UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

INSTITUTO DE QUIMICA E BIOTECNOLOGIA

CURSO DE QUMICA BACHARELADO

ALAN CARLOS BRITO DE OLIVEIRA

MODELAGEM MOLECULAR NA DETERMINAO DO MECANISMO DE

INTERAO DE DERIVADOS TIOFNICOS NA INIBIO DA SNTESE DO
ERGOSTEROL

Macei-AL
2014

ALAN CARLOS BRITO DE OLIVEIRA

MODELAGEM MOLECULAR NA DETERMINAO DO MECANISMO DE

INTERAO DE DERIVADOS TIFENICOS NA INIBIO DA SNTESE DO
ERGOSTEROL

Trabalho de concluso de curso

apresentada ao Instituto de Quimica e
Biotecnologia

da

Universidade

Federal de Alagoas, como requisito

parcial para obteno do grau de
graduado em qumica bacharelado.

Orientador: Tatiane Luciano Balliano.

Macei
2014

Folha de Aprovao

AUTOR: ALAN CARLOS BRITO DE OLIVEIRA

MODELAGEM MOLECULAR NA DETERMINAO DO MECANISMO DE

INTERAO DE COMPOSTOS ANTIFNGICOS NA INIBIO DA SNTESE DO
ERGOSTEROL.
Trabalho de concluso de curso
submetido ao corpo docente do
instituto de qumica e biotecnologia
da Universidade Federal de Alagoas e
aprovada em 04 de dezembro de
2015.

____________________________________________
Prof(a) Dr Tatiane Luciano Balliano

Banca Examinadora:
____________________________________________
Prof(a) Dr Valria Rodrigues dos Santos Malta
____________________________________________
Ma. Sheyla Welma Duarte Silva

Com muito carinho, dedico aos meus pais

Carlos Alberto de Oliveira Junior e Selma Alade de
Brito

de

Oliveira, pela

compreenso,

apoio e

contribuio para minha formao acadmica.

minha incrvel namorada, Kamila Maria de

Oliveira Lima, que sempre me incentivou para a
realizao dos meus ideais, encorajando-me a enfrentar
todos os momentos difceis da vida. Obrigado pela
maravilhosa vida acadmica que passei ao seu lado.

AGRADECIMENTOS
minha companheira, Kamila Maria de Olivera Lima, pessoa cm quem m
partilhar todos os momentos. Cm voc tenho m sentido mais vivo e com uma vontade
crescente de viver ao seu lado. Obrigado pelo carinho, pacincia pr sua capacidade d me
trazer pz n correria d cada semestre.
minha famlia, pr sua capacidade d acreditar investir m mim. Me, su cuidado
dedicao f o que me deu, m alguns momentos, esperana pr seguir. Pai, su
presena significou segurana certeza d qu no estou sozinho nessa caminhada.

A todos os professores, e em especial a minha orientadora Tatiane Luciano Balliano,

por exigir de mim muito mais do que eu supunha ser capaz de fazer. Agradeo pelo desafio de
desvendar a Dinmica Molecular. Muito obrigado por transmitir seus conhecimentos e por
fazer da meu trabalho uma experincia positiva. Obrigado por ter confiado em mim!
Ao grupo de pesquisa do Laboratrio de Cristalografia e Modelagem Molecular
LabCriMM Que me acolheram durante esses trs anos me acompanhando nessa jornada em
busca do conhecimento da qumica no mbito computacional.
Enfim, a todas as pessoas que ouviram os meus desabafos; que presenciaram e
respeitaram o meu silncio; que partilharam este longo passar de anos, de pginas, de livros e
cadernos; que me acompanharam, choraram, riram, sentiram, participaram, aconselharam,
dividiram; as suas companhias, os seus sorrisos, as suas palavras. As alegrias de hoje tambm
so suas, pois o apoio, estmulos e carinhos foram armas para essa minha vitria.

Que os vossos esforos desafiem as

impossibilidades, lembrai-vos de
que as grandes coisas do homem
foram conquistadas do que parecia
impossvel.
Charles Chaplin

RESUMO
Esta pesquisa trata-se do estudo computacional relacionado modelagem molecular frente ao
mecanismo de interao de um derivado tiofnico com foco na inibio da produo do
ergosterol. Faz-se uma abordagem sobre os fungos e as suas influncias aos seres vivos,
destacando as doenas provocadas por estes organismos parasitas. Trabalha-se com
modelagem molecular para identificar o processo dinmico do sistema macromolecular
envolvendo a protena 14-desmetilase e os ligantes em anlise. Como metodologia utiliza-se
as ferramentas tcnicas de docking atravs do programa Glide, desenvolvido pela
Schrondinger, e dinmica molecular atravs do programa NAMD (Not Another Molecular
Dynamics) utilizando a plataforma VMD (Visual Molecular Dynamics) e pesquisa
bibliogrfica. Constatou-se atravs da modelagem molecular a possvel atividade do composto
tiofnico tomando como referncia as interaes do clotrimazol e a protena 14-desmetilase.
Palavras-chaves: Derivados tiofnicos; Modelagem molecular; 14-desmetilase.

ABSTRACT

This research is to study related to the computational molecular modeling opposite the
mechanism of interaction of a thiophenic derivative focused on inhibiting the production of
ergosterol. It makes an approach on fungi and their influences to living beings, highlighting
the diseases caused by these parasitic organisms. It works with molecular modeling to identify
the dynamic process of macromolecular system involving 14-demethylase protein and ligand
in question. The methodology uses the techniques of docking tools Glide through the program
developed by Schrondinger, and molecular dynamics with NAMD (Not Another Molecular
Dynamics) program using the platform VMD (Visual Molecular Dynamics) and literature. It
was found by molecular modeling the possible activity of the compound thiophenic with
reference to clotrimazole interactions and 14-demethylase protein.
Keywords: Tiofnicos derivatives; Molecular modeling; 14-demethylase.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Biossntese simplificada da produo de esteroides essenciais estrutura membranosa das clulas aos
seres vivos.............................................................................................................................................................. 16

Figura 2 - A imagem a esquerda encontra-se a protoporfirina, a estrutura retrata os tomos em cinza (carbono),
vermelho (oxignio), azul (nitrognio), rosa (ferro). A imagem direita, expressa o oxignio ligado a
hemeprotena...........................................................................................................................................................18
Figura 3 - Mecanismo da desmetilao do carbono 14........................................................................................19

Figura 4 - Frmacos derivados do tiofeno utilizados atualmente...........................................................................21

Figura 5 - Representao das coordenadas internas para as interaes de ligaes. (r) representa a distancia entre
os tomos, () representa o ngulo, () representa o ngulo diedro, e () representa a correo do ngulo
diedro.......................................................................................................................................................................26

Figura 6 - Em cinza encontra-se o grupo heme, o composto SB39, e o resduo CYS470. Em azul encontra-se os
resduos que fazem ligaes de hidrognio com o composto SB39........................................................................32

Figura 7 - A esquerda protena emergida em esfera de gua aproximadamente 145.000 tomos, a direita protena

emergida em gua at 10 de distancia da protena, aproximadamente 27.000............................................33

Figura 8 - Distncia mais estabilizada encontrada atravs de dinmica molecular foi de 2,62..........................33

Figura 9 - Distncia mnima encontrada atravs de dinmica molecular para o SB39-HEME foi de 2,32........34

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Inibidores da biossntese de esteris e classificao qumica dos antifngicos....................................17

Tabela 2 - Distncia entre o tomo de ferro do grupamento heme das 14alpha-desmetilase e o atmo de
nitrognio do inibidores depositadas no PDB.........................................................................................................35

Tabela 3 - Ligaes de hidrognio realizadas pelos ligantes.................................................................................37

LISTA DE GRAFICOS
Grfico 1 - Comprimento de ligao para os compostos sb39 e clotrimazol (bond) versus os quadros de
simulaes de dinmica molecular (frame)............................................................................................................35
Grfico 2 - RMSD da simulao de dinmica molecular para o sistema protena ligante....................................36
Grfico 3 - RMSD da simulao dos resduos encontrados a 4 de distancia dos ligantes................................ .36

Grfico 4 - SMD da simulao da dinmica molecular do lanosterol, sb39 e clotrimazol....................................37

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

NAMD - (Not Another Molecular Dynamics)

VMD - (Visual Molecular Dynamics)
14-DM - 14-desmetilase
DM Dinmica Molecular
MM Modelagem Molecular
RMSD - (Root Mean Square Deviation)
CLA (Cutting Line for Analysis)
SMD - (simulao de direcional molecular)
DFN Distncia Ferro-Nitrognio

SUMRIO
1. INTRODUO ........................................................................................................................... 14
1.1. FUNGOS ................................................................................................................................... 14
1.2. ANTIFNGICOS UTILIZADOS NA AGRICULTURA .......................................................... 15
1.3. 14-DESMETILASE................................................................................................................. 17
1.4. DERIVADOS TIOFNICOS .................................................................................................... 20
2. MODELAGEM MOLECULAR ................................................................................................. 22
2.1. O MTODO DE DOCKING ..................................................................................................... 22
2.2. DINMICA MOLECULAR ..................................................................................................... 24
3. OBJETIVO .................................................................................................................................. 28
3.1. GERAL ...................................................................................................................................... 28
3.2. ESPECFICOS ........................................................................................................................... 28
4. MATERIAIS E MTODOS ....................................................................................................... 29
5. RESULTADOS E DISCUSSES ............................................................................................... 31
6. CONCLUSES ............................................................................................................................ 38
7. REFERNCIAS........................................................................................................................... 39

14

1. INTRODUO

A humanidade vem observando o impacto da decomposio de alimentos ocasionado

por fungos parasitas desde quando a agricultura se torna um meio de obteno de alimentos
continua. A histria est repleta de exemplos da devastao causada atravs de fungos
aproveitadores, como: a grande perda de produo de uvas na Frana todos os anos
(GESSLER, 2011) a grande fome que causou um xodo em massa da populao na Irlanda
em 1845 (JAMES, 2005), ou a reduo de 50% da produo de cacau no sul da Bahia
(PACHECO, 2009). Desta maneira, a caracterizao e identificao de fungos parasitas em
alimentos so essenciais para o controle de contaminao destes agentes patognicos, pois a
inteno assegurar a qualidade e segurana dos alimentos, reduzindo as perdas econmicas,
assim como os riscos sade humana e animal.
As doenas ocasionadas pelos fungos em plantaes destroem anualmente cerca de
125 milhes de toneladas das principais fontes de alimento mundial onde as mais afetadas so
o arroz, o milho, o trigo, a batata e a soja (MATTHEW, 2012). Sem todo esse estrago
provocado por fungos parasitas daria para alimentar mais de 600 milhes de pessoas, mais
que suficiente para erradicar a fome na frica e na ndia, segundo a organizao das Naes
Unidas para Alimentao e Agricultura (FAO, 2011).
Dentre os principais fungos oportunistas em alimentos destacam-se os gneros
Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Alternaria e Myrothecium, possuindo uma grande
eficcia em produzir micotoxinas que contaminam desde os gros no campo, durante a
colheita, transporte e armazenagem (BATISTA; FREITAS, 2000). Essas doenas fngicas
representam uma perda de aproximadamente 60 bilhes de dlares por ano somente para as
produes de arroz, trigo e milho. Devido alta capacidade de sobrevivncia quando fora de
seu hospedeiro e sendo altamente resistente a ambientes hostis permite aos fungos uma
propagao em grande escala, tornando-os uma ameaa crescente para a segurana alimentar.
(MAZOYER; ROUDART, 2010)

1.1.

FUNGOS

Os fungos podem ser encontrados de forma abrangente em qualquer ecossistema

situados na natureza, seja nas mais vastas florestas ou no mais profundo dos oceanos. Durante
a metade do sculo XVIII, o mdico e botnico sueco, Carolus Linnaeus, classificou os

15

organismos vivos em dois reinos, Plantae e Animalia. Esta diviso simples dos seres vivos
parecia to bvia e bem definida para organismos macroscpicos que o problema causado
pelos fungos, os quais no pareciam encaixar bem nas plantas, era facilmente esquecido
(PELCZAR; CHAN; KRIEG, 2004). Linnaeus acreditava que os fungos faziam parte do
Reino Plantae devido a sua estrutura semelhante a das plantas e seu modo de vida sem
movimento. Os fungos foram classificados como plantas degeneradas, pois especulava-se
que eram frutos da derivao de plantas que haviam perdido a clorofila e a capacidade de
realizar fotossntese. (TERARIOLI; PALEARI; BAGAGLI, 2010). Este sistema de
classificao deixou de ser satisfatrio, devido a desconfortante classificao dos fungos e a
descoberta de novos organismos com combinaes fisiolgicas pertencentes aos dois grupos
daquela poca, ficou claro que a taxonomia atual no podia ser facilmente aplicada a este
nvel. Ernst Haeckel em 1866 direcionou os fungos e estes seres cuja classificao era
indefinida ou pouco objetiva em um terceiro reino chamado de Protista (CAVALIER, 2005).
Pouco a pouco a descrio da morfologia de fungos foi se tornando mais elaborada, os
micologistas tendo passado da lupa de mo para equipamentos ticos mais sofisticados
conseguiram analisar de forma mais abrangente o comportamento biolgico desses seres. A
partir da sua extraordinria diversidade e suas caractersticas peculiares que em 1969 Um
botnico americano, Robert H. Whittaker separou os fungos em um reino totalmente
independente chamado de Fungi, onde atualmente, so conhecidos mais de setenta mil
espcies de fungos e estima-se que a maioria desses seres ainda no foram descobertos.
(ROCHA, 2015)

1.2.

ANTIFNGICOS UTILIZADOS NA AGRICULTURA

A utilizao de compostos qumicos no tratamento e preveno de diferentes cultivos

na agricultura tem a capacidade de diminuir, significativamente, a proliferao de diferentes
microrganismos que contaminam plantaes. Quando comparada a produo agrcola frente
ao uso de agroqumicos, a utilizao destes compostos tem mostrado resultados superiores em
qualidade e produtividade em contrapartida s plantaes sem defensores agrcolas
(MAZOYER; ROUDART, 2010).
Os compostos com ao antifngica vm sendo utilizados a um longo tempo para
proteo de produes agrcolas, sendo prioritariamente utilizado na proteo de sementes e
cereais. A partir da dcada de 90 em que a quantidade e variedade de agroqumicos atingiram
algum grau de estabilidade e maturidade. O estudo de novos compostos antifngicos vem

16

sendo desenvolvidos visando diminuir cada vez mais a quantidade de fungicidas depositados
no ambiente com a ambio de tornar essa pratica mais segura com o passar do tempo
(PACHECO, 2009).
A maioria dos antifngicos atualmente envolve a inibio da produo de esteroides
que exercem funes essenciais na estrutura da clula, no s nos fungos, mas em todos os
seres que possuem carioteca, tendo a finalidade de prover a integridade estrutural mantendo a
regulao da fluidez, permeabilidade e assimetria da membrana .
Os esteroides mais importantes encontrados nos cinco reinos classificatrios dos seres
vivos diferem de forma significativa (figura 1). A partir do esqualeno, as rotas biossintticas
divergem entre os reinos, produzindo esteroides especficos. Nos Fungos, o esteroide
essencial sintetizado pelo organismo para manuteno da membrana celular o ergosterol,
Nas plantas o principal esteroide encontrado o sitosterol e nos animais encontrado o
colesterol (BENVENISTE, 2004).
Figura 1 - Biossntese simplificada da produo de esteroides essenciais estrutura membranosa das clulas aos
seres vivos.

17

Fonte: Brown (1998)

Devido ao fato dos esteris serem essenciais para a viabilidade e proliferao de

determinadas espcies, a inibio dessa via Biosinttica foi bastante explorada para a
descoberta de inibidores em potencial. Existem quatro vias de inibio metablicas
conhecidas para o ergosterol, dentre elas a mais importante atualmente a inibio da
desmetilao de esteris, devido ao alto grau de seletividade das enzimas produtoras de
esteris diminuindo a toxidade em outros seres que no produzem o ergosterol (URBINA,
1997).
A grande maioria dos frmacos antifngicos que atuam sobre a membrana plasmtica
do fungo, so conhecidos como azis, compostos sintticos heterocclicos divididos em
imidazis e triazis, cuja diferena nos grupos referente ao nmero de nitrognios
encontrado em sua estrutura acarretando diferentes afinidades de ligao no stio ativo da
enzima (MOREIRA, 2010). No total, existem mais de 20 tipos de compostos azis. (tabela 1)
Tabela 1 - Inibidores da biossntese de esteris e classificao qumica dos antifngicos.

grupo
qumico

estrutura qumica

Imidazis

antifngicos comercializados

cetoconazol, miconazol, oxpoconazol, pefurazoato

proclorar, triflumizol, clotrimazol.

azaconazol, bitertazol, bromuconazol, ciproconazol,

difenoconazol, diniconazol, epoxiconazol,
etaconazol, fenbuconazol, fluquinconazol, fluzilazol,
flutriafol, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol,
metconazol, miclobutanil, penconazol, propiconazol,
protioconazol, simeconazol, tebuconazol,
tetraconazol, triadimefon, triadimenol, triticonazol.

Triazis

Fonte: adaptado de FRAC (2007).

1.3.

14 -DESMETILASE

A principal enzima inibida atravs da ao de antifngicos azis a lanosterol 14desmetilase, uma enzima microssmica do citocromo P-450 pertencente famlia (CYP51),
que est diretamente envolvida na converso do lanasterol. Encontrada em diversos seres
vivos, a P450 possuem uma certa semelhana na estrutura do seu interior hidrofbico, mas

18

cada isoforma apresenta substratos especficos e mecanismos nicos de reconhecimento

(DANIELSON, 2002). O citocromo recebe este nome devido ao seu conjunto de protenas
terem uma faixa de absoro espectral com pico em 450 nm, conferindo este nome especfico
para o sistema enzimtico (PACHECO, 2009). A P450 executa um papel importante no
metabolismo de substncias orgnicas e na biossntese de importantes esteroides, lipdios, e
vitaminas. Este conjunto de hemoproteinas est presentes em diversos organismos como:
bactrias, fungos, insetos, peixes, plantas e mamferos. Atualmente o principal foco de estudo
para estas enzimas est direcionado para o mecanismo da produo de ergosterol devido ao
papel essencial que desempenha na mediao da permeabilidade da membrana celular
fngica. Esta protena catalisa em seu stio ativo a remoo do grupo C-14-metil-
do lanosterol. (FRANA. 2014).Este passo de desmetilao considerado como o ponto
inicial na transformao de lanosterol ao ergosterol.
O stio ativo representado pelo grupo prosttico heme, compreendido por uma
complexa estrutura orgnica em anel ligada a um tomo de ferro no estado ferroso (Fe2+). Este
tomo de ferro tem seis ligaes de coordenao, quatro dessas ligaes so feitas com os
tomos de nitrognio do anel pirrlico e duas perpendiculares a estrutura prosttica
(PACHECO, 2009). Uma das ligaes perpendiculares liga o grupo heme ao grupo tiol da
cistena (CYS470) amarrando o grupo heme e a protena pelo tomo de ferro, e a ultima
ligao perpendicular feita pelo metal do grupo heme faz uma ligao de forma reversvel
com o oxignio.(Figura 2).
Figura 2 - A imagem a esquerda encontra-se a protoporfirina, a estrutura retrata os tomos em cinza (carbono),
vermelho (oxignio), azul (nitrognio), rosa (ferro). A imagem a direita, expressa o oxignio ligado a
hemeprotena.

19

Fonte: elaborado pelo autor.

A catlise efetuada pela enzima 14-DM na desmetilao do lanosterol ocorre em trs

passos, em cada passo necessrio uma molcula de oxignio e uma de NADPH. Durante os
primeiros dois passos ocorre uma tpica monoxigenao no grupamento 14-metil, onde um
tomo de oxignio ser incorporado ao lanosterol e o outro tomo ser reduzido gua,
resultando assim, a converso do esterol em carboxialcool no primeiro passo, e
carboxialdeido no segundo passo. No ultimo passo, o grupo 14-metil extrado na forma de
acido frmico, e a sua sada causa uma dupla ligao na estrutura do produto desmetilado.
(AOYAMA, 2005)
Figura 3 - Mecanismo da desmetilao do carbono 14.

20

Fonte: Department of Bioinformatics, Faculty of Engineering, Bioscience.

Outras molculas que tambm podem fazer interaes com o atmo de ferro de
grupamentos heme so as de dixido de carbono, ies cianeto, oxido ntrico e monxido de
carbono. A afinidade entre a macromolcula e estes compostos so cerca de 600 vezes maior
do que pelo oxignio, exeto o CO2 que a afinidade de ligao com o grupo heme similar ao
do O2. Quando estes compostos so inseridos em grandes quantidades em organismos vivos
ocorre em envenenamento e asfixia destes seres, devido ao declnio do transporte de oxignio
por via de hemeproteinas. Os compostos citados acabam ligando-se irreversivelmente a
estrutura do grupamento heme causando a inatividade da protena dentro da estrutura celular
(LEVES, 2006).
Partindo deste conceito, a sntese de novas substncias bioativas baseadas nestas
molculas torna-se bastante promissor para criao de compostos inovadores que afetem
organismos parasitas.

1.4.

DERIVADOS TIOFNICOS

Mesmo com a grande hegemonia expressiva direcionada ao estudo de grupos azlicos

como antifngicos inibidores da enzima 14-demethylase, h uma procura por novos
compostos inibidores que possam ser mais eficientes, seguros, que reduzam os efeitos
colaterais e sejam mais especficos no alvo do tratamento fngico. Nesse contexto, a qumica
medicinal, atravs dos planejamentos e modificaes moleculares tem contribudo para a
maior parte das novas descobertas atravs da sintetizao medicinal de compostos
antifngicos.
A estrutura do anel tiofnico tornou-se atrativa para qumica medicinal a partir do
momento em que vrias atividades biolgicas foram reconhecidas a esta classe de compostos,
pois apresenta grande potencial para inibir o crescimento de microrganismos. De acordo com
a literatura, os derivados destes compostos apresentam atividades biolgicas como: antihipertensivo, antibitico, antipisictico, antinflamatrio, analgsico, tratamento para
osteoporose, antiviral e especialmente antifngicas (PINTO, 2008).
O tiofeno consiste em um heterocclico aromtico pentagonal, onde um carbono
substitudo por um tomo de enxofre e um par de ligaes duplas. O tiofeno considerado
aromtico, embora os clculos tericos sugiram que o grau de aromaticidade seja menor do
que a de benzeno (SOLOMONS, FRYHLE. 2005). Uma das caractersticas fundamentais da

21

molcula de tiofeno a possibilidade de sofrer modificaes estruturais em todos os carbonos

(posies 2, 3, 4 e 5) da molcula enquanto o tomo de enxofre resiste a alquilao e
oxidao. Portanto, a oxidao de um anel de tiofeno possui uma gama de opes reacionais
para o processo de sintetizao de seus derivados fazendo com que estes compostos
desempenhem um papel crucial na ativao metablica de vrias drogas (SOUZA, 2011).

Figura 4 - Frmacos derivados do tiofeno utilizados atualmente.

Fonte: adaptado de OLIVEIRA, T. B. (2010).

Estes derivados possuem uma propriedade incomum quando comparado a outros

compostos com atividades farmacolgicas devido a sua toxicidade seletiva; ou seja, eles tm a
capacidade de ferir ou matar um microrganismo invasor, reduzindo ou inibindo, os efeitos
colaterais reproduzidos no hospedeiro (PINTO, 2008).

22

2. MODELAGEM MOLECULAR

A disponibilidade de programas computacionais no mbito de simulao grfica vem

alcanando um avano extraordinrio na rea de cincias biolgicas com relao a grande
demanda de pesquisas em nveis micromoleculares. Atualmente existe uma grande variedade
de sistemas biolgicos determinados e disponibilizados atravs da internet, facilitando a
descoberta de novos inibidores importantes e gerando a descoberta de novas molculas
bioativas. Os softwares disponibilizam ferramentas fundamentais para analise dessas
substancias conquistando informaes da atividade biolgica de uma forma rpida e precisa
atravs da analise de propriedades fsico-quimicas do sistema biolgico estudado. Com um
conhecimento computacional amplo pode-se simular a atividade dinmica, desde uma
pequena molcula de gua at sistemas mais complexos como uma molcula de DNA ou at
mesmo uma membrana de uma clula. Mas, ainda existe uma grande dificuldade de obteno
destes programas devido ao custo elevado para sua aquisio forando os pesquisadores a
utilizar programas com um nmero de funes limitas.

2.1.

O MTODO DE DOCKING

Os primeiros algoritmos de docking comearam a ser desenvolvidos por Kuntz no

incio da dcada de 80, hoje em dia possui papel fundamental em pesquisas de
desenvolvimento sinttico de frmacos. O aperfeioamento dos algoritmos utilizados em
docking segue de forma contnua, constituindo uma rea de pesquisa computacional ativa
(MAGALHES. 2006).

23

O docking estima a orientao preferencial de uma pequena molcula, em relao a

uma protena visando uma conformao otimizada ao formar um complexo estvel de modo
que a energia livre do sitema seja minimizada.
Os primeiros programas desenvolvidos com algoritmos de docking tratavam tanto o
receptor quanto o ligante como molculas rgidas, considerando apenas os graus de liberdade
translacionais e rotacionais da molcula lingante (docking rgido). Estes algoritmos estavam
muito longe de representar a real forma de ligao entre ligante e receptor, mas ainda so
utilizados atualmente na triagem (screening) de grandes bibliotecas de ligantes para a
identificao de compostos bioativos devido ao fator de serem extremamente rpidos nas
anlises (LENGAUER, RAREY. 1996).
Atravs do desenvolvimento incessante de novos programas computacionais, foram
desenvolvidos novos algoritmos que alm de considerar os graus de liberdade translacionais e
rotacionais puderam ser incrementadas a flexibilidade do ligante (docking flexvel). Desta
forma, o docking flexvel conseguiu aproximar qualitativamente o sistema receptor-ligante
quando comparado ao docking rgido, mas leva um perodo de tempo maior para executar
anlise (TEAGUE, 2003).
Nas duas classes de algoritmos mencionados, a estrutura da protena considerada
como rgida, devido ao grande numero de tomos existentes na estrutura, pois se fosse
utilizado algoritmos flexveis levaria um tempo indeterminado para realizar os clculos
relativos ao docking. Durante o reconhecimento molecular dentro do sistema, o ligante sofre
mudanas conformacionais alterando sua forma para poder se adequar ao receptor,
procurando assim, um mnimo de energia (EID. 2013).
As conformaes flexveis para o ligante podem ser expressas atravs da equao 1,
onde considera a funo potencial de ligao (1), a funo potencial do ngulo (2), energia de
rotao de diedros (3), energia de interao eletrosttica (4), interao de Van der Waals (5)
(SHIVAKUMAR, 2010).

[1]

Para o complexo, uma outra equao regida para as interaes entre ligante (flexvel)
e protena (rgido), a equao 2 analisa as interaes geradas entre protena e ligante,
procurando assim, o complexo de menor energia. As interaes descritas abaixo calculam as

24

interaes do sistema correspondentes interao de van der Waals (W vdw), ligaes de

hidrognio (Whbond) e interaes eletrostticas (Welec) (SHIVAKUMAR, 2010).

(2)
O software (Glide) utilizado para o docking deste trabalho foi desenvolvido pela
empresa americana Schrdinger, esta empresa desenvolve softwares para auxiliar a descoberta
de novos frmacos na indstria farmacutica, biotecnologia e pesquisas acadmicas. A
empresa oferece produtos que vo desde programas simples de visualizao molecular at um
conjunto completo de modelagem molecular e desenho de compostos, incluindo um dos
melhores algoritmos de docking da atualidade. Ele tambm fornece produtos para anlise e
investigao, incluindo modelagem e simulaes de pequenas molculas, modelagem de
sistemas macromoleculares e visualizaes em 2D e 3D (FRIESNER, 2010).
Maestro

interface

unificada

para

todos

os

programas

de

Schrdinger. Impressionantes capacidades de renderizao, uma grande seleo de

ferramentas de anlise, e um design de fcil utilizao se combinam para tornar Maestro um
ambiente de modelagem verstil para todos os pesquisadores. A Schrdinger disponibiliza a
plataforma Maestro gratuitamente, por um tempo determinado e com todas as funes do
programa, para fins de pesquisa acadmica.

2.2.

DINMICA MOLECULAR

A simulao atravs de dinmica molecular uma das melhores tcnicas

computacionais para analise de comportamento de sistemas biolgicos macromoleculares. As
simulaes de DM, juntamente com docking, tm contribudo de forma extremamente
significativa para o desenvolvimento racional de frmacos, enquanto o docking procura
determinar a conformao real de um ligante com o receptor, a simulao computacional
procura o equilbrio dinmico entre a macromolcula e o ligante. Enquanto o docking
considera o receptor sendo uma molcula rgida, a dinmica molecular considera o sistema
(proteina-ligante) como flexvel (LEACH, 2001).

25

O fundamento das simulaes computacionais parte dos princpios da Mecnica

Molecular onde as molculas so tratadas como uma poro de tomos unidos por foras
harmnicas e elsticas (foras newtonianas). A dinmica molecular submete esse sistema a
uma sequencia de variveis estatsticas, a qual tem a funo de registrar a variao de
propriedades macroscpicas (presso, energia interna, volume, temperatura, entropia, etc) a
partir do comportamento do sistema no mbito microscpico (GUNSTEREN, 1990).
O comportamento microscpico dos sistemas biomoleculares depende de parmetros
para serem comparados com sistemas reais, surgindo o desenvolvimento de campos de foras
de maneira independente e com todos os conjuntos de parmetros especficos para gerar
simulaes comparadas ao ambiente molecular. A escolha do campo de fora depende, em
grande parte, do sistema a ser estudado e das propriedades que sero investigadas. No caso de
sistemas biomoleculares, os campos de fora mais utilizados so CHARMM, GROMACS, XPLOR, AMBER, OPLS, CVFF, entre outros (RAPPE, 2012).
A confiabilidade dos resultados baseada na elaborao de um campo de fora com
parmetros bem definidos. No caso do algoritmo de simulao computacional NAMD
utilizado linguagem de parmetros CHARMM, considerado como um dos melhores
parmetros para simulaes de sistemas macromoleculares.
Partindo do argumento de que as molculas interagem entre si, o calculo das trajetrias
atmicas so baseados nas foras intermoleculares. Para descrever o movimento gerado
atravs dessas foras resultantes pode ser interpretado basicamente pela segunda lei de
Newton obtendo assim a velocidade e a posio de cada partcula que compe o sistema em
cada instante da simulao (HUMPHREY, 1996) O potencial de interao entre as partculas
que compe o sistema calculado com base em parmetros tabelados para cada uma delas e
ento calcula-se a fora resultante sobre cada partcula atravs do gradiente do potencial,
Onde (Fi) a fora resultante sobre a partcula (i) e o potencial (Ui) a soma de todas as
interaes de pares entre a partcula (i) e as demais partculas do sistema (equao 3)
(MACKERELL. 2004).

(3)
O potencial total (Ui) est relacionado com a energia de estiramento de ligaes,
deformaes angulares, rotao de diedros e interaes no-ligantes para cada partcula (i)
(equao 4).

26

(4)

Cada potencial parcial determinado por equaes independentes, a representao

destas equaes expressa na figura:

Figura 5 - Representao das coordenadas internas para as interaes de ligaes. (r) representa a distancia entre
os tomos, () representa o ngulo, () representa o ngulo diedro, e () representa a correo do ngulo diedro.

Fonte: University of Illinis, MacKerell, A. D. J. (2004)

O potencial de ligao (equao 5), corresponde a energia gerada pela ligao entre
dois tomos onde so tratados como osciladores harmnicos, onde kb considerado como a
constante de mola, b a distancia final e b0 a distancia inicial.

U (bond) = Kb (b - b0) 2

(5)

O potencial angular (equao 6), corresponde a energia gerada pelo ngulo formado
entre trs tomos ligados por ligaes covalentes, onde K a constante de mola, o ngulo
final e 0 o ngulo inicial.

U(angle) = K ( 0) 2

(6)

27

O potencial de diedros (equao 7), corresponde a toro de ligaes entre quatro

tomos ligados simultaneamente, onde K a constante de mola e o ngulo entre o plano
que contm os trs primeiros tomos no diedro e o plano que contm os trs ltimos.

U(diedro) = K (1 + cos(n - ))

(7)

O potencial de imprprios (equao 8), utilizado para limitar as deformaes entre um

tomo e trs tomos ligados a ele. O k a constante de mola e o ngulo entre o plano que
contm os trs primeiros tomos e o plano que contm os trs ltimos.

U(imprprio) = k ( 0) 2

(8)

O potencial de interaes (equao 9), so expressas pelo clssico potencial de

Lennard Jones onde serve como base para os parmetros das foras de van der Waals. O ij a
profundidade do potencial entre a barreira atrativa e a repulsiva, e o rij a distncia finita na
qual o potencial interpartcula zero.

U(interaes) = ij [(Rminij/rij)12 -2(Rminij/rij)6]

(9)

28

3. OBJETIVO
3.1.

GERAL
Efetuar estudos computacionais no composto sb39, no antifngico clotrimazol
e no esteroide lanosterol, para o aprofundamento terico do mecanismo de interao
do candidato a inibidor da protena 14alfa-desmetilase.

3.2.

ESPECFICOS
a) Realizar a dockagem do composto sb39 e clotrimazol, e assim poder
selecionar a melhor conformao das molculas no sistema protena-ligante. O
programa a ser utilizado o (Glide) localizado dentro da plataforma Maestro.

b) Desenvolver os arquivos de topologia e parmetros para o sb39, o

clotrimazol e lanosterol. Arquivos necessrios para simular um ambiente real em
mbito computacional.

c) Executar o algoritmo de dinmica molecular a fim de determinar a forma de

ligao entre os compostos citados e a protena. Simular a movimentao destes
compostos pela superfcie de entrada da protena, deslocando-o at o stio de ligao
onde se encontra o grupo heme.

29

4. MATERIAIS E MTODOS
A proteina utilizada no docking deste trabalho foi a 14alfa-desmetilase encontrada no
banco de dados de estruturas cristalogrficas online (Protein Data Bank - PDB), no site
identificada pelo cdigo 4LXJ. O mtodo de obteno desta proteina foi a cristalografia de
raio-X possuindo uma resoluo de 1.90, esta molcula encontrada no pdb complexada
com uma molcula de oxignio e uma molcula de lanosterol.
A estrutura sb39 foi obtida atravs de cristalografia de raio-X enquanto a estrutura do
clotrimazol foi desenhada no programa ChemDraw Ultra 12.0 e a estrutura tridimensional foi
otimizada no programa Chem3D Pro 12.0 e salva no formato PDB.

A protena passou por um processo de preparao antes do docking onde retirado a

molcula de lanosterol e oxignio, desocupando o sitio de ligao para que fosse calculado o
mnimo de energia entre protena-clotrimazol e protena-sb39.
A plataforma Maestro foi utilizada para preparar e analisar as simulaes
computacionais, adicionando hidrognios polares necessrios para o calculo de potenciais
entre inibidor e molcula alvo, e identificar as ligaes rotacionveis do ligante.

30

A partir deste ponto, foi observado atentamente onde o ligante estabeleceu melhor
contato com a macromolcula e posteriormente gerado os mapas tridimensionais de interao
entre macromolcula e inibidor.
As localizaes de melhor acomodao dos ligantes foram utilizadas como ponto de
partida para a minimizao de energia e as simulaes computacionais.
No prximo passo gerado o arquivo de topologia dos ligantes atravs das
coordenadas obtidas pelo docking, sendo de fundamental importncia para gerar a estrutura do
sistema biolgico (arquivo PSF), coordenao dos hidrognios e distribuio das cargas
parciais atmicas na macromolcula.
Depois da criao do arquivo PSF, ser gerado o arquivo de parmetros para
simulao computacional, onde ser utilizado um servidor online de criao de parmetros
(PRODRG) e depois adapta-lo para ser utilizado atravs do NAMD.
No programa VMD, os complexos clotrimazol-protena, lanosterol-protena e sb39protena foram mergidos em gua (solvatao) com uma distancia de 50 da superfcie da
protena para garantir a estabilidade dos sistemas macromoleculares em questo.
Posteriormente foi executado uma funo de cuttof (excluso de tomos de gua a 10 da
protena) de 10. Este procedimento far com que o tempo de simulao diminua
drasticamente sem interferir nas propriedades do sistema, pois com a funo Cutting Line for
Analysis (Linha de Corte Para analise) os sistemas em questo passaram de 145.000 tomos
para em torno de 27.000 tomos.
Para a minimizao de energia do sistema foi utilizado a plataforma VMD sendo a
intermediadora das simulaes computacionais de dinmica, em que o algoritmo NAMD
utilizado para calcular os parmetros contidos no sistema protena-ligante. A simulao de
preparao foi executada em 500 passos com o tempo de 50ps (picosegundos), a fim de
promover a estabilizao do sistema com a gua adicionada atravs da solvatao. A
simulao de minimizao foi executada em 5ns (nanosegundos) estabilizando as interaes
de van de Waals e eletrosttica do sistema.
Depois do sistema estabilizado possvel calcular o RMSD (Root Mean Square
Deviation) da simulao, que serve para medir o grau de estabilidade do sistema frente a sua
condio inicial.
Para finalizar, utiliza-se o sistema de direcionais SMD para simular a entrada dos
compostos na protena e analisa o RMSD da direcional para ver qual estrutura tem um maior
grau de afinidade com o canal da protena at a chegada do sitio ativo.

31

5. RESULTADOS E DISCUSSES
As analises de acoplamento molecular (doking) realizadas tm por objetivo
compreender o modo de interao de 2 compostos frente ao sitio ativo da enzima lanosterol
14alfa-desmetilase.
Atravs da realizao do docking frente protena 14alfa-desmetilase para os
compostos clotrimazol e sb39 as conformaes estavam localizadas no stio ativo da protena
e foi verificado que o grupamento azlico do clotrimatozol e a nitrila do composto sb39 tm a
direo voltada para o tomo de ferro do grupo heme.
Considerando a melhor conformao encontrada para o composto sb39, foi observada
uma distancia de 3.68 entre a nitrila e o tomo de ferro atravs do docking e possveis
ligaes de hidrognio entre os resduos GLY310, MET509, SER382, PHE384 e o ligante. O
limite mximo estabelecido para as interaes foi fixado em 2,0 e o mximo em 3,0 .
Figura 6 - Em cinza encontra-se o grupo heme, o composto SB39, e o resduo CYS470. Em azul encontra-se os
resduos que fazem ligaes de hidrognio com o composto SB39.

32

Fonte: elaborado pelo autor.

Considerando a melhor conformao encontrada para o clotrimazol, foi observada

uma distancia de 3.55 entre o nitrognio reativo do grupo azlico com o tomo de ferro e
possveis ligaes de hidrognio entre os resduos GLY310, TYR140 com o clotrimazol.
Figura 6 - em cinza encontra-se o grupo heme, o clotrimazol, e o resduo CYS470. Em azul encontra-se os
resduos que fazem ligaes de hidrognio com o clotrimazol.

33

Fonte: elaborado pelo autor

As ligaes de hidrognio entre o receptor e o inibidor foram tidas como indicativos

para estabilizao do complexo, por serem importantes interaes no-covalentes existentes
nos sistemas biolgicos, sendo responsveis pela estabilidade das conformaes bioativas.
Com a aplicao do docking, os sistemas biomoleculares entre protena-clotrimazol,
protena-sb39 e protena-lanosterol (encotrado em complexo com a estrutura 4LXJ
diretamente do PDB), foram submetidas solvatao em uma esfera de gua de 50 de
dimetro para incorporar todo o sistema sem que nenhuma parte da protena fique fora do
ambiente aquoso.
Para reduzir drasticamente o tempo de simulao e estabelecer um parmetro de
analise satisfatrio para o sistema, foi utilizado um artificio chamado de CLA (Cutting Line
for Analysis) excluindo tomos de gua a uma distancia de 10 da protena.
Figura 7 - A esquerda protena emergida em esfera de gua aproximadamente 145.000 tomos, a direita protena

emergida em gua at 10 de distancia da protena, aproximadamente 27.000.

34

Fonte: Elaborada pelo autor.

Com base nas simulaes de dinmica molecular para os trs sistemas moleculares
pod-se perceber uma variao de conformaes no sitio ativo da protena evidenciando uma
acomodao da estrutura macromolecular com os ligantes descritos, isto acontece devido ao
fato da dinmica molecular considerar a protena alvo como uma estrutura flexvel.
Nas acomodaes, ocorreram diversas alteraes no stio de ligao para estabilizar os
compostos submetidos ao docking com isso, modificou-se o comprimento de ligao do
nitrognio reativo dos compostos frente ao ferro do grupo heme.
Figura 8 - Distncia mais estabilizada encontrada atravs de dinmica molecular foi de 2,62.

Fonte: elaborado pelo autor

35

Aps a estabilizao do sistema clotrimazol-protena, as variaes do comprimento de

ligao entre o ferro e o nitrognio esto entre 2,60 a 2,66. A posio mais estvel
encontrada para o sistema encontrou uma distancia de 2,62.
Figura 9 - Distncia mnima encontrada atravs de dinmica molecular para o SB39-HEME foi de 2,32.

Fonte: elaborado pelo autor

No sistema SB39-protena as variaes do comprimento de ligao entre o nitrognio

do ligante com o ferro do grupo heme esto compreendidas entre 2,29 a 2,34. A
conformao mais estvel verificada atravs da estabilizao admite um valor de 2,32 para a
estrutura do sistema.
Nos dois sistemas analizados, o sitio de ligao da hemeproteina sofre deformaes
para acomodar de forma mais satisfatria os ligantes em seu interior, otimizando assim, os
dados obtidos atravs do docking. Aps as analises observa-se um comprimento de ligao
menor para o composto sb39 do que para o clotrimazol.
A estabilizao desta ligao ferro-nitrognio tpica para compostos azis o que j
era esperado para o clotrimazol, no entanto, para o nitrognio do sb39 verifica-se uma
relevante afinidade pelo ferro do grupo heme de acordo com a dinmica molecular.
De acordo com os comprimentos de ligaes definidos na literatura, os compostos
sb39 e clotrimazol esto dentro da zona aceitvel Para realizar uma ligao coordenada com o
tomo de ferro do grupo heme. Visto que o comprimento de ligao do sb39 est prximo do

36

comprimento de ligao do fluconazol, um dos melhores inibidores da ao da 14alphadesmetilase. (Tabela 2).

Tabela 2 - Distncia entre o tomo de ferro do grupamento heme das 14alpha-desmetilase e o atmo de
nitrognio do inibidores depositadas no PDB.
Estrutura
PDB

DFN*

Inibidores

2W0B

2.11

3-{[(4-metilfenil)sulfonil]amino} propil piridina-4-ilcarbamato

2W0A

2.17

n-[(1s)-2-metil-1-(piridina-4-ilcarbamoil)propil]ciclohexanecarboxamida

2W09

2.19

Cis-4-metil-n-[(1s)-3-(metilsulfanil)-1-(piridina-4-ilcarbamoil)propil] nocarboxamida

1EA1

2.34

Fluconazol

1E9X

2.40

fenillimidazol

2CIB

2.48

(2s)-2-[(2,1,3-benzotiadiazol-4-ilsulfonil)amino]-2-fenil-n-piridina-4-ilacetamida

2CI0

2.68

(2r)-2-fenil-n-piridina-4-ilbutanamida

Fonte: PACHECO, A. G. M. 2009.

DFN*: distancia em angstrom medida entre o tomo de ferro do grupo heme e o nitrognio do inibidor das
14alpha-desmetilase depositadas no PDB.

De acordo com o grfico da avaliao do comprimento de ligao dos compostos,

observa-se uma estabilizao do comprimento de ligao em aproximadamente 38 frames. A
pequena variao do comprimento de ligao expressa uma interao muito forte entre F-N
que caracterstica de uma ligao coordenada de acordo com a dinmica molecular.
Grfico 1 - Comprimento de ligao para os compostos sb39 e clotrimazol (bond) versus os quadros de
simulaes de dinmica molecular (frame).

ligao Ferro-Nitrognio

4,00
3,80

Clotrim
SB39

3,60

Bond

3,40
3,20
3,00
2,80
2,60
2,40
2,20
2,00
0

10

20

30

40

50

60

Frames
Fonte: elaborado pelo autor.

70

80

90

100 110

37

Atravs do calculo da oscilao da posio inicial da protena foi gerado o grfico

RMSD indicando uma maior variao da posio inicial para o sistema protena-sb39
estabilizando-se em aproximadamente 1,7nm, para o sistema protena-clotrimazol a
estabilizao ocorre em 1,5nm. Com relao ao tempo, os dois sistemas iniciam o grau de
estabilizao em 1,7 ns.
Grfico 2 - RMSD da simulao de dinmica molecular para o sistema protena ligante.

Fonte: elaborado pelo autor.

Foi realizado o rmsd para os resduos a 4 de distancia dos ligantes a fim de plotar o
grfico referente oscilao do stio ativo frente aos compostos. Observa-se uma oscilao
maior para o composto sb39 na acomodao do sitio ativo da protena em relao ao
clotrimazol.
Grfico 3 - RMSD da simulao dos resduos encontrados a 4 de distancia dos ligantes.

Fonte: Elaborado pelo autor.

38

As ligaes realizadas pelos ligantes esto expressas na tabela 2. Os critrios

utilizados para observar as ligaes de hidrognio realizadas pela simulao foi que a
distancia entre o os tomos seria de no mximo 3 e o ngulo entre os tomos maiores que
120. Com a dinmica molecular e a modificao do sitio ativo para adaptao dos ligantes no
grupamento heme, observado uma maiores quantidades de ligaes de hidrognio para o
clotrimazol do que pelo composto sb39, provavelmente devido a melhor acomodao do
clotrimazol no sitio de ligao.
Tabela 3 - Ligaes de hidrognio realizadas pelos ligantes.

Resduos
GLY310
MET313
TYR140
LEU380
MET509

clotrimazol

Sb39

96.37%
97.55%
89.00%
-----98.22%

83.65%
--------95.00%
-----

Fonte: Elaborado pelo autor.

Finalizando o estudo computacional, foi realizado uma simulao de direcional

molecular (SMD) para analisar a energia envolvida na entrada dos compostos pelo canal da
protena at o sitio ativo. Para esta simulao foi utilizado a direcional do lanosterol como
energia de referencia versus os resduos do canal da protena para comparar estes parmetros
de energia com os ligantes utilizados.
Grfico 4 - SMD da simulao da dinmica molecular do lanosterol, sb39 e clotrimazol.

Fonte: elaborado pelo autor.

39

6. CONCLUSO

A descoberta de novos compostos antifngicos que possuam ao frente 14alfadesmetilase (CYP51) apresenta-se como um grande desafio na rea de pesquisas cientificas.
Devido ao amplo espectro de ao de compostos azlicos aplicado no tratamento de doenas
parasitarias, especialmente, fngicas.
O estudo de modelagem molecular realizado teve o objetivo de analisar o composto
sb39 em comparao com um antifngico utilizado atualmente e comparar as interaes entre
estes compostos. Com relao s interaes, foi verificado uma proximidade interessante
entre a ligao Ferro-Nitrognio para o composto sb39 estabilizada em 2,32, este
comprimento de ligao indica que possivelmente existe uma ligao coordenadas neste
espao de interao molecular, sendo uma caracterstica importante para inibio da 14alfadesmetilase.
Foi analisado o RMSD para os resduos encontrados no stio ativo da protena a 4 de
distancia dos ligantes durante a estabilizao do sistema molecular. Para o clotrimazol, foi
observado uma leve acomodao do ligante frente ao stio ativo da protena representado pela
suave variao de localizao dos resduos representados pelo grfico 3. Para o composto
sb39 estima-se que o stio ativo teve grandes deformaes para acomodao do ligante
ocasionando um alto grau de variao da posio inicial da protena, desfavorecendo boas
interaes no ambiente de ligao.
As ligaes de hidrognio identificadas atravs de dinmica molecular indicam uma
quantidade maior de ligaes do composto clotrimazol com o stio ativo da protena,
acarretando uma melhor acomodao e possivelmente maior estabilizao de ligao no stio.
De acordo com o grfico de direcionais, foi verificado um aumento de fora de
deslocamento mediante cada composto utilizado, o lanosterol foi utilizado como base para os
estudos de direcionais calculados atravs de dinmica. O composto sb 39 obteve altas taxas de
fora aplicadas ao movimento direcional mostrando-se desfavorvel o acesso ao stio de
ligao. De acordo com os padres especficos estipulados pelo ncleo de desenvolvimento da
universidade de Illinois, estima que uma fora de deslocamento maior que 600 pN no
favorvel a direcional natural de deslocamento sobre canais de protenas.
Os resultados obtidos estimam que o composto sb39 comparado aos dados do
composto clotrimazol tenha uma maior afinidade com o ferro localizado no centro do grupo
heme, contudo, o composto sb39 demonstra maior dificuldade de deslocamento at a chegada
no stio de ligao.

40

7. REFERNCIAS

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