utilizado para conseguir un nivel constante de expresin de un gen). En el
carril L se muestra la escalera de DNA de100 pb, que permite determinar el tamao de los
fragmentos amplificados (L).

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