UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARING

CENTRO DE CINCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

O efeito de pH na estabilidade de derivados Benzoporfirnicos

de anel B em meio gua/etanol

Andr Luiz Tessaro

Orientador: Prof. Dr. Noboru Hioka

Maring, Junho de 2005

... E nunca considerem seu estudo como

uma obrigao, mas como uma
oportunidade invejvel de aprender sobre a
influncia libertadora da beleza no domnio
do esprito, para o seu prazer pessoal e para
o proveito da comunidade qual pertencer
o seu trabalho futuro.
(Albert Einstein)

Dedico aos meus pais, Aldo Natal Tessaro

e Irene Ghiraldi Tessaro, pelo amor e
confiana sempre presentes em todos os
momentos de minha vida.
s minhas irms Andra, Ana Paula e
Adriana pelo amor e amizade.
A Ana Maria pelo amor e apoio constantes.

Agradeo
-

A Deus por ter me dado fora e perseverana para a realizao deste

estudo.

Ao professor Dr. Noboru Hioka, pela orientao, incentivo, confiana e

amizade durante a realizao deste trabalho.

Ao professor Dr. Vagner Roberto de Souza pelo apoio e discusses sempre

muito proveitosas.

Ao professor Dr. Edgardo Alfonso Gmez Pineda

pelas discusses e

sugestes.
-

Aos professores: Florngela, Ourides, Silvana, Rosana, Ailton, Cludio pelo

apoio e amizade.

Ao laboratrio de anlises de gua pelas medidas de pH realizadas.

Em especial aos amigos Tup, Rodrigo e Daniela pelo apoio, amizade e

contribuio para este trabalho.

Aos amigos do laboratrio: Rafael, Augusto, Vagner, Fernando, Bruno,

Carlos, Adriana, Joo Paulo, Simone e a todos os colegas do bloco 31.

todos

os

professores

do

programa

de

Ps-Graduao,

pelos

conhecimentos transmitidos durante o curso de Mestrado.

-

Ao Claudemir pela pacincia e s demais pessoas do departamento de

qumica que de uma forma ou de outra colaboraram para este trabalho.

A CNPq pela bolsa concedida.

A Fundao Araucria (SETI-Pr) pelo apoio financeiro.

NDICE

RESUMO.....................................................................................................................

ABSTRACT.................................................................................................................

iii

1- INTRODUO.....................................................................................................

1.1- Propriedades gerais necessrias aos frmacos candidatos a uso em TFD......

1.2- Caractersticas fotofsicas..................................................................................

1.3- Agregao e seletividade..................................................................................

1.4- Alguns compostos para a TFD e suas propriedades.........................................

1.5- Definio de pKa...............................................................................................

10

1.6- A acidez de compostos orgnicos.....................................................................

12

1.7- Os derivados de anis B de interesse...............................................................

14

2- OBJETIVOS.........................................................................................................

16

3- MATERIAIS E MTODOS...................................................................................

17

3.1- Materiais............................................................................................................

17

3.2- Mtodos.............................................................................................................

17

3.3- Equipamentos....................................................................................................

21

4- RESULTADOS E DISCUSSO...........................................................................

22

4.1- Determinao de pKa.........................................................................................

31

4.2- Planejamento Fatorial 23...................................................................................

40

4.3- Estudo Cintico.................................................................................................

47

5- CONCLUSES....................................................................................................

55

6- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.....................................................................

57

i
RESUMO
A busca por novos medicamentos com possibilidades de uso em Terapia
Fotodinmica (TFD), uma modalidade relativamente nova no tratamento mdico
que emprega um composto fotossensvel e luz, vem crescendo nos ltimos anos
em virtude desta poder ser aplicada a uma ampla gama de doenas, entre os
quais o cncer.
No presente trabalho estudaram-se as propriedades de derivados
benzoporfirnicos de anel B (DiesterB e B3B), candidatos potenciais para
aplicao em TFD, em misturas de gua/etanol. Ambos compostos, clorinas,
possuem grupamentos cido-base, dessa forma, determinaram-se seus pKas em
diversas misturas de gua/etanol. Adicionalmente verificou-se a estabilidade das
espcies com diferentes graus de protonao desses possveis frmacos,
detectando a importncia de algumas variveis experimentais no processo de
estabilizao do composto na forma monomrica terapeuticamente foto-ativa.
Nossos estudos mostraram que o pKa dos nitrognios pirrlicos dos
compostos DiesterB e B3B, em 40 e 60 % de gua, ao redor de 3,3 indicando
que grupos perifericamente ligados estrutura porfirnica pouco afetam esta
propriedade. No composto B3B, que alm dos nitrognio pirrlicos possui um
grupo carboxlico perifrico, os estudos apontaram um pKa aproximado de 5,7. Em
porcentagens maiores que 60 % de gua, observou-se variao da fora cida. O
aumento da quantidade de gua favorece a acidez dos grupos amnicos e diminui
a acidez do grupo carboxlico, resultados analisados por entalpia e entropia.

ii
O planejamento fatorial 23 do mtodo quimiomtrico, utilizado em trs
regies independentes de pH com nveis inferior e superior de concentrao,
tempo e teor de gua, revelou que a varivel mais significativa na estabilidade da
forma monomrica foto-ativa do B3B a porcentagem de gua em etanol. O
aumento desta varivel em pH= 4,1 causou uma acentuada reduo no coeficiente
de absortividade molar aparente da molcula, inclusive variando com o tempo.
Neste pH tem-se a presena majoritria da espcie neutra de B3B ocasionando
forte processo de auto-agregao.
Estudos cinticos revelaram que a agregao transcorre segundo um
mecanismo auto-cataltico que interpretado por um mtodo no convencional
baseado na Teoria do Caos. Prope-se que inicialmente ter-se-ia a formao de
pequenos ncleos de agregao que catalisariam uma reao posterior originando
agregados maiores. Os dados obtidos com o tratamento cintico demonstram que
em regies intermedirias de pH, onde a molcula de B3B encontra-se neutra, a
agregao ocorre de forma mais rpida e acentuada reforando as indicaes
obtidas no tratamento estatstico.
Um resultado importante para a aplicao teraputica foi detectar o
aumento do pKa do grupo carboxlico em contedos maiores de gua. Apesar de
nas formulaes utilizar-se de pH prximo ao fisiolgico, conhecido que tecidos
em rpida proliferao tm aumento micro-local da acidez. Desta forma no caso
do composto B3B inserido nesta regio, este efeito levaria a aumento da
concentrao da espcie neutra (forma agregante) prejudicando sua eficcia
clnica em TFD.

iii
ABSTRACT
Photodynamic Therapy (PDT), a new medical treatment that employs a
photosensitizer compound and light, has been a growing field of interest over the
last ten years. Not only for cancer treatment, one of the most important PDT
applications, but also for several other diseases, the researches for new PDT
medications have experienced an increasing development.
The aim of the present work was to study properties of B-ring
Benzoporphyrin derivatives (named DiesterB e B3B), potentially useful in PDT
clinical procedures, in water and ethanol mixtures. Both compounds have acidbase sites, which allowed pKa determinations in neutral to acid solutions. Besides
it, investigations of these compounds in different degrees of protonation were
performed and the influences of some experimental conditions on the stability of
the photoactive species in monomeric form were analyzed.
The observed pKa of the imine nitrogens of the DiesterB and B3B, in 40 and
60 % of water, were nearly the same (3,3), indicating that the peripheral
substituents bounded to the porphyrin structure do not affect this property. For the
B3B compound, we observed pKa = 5,7 for the peripheral carboxylic group. B3B
acid strength undergoes some changes in solvent mixtures over 60 % of water. As
the water content increases, the acidity of the nitrogen is favoured, while for the
carboxylic acid, a decrease was observed (higher pKa). These results are analyzed
considering its enthalpy and entropy effects. It is showed that B3B structure can be
modulated by the pH.

iv
Using a statistical methodology employing a 23 factorial design we
evaluated the influence of some experimental parameters in the B3B stabilization
at different pHs, using two levels (+ and -) of water percentage, time and B3B
concentration. The main parameter is the water content, mainly at pH 4.1, where
B3B is unstable. At this pH, the preponderant B3B structure is the carboxylic and
nitrogen free base forms, where the charge neutralization permits the selfaggregation process in high water presence. The aggregation was monitored by
UV-Vis and it is water dependent. The curves observed were analyzed by a
nonconventional kinetic treatment proposing first at all one slow step where small
nucleus is formed, followed by a rapid change (catalyzed) to the final aggregate.
For therapeutic application one of the most important result obtained here
was to find out that the pKa of the carboxylic group increases as water content is
raised, consequently it came close to the physiological pH. In addition it is know
that the acidity of many tumours is higher than normal tissues. In this case B3B in
that medium would increase the concentration of the neutral form, which is the
specimen that undergoes the aggregation process threatening the drug efficiency
for PDT.

1
1- INTRODUO

Tumor, sinnimo de neoplasma, o tecido resultante de um crescimento

anormal. Clulas doentes, com um distrbio gentico, passam a se reproduzir
mais rapidamente do que as clulas normais levando formao deste tecido,
podendo este ser benigno ou maligno. Quando o crescimento celular muito
acelerado, desorganizado e com tendncia a se disseminar a outros rgos
(metstase), geralmente maligno. A Figura 1 exemplifica esquematicamente este
processo (Inca, 2005). Cncer a designao genrica de qualquer tumor
maligno; a palavra cncer derivada do latim e significa caranguejo. Os diferentes
tipos de cncer correspondem aos vrios tipos de clulas do corpo. Os tipos mais
comuns de cncer so os de pele, mama feminina, prstata, pulmo e estmago.
Entre os citados, o cncer de pele o de maior incidncia no pas, porm, com
exceo do cncer melanoma, a variedade de menor letalidade (Inca, 2005).

Figura 1: Representao esquemtica do processo de carcinognise

seguido de metstase (a cor azul representa clulas alteradas).

2
Com relao ao tratamento, a ao curativa do cncer pode ser realizada
atravs de cirurgia, radioterapia, quimioterapia, transplante de medula ssea, etc,
ou seja, alternativas tradicionais j consagradas. Um novo tipo de tratamento, a
terapia fotodinmica (TFD), vem ganhando terreno rapidamente num avano
promissor na cura ou melhora de vida dos pacientes com cncer, apresentando
efeitos colaterais reduzidos quando comparado s tcnicas convencionais
(Simplcio e col, 2002). Embora a maior ateno da TFD seja voltada a esta
doena, existem outras enfermidades que possuem como caracterstica comum o
crescimento celular desordenado, tais como: degenerao macular da retina,
psorase, artrite reumatide sistmica, restenosis, infestaes microbianas
(bactrias, vrus, fungos, protozorios), verrugas, arteriosclerose, AIDS, etc que
podem, a princpio, vir a ser tratadas com a TFD (Hendreson e Dougherty, 1992;
Levy, 1995; Sternberg e Dolphin, 1996; Sternberg e col 1998). Assim nos ltimos
anos tm aumentado o nmero de pesquisas envolvendo esta nova modalidade
mdica.
A base da TFD a combinao de um medicamento fotossensvel e luz
visvel na presena de oxignio. Aps o acmulo do frmaco que possui alta
afinidade por tecidos em neoplasia, se faz a irradiao de luz atravs de um
cateter de fibra tica. A luz (tipicamente de 600 a 800 nm) ativa o composto que,
na sua forma excitada, reage com o oxignio originando espcies txicas do
mesmo necrosando ou danificando convenientemente o tumor.
Algumas caractersticas essenciais para TFD so a baixa toxicidade do
composto no escuro e elevada seletividade no acmulo do frmaco junto ao tecido
doente, evitando-se que a vizinhana acidentalmente iluminada sofra danos.

3
Dentre os produtos altamente promissores para aplicaes em TFD,
incluem-se porfirinas e seus derivados, tais como: purpurinas, clorinas,
bacterioclorinas e fitalocianinas (Richter e col, 1990).

1.1-

Propriedades gerais necessrias aos frmacos candidatos a uso

em TFD

Algumas propriedades gerais que os compostos e seus formulados devem

possuir esto listadas abaixo (Sternberg e col 1998):
a)

caractersticas fotofsicas favorveis;

b)

baixa toxicidade no escuro (baixa citotoxidade);

c)

fotossensibilidade no prolongada;

d)

formulao simples, elevada reprodutibilidade e estabilidade do formulado

(tempo mnimo de 02 anos), que geralmente mantido seco, bastando ao
mdico adicionar gua ou soro fisiolgico e agitar;

e)

propriedades farmacocinticas favorveis, entre outras, rpida eliminao do

corpo;

f)

facilidade de manuseio sinttico que permita modificaes para aumentar as

propriedades favorveis;

g)

facilidade de obteno em escala industrial a custos reduzidos, com boa

reprodutibilidade;

h)

facilidade de anlise total dos constituintes da formulao, inclusive com

fornecimento de roteiros de validao; e

4
i)

alta afinidade e penetrao no tecido doente em relao ao tecido saudvel

(seletividade).

Para que o medicamento seja comercialmente vivel e eficaz em sua ao

teraputica, necessrio que este atenda a esse conjunto de propriedades
favorveis.

1.2-

Caractersticas fotofsicas

Um fator importante o comprimento de onda de foto-ativao da molcula.

Na regio do visvel, o comprimento de onda da luz incidente proporcional ao
seu grau de penetrao no tecido, isto , quanto maior o comprimento de onda,
maior o grau de penetrao da luz e conseqentemente, maior a eficincia no
combate ao tecido doente (Sternberg e col 1998). Assim, os frmacos
desenvolvidos para uso em TFD devem ser cromforos que absorvam na regio
prximo ao infravermelho (Levy, 1995). Entretanto, acima de 800 nm ocorre a
absoro da irradiao pela gua, o que restringe o comprimento de onda a este
limite superior.
A irradiao da luz, de forma controlada e seletiva, se d quando o
composto encontra-se acumulado no tecido doente. O frmaco no estado excitado
reage com oxignio; este de seu estado triplete convertido ao singlete. O
oxignio singlete, uma molcula altamente reativa, geralmente apontado como o
agente responsvel pela eficincia do tratamento.

5
Adicionalmente o composto pode sofrer um processo chamado de fotobranqueamento onde, atravs de uma reao paralela, modifica-se a molcula
causando mudanas nas propriedades de absoro de luz. A conseqncia o
produto no absorver luz no comprimento de onda de aplicao, prejudicando
assim a ao teraputica (Sternberg e Dolphin, 1996).
Dessa forma, as principais propriedades fotofsicas in vitro investigadas em
molculas candidatas a TFD so (Sternberg e col, 1998):

a)

Forte absoro de luz na regio acima de 650 nm, onde estas apresentam
maior penetrao no tecido;

b)

alto rendimento quntico de estado triplete;

c)

alto rendimento quntico de gerao de oxignio singlete; e

d)

baixo rendimento de reao de foto-branqueamento do cromforo

1.3-

Agregao e seletividade

Como j mencionado anteriormente, as porfirinas e seus derivados so

molculas de grande interesse nas pesquisas envolvendo TFD. Uma caracterstica
importante destes compostos a alta hidrofobicidade, conferindo maior facilidade
de ligao a tecidos biolgicos (Sternberg e col, 1998). Todavia essa propriedade
confere s molculas uma elevada tendncia auto-agregao em soluo
aquosa, veculo usualmente empregado em formulaes devido compatibilidade
com os fludos biolgicos. Em geral, subseqente ao processo de agregao,
porfirinas e seus derivados apresentam formao de precipitados, o que inviabiliza

6
seu uso clnico devido a forte possibilidade de perda de materiais, dor no momento
da injeo, morte do paciente por obstruo de artrias (formulado intra-venoso),
baixa absoro (formulado tpico), etc. Alm dos inconvenientes citados o
frmaco no estado agregado reduz a produo de oxignio singlete e
conseqentemente diminui a eficincia do tratamento (Sternberg e col, 1998;
Machado, 2000).
Outra questo a ser abordada a seletividade. A maioria dos
medicamentos funciona porque sua constituio e conformao permitem ligar (e
possivelmente reagir) a um nico stio celular. Alguns derivados porfirnicos
exibem alta afinidade por lipoprotenas de baixa densidade (LDL) do fluxo
sangneo e tem sido fartamente documentado que tecidos em metstase
possuem alta concentrao de receptores deste tipo de lipoprotena (em
comparao com clulas normais). Esta propriedade promove um maior acmulo
do frmaco no tecido doente, portanto, um ponto crucial na TFD o balano entre
a distribuio do frmaco e o tempo de espera para o incio da irradiao, de tal
modo que a concentrao do princpio ativo do medicamento e o seu grau de
profundidade no tecido doente sejam adequados (Sternberg e Dolphin, 1996).

1.4-

Alguns compostos para a TFD e suas propriedades

Apesar de diferentes tipos de compostos terem sido investigados para a

TFD, o primeiro a ser aprovado pelas autoridades de sade para o combate de
cncer de esfago e pulmo foi o Photofrin, um derivado de hematoporfirina. O
terceiro e ltimo frmaco aprovado para a TFD pela Food and Drug

7
Administration/EUA (ano de 2000), o Visudyne, utilizado no combate a
degenerao macular da retina, uma doena ocular a qual causa cegueira em
pessoas idosas (Simplcio e col, 2002). Adicionalmente, o princpio ativo do
Visudyne, chamado de verteporfina ou BPDMA, tem sido testado contra vrias
das outras doenas j mencionadas anteriormente.
O BPDMA, um derivado benzoporfirnico monocido tipo clorina, tem um
dos anis pirrlicos da estrutura porfirnica reduzido e, adicionalmente, a molcula
possui um anel ciclohexadieno ligado a este pirrol reduzido. Durante seu processo
de sntese so gerados dois ismeros ester em quantidades equimolares, com
diferenas no carbono assimtrico do grupo pirrol reduzido (Sternberg e col,
1998). Dependendo da localizao do anel ciclohexadieno so chamados de
derivados de anel A e B, no caso respectivamente tem-se o DiesterA e o DiesterB
(Esquema I). Na sntese do BPDMA apenas os compostos de anel A so usados.
Interessantemente, estudos tm demonstrado que a posio do grupo
ciclohexadieno

no

afeta

consideravelmente

eficincia

desses

fotossensitizadores in vitro e que ambos (derivados de anel A e B) apresentam

propriedades fsico-qumicas similares (Richter e col, 1990; Richter e col, 1991;
Aveline e col, 1994; Aveline e col, 1995). Entretanto ambos os derivados podem
sofrer auto-agregao em meio aquoso, com muito maior tendncia a esta por
parte dos ismeros de anel B. Menciona-se que embora o medicamento
Visudyne seja formulado eficientemente em lipossomos (sem agregao)
(Chowdhary e col, 2003; Visudyne, 2004), o mesmo resultado no obtido com os
compostos de anis B (Delmarre e col, 2001; Hioka e col, 2002). Por outro lado,

8
com a intensa comercializao do Visudyne os derivados de anel B, coproduzidos na razo 1:1, esto sendo acumulados. Diante da possibilidade
concreta de uso comercial dos derivados de anel B, a investigao das
propriedades desses compostos bastante interessante.

1 DMAD
2 Et3N 90%
3 DBU 90%

Protoporfirina IX

DiesterA

BPDMA

Esquema I

DiesterB

B3B

9
Aliado a importncia cientfica e aplicada destes derivados, uma vez que
ambos apresentam elevada ao teraputica, um ponto crucial neste trabalho a
questo do efeito do pH. Os derivados benzoporfirnicos apresentam como
grupamento cido-base os nitrognios dos anis pirrlicos e, eventualmente
grupos perifricos ligados estrutura porfirnica. O fator pH determina a estrutura
da espcie presente afetando as propriedades de absoro da luz, rendimento
quntico, gerao de oxignio singlete, foto-branqueamento, facilidades na
formulao, solubilizao, lipofilicidade, afinidade celular, tempo de reteno,
biodistribuio, etc. Vale ressaltar que, embora o pH fisiolgico seja ao redor de
7,3, diversos tecidos celulares e intracelulares tm micro-localmente variaes no
meio. Adicionalmente a intensa atividade neo-vascular, caracterstica comum em
tecidos neoplsticos, aparentemente proporciona aumento de acidez em regies
micro-localizadas (Gerweck e Seetharaman, 1996; Tannock e Rotin, 1989). Dessa
forma

influncia

da

acidez

do

meio

sobre

os

fotossensibilizadores,

principalmente na regio neutra a cida, reveste-se de importncia fundamental.

Recentemente nosso grupo investigou propriedades do composto DiesterB
(Esquema I), quanto a aspectos termodinmicos e cinticos da auto-agregao
em meio de pH neutro (Delmarre e col, 2001; Simplcio e col, 2004A, Simplcio e
col, 2004B). Nesse foi observado que a adio de gua em solvente orgnico
induz a auto-agregao do substrato, inclusive levando ao surgimento de uma
banda nova na regio de 720 - 740 nm, atribuda a agregados, em detrimento
banda de monmeros em 690 nm.

10
1.5-

Definio de pKa

O equilbrio qumico envolvendo cidos e bases, principalmente em meio

aquoso, de grande importncia, visto que comumente observado em sistemas
biolgicos desempenhando importante papel no metabolismo e na sua regulao
(Lehninger e col, 1995). Para o melhor entendimento do comportamento de
solues aquosas de cidos e bases, deve-se primeiro definir alguns conceitos
fundamentais.

Segundo

classificao

de

Bronsted-Lowry,

cidos

so

classificados como doadores de prtons e bases como receptores de prtons. O

equilbrio qumico entre um cido genrico (HA) e sua base conjugada (A-)
representado pela Equao 1:

HA

H2O

H3O+

A-

(1)

A fora de um cido em gua, isto , o contedo no qual ele dissociado,

determinado considerando esse equilbrio. A determinao da sua constante de
dissociao realizada considerando os coeficientes de atividade das espcies
ou, por aproximao, suas concentraes (Skoog e col, 1992; Atkins, 1999).
Assim a constante de dissociao ilustrada pela Equao 2.

Ka= { [H3O+].[A-] } / [HA]

(2)

O termo [H2O] foi incorporado dentro de Ka, a constante de acidez, porque a

gua est presente em tal excesso que sua concentrao no muda
significativamente. Esta equao revela que a razo entre a concentrao da

11
forma cida (HA) e da forma bsica (A-) pode ser governada pela concentrao de
ons hidrognio no meio. Fazendo-se o logaritmo dos dois membros da igualdade
nesta equao e sabendo-se que:

pH= - log [H3O+]

pKa= - log Ka

com o uso das equaes acima pode-se reescrever a Equao 2 :

-pH= -pKa + log([HA]/[A-])

ou

pH= pKa - log([HA]/[A-])

(3)

Esta equao que relaciona quantitativamente o valor de pH com o valor de

pKa conhecida como a equao de Henderson-Hasselbalch, que simplesmente
uma forma til de redefinir a expresso para a constante de dissociao de um
cido. Assim pode-se definir o pKa como sendo o valor de pH de uma soluo na
qual a concentrao da espcie cida igual a da bsica (ou seja, ([HA]/[A-]) = 1,
portanto, log([HA]/[A-]) = 0). Note-se que, mesmo no tendo esta igualdade,
possvel determinar diretamente o pKa atravs da equao de HendersonHasselbalch desde que o pH e as concentraes das formas cida e bsica sejam
conhecidos.
importante salientar que o uso da equao de Henderson-Hasselbalch
com os termos em concentrao deve ser feito sabendo-se que o coeficiente de
atividade de cada espcie em soluo depende da fora inica do meio (Skoog e
col, 1992).

12
1.6-

A acidez de compostos orgnicos

Alguns fatores podem influenciar a fora de acidez de um composto

orgnico, dentre os quais, devem-se destacar os efeitos estruturais e os efeitos do
meio (solvente, fora inica, temperatura, etc). A estrutura de uma molcula deve
afetar sua acidez em inmeros caminhos, tais como, efeitos de campo, efeitos de
ressonncia, ligaes de hidrognio, etc.
Quanto ao efeito de campo, em geral grupos que retiram densidade
eletrnica por esse efeito aumentam a acidez de um composto orgnico, enquanto
que grupos eletrodoadores atuam no sentido oposto, ou seja, contribuem para a
diminuio da acidez do composto. Quanto ao efeito de ressonncia na acidez de
compostos, pode-se tomar como exemplo a comparao entre duas classes de
compostos similares, cidos carboxlicos e lcoois. Um cido carboxlico (RCOO-)
intrinsecamente estabilizado por ressonncia enquanto um lcool primrio
(RCH2O-) no tem essa capacidade. A estabilizao no RCOO- deve-se a
presena de duas estruturas cannica coexistentes e a disperso da carga
negativa entre os dois tomos de oxignio. Assim a acidez do cido carboxlico
maior quando comparada a lcoois primrios. A mais se tem que, em geral efeitos
de ressonncia levam a mesma direo que os de campo (March, 1985). Outra
propriedade a presena de ligaes de hidrognio. Por um lado a presena
destas em um dos lados do equilbrio provoca estabilizao; entretanto este fato
provoca forte ordenamento destas molculas de solvente, contribuindo para um
desfavorecimento entrpico (March, 1985).

13
Efeitos do Solvente
Apesar da discusso acima sobre a influncia de caractersticas estruturais
na acidez de compostos orgnicos, a regra real determinante freqentemente
exercida pelo solvente (March, 1985; Sykes,1987), e este particularmente o caso
quando se trata de gua como solvente.
A gua tem uma desvantagem inicial como solvente para compostos
orgnicos, uma vez que esta nem sempre solubiliza a forma no ionizada do
composto. Desconsiderando esta limitao, a efetividade peculiar da gua como
solvente geral, deve-se ao fato dela ser fortemente polarizada e, tambm, possuir
um tamanho relativamente pequeno. Por causa disto, a gua um solvente
efetivamente nico, por conta de sua alta constante dieltrica e de sua habilidade
on solvatante (Sykes, 1987).
A primeira propriedade obtm efeito por causa da alta constante dieltrica
do solvente abaixar a energia eletrosttica de qualquer par de ons presente nele,
conseqentemente tais ons tm menos facilidade em se recombinar ficando
nessa forma inica mais confortvel em soluo. Neste caso o efeito de entalpia.
Por outro lado, ao estabilizar os ons (dispersando ou deslocalizando sua carga), o
solvente forma um envelope de solvatao de molculas deste em torno das
espcies carregadas. Como uma das conseqncias tem-se um efeito de
organizao do solvente; este um efeito desfavorvel de entropia ao aumento de
acidez (March, 1985).

14
Assim, ao analisar a fora cida de um dado composto num solvente, cabe
avaliar os termos de entalpia (H) e entropia (TS) notando-se que os dois fatores
atuam em sentidos opostos.

G= H - TS

(4)

Para cidos simples (exemplo os minerais e orgnicos simples), em geral o

efeito de entalpia prevalece; entretanto para cidos orgnicos que possuem
estabilizao estrutural intrnseca, o termo de entropia muitas vezes prevalece ao
de entalpia (Sykes, 1987).

1.7-

Os derivados de anis B de interesse

Os derivados Benzoporfirnicos de anis B foco deste trabalho so o

DiesterB e o B3B (Esquema I). Ambos so bastante solveis em solventes
orgnicos puros. O DiesterB, uma clorina tetra-ester, apresenta carter cido-base
nos nitrognios pirrlicos sendo que em meio neutro a cido, os nitrognios iminas
(base livre) podem sofrer protonao. No caso do B3B, adicionalmente tem-se o
grupo carboxlico perifrico ligado ao anel ciclohexadieno. Aponta-se que em
compostos porfirnicos com grupos carboxlicos perifricos, existem controvrsias
na literatura com respeito a atribuio dos pKas. Em alguns casos a observao
de dois equilbrios cido-base foi atribuda seqncia de protonao dos dois
nitrognios iminas dos anis pirrlicos (Pottier e col, 1985). Essa proposio foi
questionada principalmente por Cunderlkov e colaboladores (Cunderlkov e col,
1999) que atriburam que o pKa de valor inferior refere-se aos nitrognios

15
enquanto que o superior corresponde ao grupo carboxlico. Acrescenta-se ainda
que aparentemente as espcies terapeuticamente ativas so as formas de base
livre de ambos derivados de anis B no estado monomrico (Richter e col, 1990;
Richter e col, 1991; Cunderlikov e col, 1999).

16
2- OBJETIVOS

O presente trabalho tem por finalidade ampliar os estudos do DiesterB e,

adicionalmente, investigar o composto B3B (Esquema I). Os objetivos deste estudo foram:
i) estudar a estabilidade de compostos de anel B e de suas espcies em misturas de
gua/etanol com diferentes graus de protonao; ii) investigar o mecanismo de agregao
atravs de estudos cinticos em meio neutro/cido. O sistema de solventes escolhido a
mistura gua/etanol devido a sua utilizao potencial em formulaes.

17
3- MATERIAIS E MTODOS

3.1- Materiais

Todos os solventes e reagentes utilizados eram de alto grau de pureza. A

gua utilizada foi destilada. Eventualmente utilizou-se de gua desionizada para
comparao de resultados.

3.2- Mtodos

Procedimentos gerais
Os derivados benzoporfirnicos de anel B, compostos DiesterB e B3B,
foram cedidos pelo Prof. David Dolphin (University of British Columbia). As
solues estoques, preparadas em DMSO, eram armazenadas no escuro e na
geladeira a fim de evitar-se degradao. Antes do uso, as solues eram
descongeladas e padronizadas por espectrofotometria UV-Vis, em DMSO,
utilizando um valor de coeficiente de absortividade molar (Delmarre e col, 2001) de
= 34000 L mol-1 cm-1 em 692 nm para ambos os compostos.
As misturas de solventes foram preparadas em bales volumtricos (10
mL), pela adio de diferentes volumes de etanol com 0,500 mL de soluo de
NaCl (2,0 mol L-1) e 0,500 mL de soluo tampo de Mcllvaine (cido ctrico e
fosfato dibsico de sdio) para controle de fora inica e de pH, respectivamente.
Adicionalmente, em situaes em que se exigiam solues com pH inferior a 2,0,
utilizou-se soluo de cido clordrico previamente padronizado. Os bales foram

18
completados com gua. Alquotas de 2,0 mL eram retiradas dos bales
volumtricos e transferidas para as cubetas. A temperatura em que os
experimentos eram executados foi de 30,0 C. Os derivados eram introduzidos via
microseringa (5-15 L do estoque) seguido de agitao. A soluo final no
continha mais que 0,75 % (V/V) de DMSO, [NaCl]= 0,10 mol L-1 e [tampo]= 0,016
mol L-1. As composies de solventes esto apresentadas em porcentagem de
gua em etanol (V/V).

Determinao de pKa
Para a determinao dos valores de pKa aparente dos grupos amino
(DiesterB e B3B) e carboxlico (B3B), utilizou-se o mtodo espectrofotomtrico de
absoro UV-Vis avaliando-se o perfil da absorbncia em 688 (banda Q) e 430 nm
(banda de Soret), ambas correspondentes a monmeros, e da banda em 672 nm
referente aos nitrognios protonados. A razo de concentraes apontada na
Equao 3 pode ser escrita em termos das intensidades de absoro, resultando
em:

log([HA]/[A-]) = log{(Absbs Absi)/(Absi Absc)}

(5)

onde: Absbs e Absc so as intensidades de absoro das solues nos limites

bsico e cido, respectivamente; Absi a intensidade de absoro das solues
em pHs intermedirios. Dessa forma a Equao 3 fica:

pH= pKa - log{(Absbs Absi)/(Absi Absc)}

(6)

19
De posse dos resultados de absorbncia, utilizou-se das seguintes
metodologias para calcular o valor de pKa dos compostos estudados:

a) mtodo das derivadas: para a determinao do ponto de inflexo em uma curva

sigmoidal pode-se usar o mtodo da primeira e segunda derivada em funo do
pH. No caso da primeira derivada, o pKa obtido pelo ponto de mximo ou mnimo
da curva. Na derivada segunda, o valor encontrado pela mudana abrupta da
regio positiva para negativa (ou vice-versa) passando pelo valor zero (Harris,
2001; Skoog e col, 1992).

b) grfico de pH vs -log([HA]/[A-]):

a partir do coeficiente linear da curva

construda tomando-se a relao pH vs -log([HA]/[A-]) obtm-se o valor do pKa.

c) computacional Programa Specpk (Albert e Serjeant, 1971): essa metodologia

empregada para calcular constantes de ionizao de molculas que apresentam
grupos com valores de pKa prximos. Alm dos valores de absorbncias
correspondentes a cada soluo, fornecemos as absorbncias correspondentes
s espcies cidas e bsicas juntamente com sua concentrao. Inicialmente, os
dados espectrofotomtricos so utilizados para estimar a absortividade molar da
espcie monoprotonada (intermediria). A partir desta, faz-se estimativas iniciais
de pKa1 e pKa2. De posse desses valores, o programa re-estima a absortividade
molar da espcie monoprotonada. O processo continuado reiterativamente at
que no exista diferena significante entre os sucessivos valores de pKa1 e pKa2.

20
Procedimento quimiomtrico
Para o estudo da estabilidade do B3B utilizou-se o planejamento fatorial 23
do

mtodo

quimiomtrico.

Trs

pHs

diferentes

foram

estudados

independentemente. Para cada pH (7,0, 4,1 e 2,6) trabalhou-se em dois nveis (- e

+) associados a trs variveis: tempo, [B3B] e porcentagem de gua, o que
corresponde ao planejamento fatorial 23. Utilizou-se de 5 (-) e 360 (+) minutos
como tempo de anlise inferior e superior, respectivamente. A concentrao de
B3B foi de 4,4x10-6 mol L-1 (-) e 26,5x10-6 mol L-1 (+). O contedo de gua em
etanol foi de 40 % (-) e 60 % (+). Todos os ensaios foram realizados em duplicata.
Para o tratamento estatstico foi utilizado o programa Design-Expert (Wiley,
verso Release 6.0.3). Uma vez determinado o fator mais relevante, efetuou-se
um estudo de superfcie desta varivel tomando-se mais pontos experimentais a
fim de evitar-se erros causados por investigaes envolvendo apenas dois nveis.

Procedimento cintico
A investigao do processo cintico de agregao do B3B foi realizada
monitorando-se os comprimentos de onda junto aos picos de monmeros e
agregados. Para o tratamento cintico utilizou-se o programa Kaleida Graph
(verso 3.5 Demo) e a Equao 7, proveniente da Teoria do Caos, utilizada para
cinticas auto-catalticas. Este mtodo foi similar ao aplicado em estudos
anteriores com o DiesterB em meio gua/solvente orgnico na regio neutra de pH
(Simplcio, 2003).

(Abs-AbsF)/(Abs0-AbsF)=1/(1+(m-1)[k0t+(n+1)-1(kct)n+1])1/(m-1)

(7)

21
onde, Abs, AbsF e Abs0 so respectivamente as absorbncias a cada tempo, final
e inicial, m representa o tamanho do ncleo, kc e k0 as constantes de velocidade
das etapas catalisada e no catalisada e n um parmetro cintico relacionado
com a velocidade de crescimento do agregado.

3.3- Equipamentos

Os experimentos foram monitorados atravs do espectrofotmetro Cary-50

(Varian) usando cubetas de quartzo e poliestireno com 1,00 cm de caminho tico.
As medidas de pH foram realizadas em um pHmetro Meterlab pHM 240 com
eletrodo de vidro acoplado a um eletrodo de referncia de calomelano. Este
sistema potenciomtrico especfico adequado para medidas de pH em misturas
de gua com solventes orgnicos (Nicholson e col, 1997) (calibrados utilizando
soluo padro aquosa, como usual, pH= 7,0 e 4,0).

22
4- RESULTADOS E DISCUSSO
Sistema Potenciomtrico
Inicialmente avaliou-se o sistema potenciomtrico empregado (eletrodo de
vidro acoplado a um eletrodo de calomelano) quanto a sua capacidade de
resposta. Segundo Nicholson e colaboradores (Nicholson e col., 1997), as leituras
de pH utilizando-se este sistema levariam 30 minutos para estabilizar. Assim,
prepararam-se solues de gua/etanol utilizando soluo tampo com pH igual a
4,8 (gua) e, avaliou-se o tempo de estabilizao da leitura de pH (Figura 2).

6,4

6,0

5,6

pH
5,2

4,8

4,4
0

10

20

30

tempo (min)

Figura 2: Medidas de pH em misturas de gua/etanol em funo do tempo.

20 % (), 50 % (), 70 % () e 100 % (&).

Os resultados ilustrados na Figura 2 indicam uma variao de pH muito

pequena com o tempo, principalmente em misturas onde o contedo de gua
superior a 50 %.

Assim, ao longo deste trabalho, optou-se por aguardar a

estabilizao da leitura de pH por cerca de 5 minutos. importante ressaltar que,

23
para efeito de comparao, algumas medidas de pH em meio etanlico foram
realizadas com o eletrodo convencional de pH (eletrodo combinado de vidro).
Verificou-se que com este eletrodo a flutuao na leitura era razoavelmente
grande e o tempo de estabilizao era superior a 10 minutos, apesar de ao final,
convergir para o valor de pH correto.
Adicionalmente, analisou-se a capacidade de resposta do sistema eletrodo
de vidro com calomelano em diversas misturas de gua/etanol. Utilizando-se de
soluo tampo com pH igual a 4,8 (em gua pura), prepararam-se solues com
diferentes propores dos solventes e determinaram-se seus pHs (Figura 3).

6,4

6,0

5,6

pH
5,2

4,8

4,4
20

40

60

80

100

% de gua

Figura 3: Medidas de pH em funo do contedo de gua em misturas de

gua/etanol.

Analisando-se a Figura 3, observa-se a convergncia das leituras de pH,

medida que aumenta-se o contedo de gua na mistura, para o valor esperado em

24
100 % de gua, isto 4,8. Esta coerncia entre valor de convergncia e o
esperado, sugere que as medidas com o sistema potenciomtrico utilizado so
confiveis. Paralelamente a este experimento, determinou-se o pH dessas
solues atravs do mtodo da ABNT 10891 (medidas de pH em lcool etlico)
usando-se equipamentos do Laboratrio de Anlises de guas e Alimentos do
DQI/UEM; os dois sistemas resultaram em valores idnticos evidenciando a
eficcia do sistema ora empregado neste trabalho.

Geral
Em solvente orgnico puro, os compostos DiesterB e B3B esto na forma
monomrica, apresentando duas bandas principais no espectro eletrnico sendo
uma na regio de 690 nm (banda Q) e outra em 430 nm (banda de Soret).
Em nosso trabalho, os resultados espectrofotomtricos revelaram que
ambos os compostos em etanol aquoso mantm-se estveis na forma
monomrica at aproximadamente 40 % de gua (ocorreu somente um ligeiro
deslocamento do pico de monmeros para 688 nm). Em solues com teor maior
de gua em etanol e sob certas condies experimentais principalmente
relacionadas ao pH, verificou-se acentuada diminuio na intensidade dos seus
picos indicando que a forma monomrica destes instvel levando a formao de
agregados. Eventualmente alm do decrscimo dos picos em 688 e 430 nm, temse o surgimento de uma nova banda na regio de 720-740 nm, atribuda a outras
formas de agregados. Diante deste quadro, iremos abordar primeiramente
generalidades resultantes dos dados experimentais relativos questo do pH do
meio.

25
Como j citado, o composto DiesterB, um tetra-ester onde somente os
nitrognios dos anis pirrlicos (grupos aminos) so grupos cido-base. Nossos
resultados mostraram que apenas uma transio cido-base foi observada
experimentalmente em meio cido a neutro e, neste caso, prope-se a presena
de duas espcies majoritrias do composto dependentes da acidez do meio. Em
meio bsico/neutro a entidade presente a espcie 1, forma sem carga,
representada no esquema II (Delmarre e col, 2001; Simplcio e col, 2004B). Em 60
% de gua/etanol o espectro de absoro inicial do DiesterB (Figura 4, espectro a)
apresenta as duas bandas principais, em 688 nm (banda Q) e em 430 nm (banda
de Soret), indicando que a espcie 1 encontra-se no estado monomrico.
Entretanto, ambos os picos de monmero diminuem com o tempo, indicando a
instabilidade do mesmo em decorrncia da agregao (Delmarre e col, 2001;
Hioka e col, 2002; Simplcio e col, 2004A; Simplcio e col, 2004B). Este processo
deve-se a presena de interaes atrativas, dos sistemas das unidades de
porfirinas (foras de disperso de London (London e Physik, 1930)), aliada a
ausncia de cargas da espcie 1. A formao do agregado lenta, originando
dmeros, trmeros e outros (Hioka e col, 2002; Simplcio e col, 2004A). Este
fenmeno se reflete de duas formas distintas. Em determinadas condies
experimentais

observa-se

diminuio

dos

picos

de

monmeros

e,

simultaneamente, o surgimento de um novo pico na regio de 720-740 nm (Figura

4, espectro b) atribudo a espcie 1 no estado agregado (tempo infinito) (Delmarre
e col, 2001; Hioka e col, 2002; Simplcio e col, 2004A; Simplcio e col, 2004B).
Entretanto em outras condies do meio observa-se apenas a diminuio dos

26
picos de monmeros, ou seja, novamente agregao, no entanto sem a formao
de pico adicional. O modelo do Exciton Molecular explica esses dois tipos
diferentes de agregados, isto , um no apresentando banda especfica e outro
com pico. A base do modelo do Exciton na interao ressonante criada durante
a interao dos estados excitados dos componentes das molculas constituintes
do agregado (Kasha, 1963; Cooper, 1970). Quanto banda de Soret, em todos os
casos alm da sua diminuio, ocorre simultaneamente alargamento e
deslocamento de seu comprimento de onda de mximo para a regio de 475 nm.
A espcie 1 a estrutura predominante de DiesterB at ao redor de pH 3,6.
CO 2 Me

MeO 2 C

B
NH
N

CO 2 Me

N
HN

CO 2 Me

Espcie 1

Esquema II

Ka1

CO 2 Me

MeO 2 C

B
NH
+

NH

CO 2 Me

HN
+

HN

CO 2 Me

Espcie 2

27

0,60

Absorbncia

0,45

a
0,30

b
b

0,15

0,00
400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 4: Espectros do DiesterB a 60 % de gua/etanol, c= 4,5x10-6 mol L-1.

(a) pH= 4,1 no tempo zero; (b) pH= 4,1 no tempo infinito; (c) pH= 1,52
(independente do tempo).

Em pH abaixo de 3,0 os nitrognios pirrlicos so protonados (espcie 2,

Esquema II). Esse grupo faz parte da unidade cromofrica causando imediata
(abrupta) mudana no espectro de absoro (Figura 4, espectro c) de maneira
similar ao que ocorre com porfirinas tais como TPPS2a (meso-tetrafenilporfirina
dissulfonada), m-THPP (meso-tetra(3-hidroxifenil)porfirina) e a clorina m-THPC
(meso-tetra(3-hidroxifenil)clorina) (Cunderlkov e col, 2001; Cunderlkov e col,
1999). Da mesma forma ao que ocorre com porfirinas, consideramos a protonao
simultnea dos dois nitrognios iminas. Entretanto esse fenmeno ainda no est
esclarecido. Segundo Desroches e colaboladores (Desroches e col, 2003) no caso
de clorinas, tm-se apenas a transio envolvendo um hidrognio (ao redor de pH
3), entretanto os autores no discutem a respeito da segunda protonao, mesmo

28
tendo realizado experimentos em meio bastante cido (pH ~ 1). No presente
trabalho, mesmo atingindo-se meios intensamente cidos ([HCl]= 1 mol.L-1),
observou-se somente um equilbrio cido-base; este fato sustenta a protonao
simultnea, ou seja, os dois nitrognios devem possuir pKas muito prximos
entre si. Por outro lado apontamos que o nitrognio situado em posio oposta ao
grupo benzo (espcie 1, Esquema II) deve possuir densidade eletrnica maior que
o outro nitrognio, devido a este ltimo sofrer influncia de efeito eletroretirador
decorrente do anel ciclohexadieno substitudo; porm este efeito deve ser
pequeno.
Em relao a mudana espectral, o pico de Soret tem seu comprimento de
onda de mximo restabelecido (430 nm) com intensidade de absoro maior que a
inicial e o pico em 688 nm deslocado para 672 nm (Figura 4, espectro c). No
ocorre mudana espectral com o tempo indicando que esta espcie no sofre
agregao. A presena de cargas (positivas) atenua as interaes hidrofbicas e,
simultaneamente, mantm uma fora de repulso eletrosttica entre as unidades
de porfirina (espcie 2) desfavorecendo a agregao (Cunderlkov e col, 1999;
Cunderlkov e col, 2001; Cunderlkov e col, 2004).
Diferentemente do DiesterB, o composto B3B apresenta em sua estrutura,
alm dos nitrognios pirrlicos, um grupo carboxlico perifrico, assim pode exibir
maior nmero de diferentes estados de ionizao em soluo, como propostos no
Esquema III e cujas justificativas so apresentadas na seqncia.

29
COO-

MeO2C

B
N

NH
N

HN

CO2Me

CO2Me

Espcie 3

COOH

MeO2C

Ka2

NH
N

CO2Me

N
HN

CO2Me

Espcie 4

COOH

MeO2C

Ka1

NH
+

NH

CO2Me

B
HN
+

HN

CO2Me

Espcie 5

Esquema III

Em meio alcalino e neutro o composto B3B apresenta espectro idntico ao

do DiesterB e do prprio B3B em solvente orgnico puro (ou com baixos teores de
gua), ou seja, est presente no estado monomrico. O monitoramento espectral
da soluo de B3B em meio alcalino com o tempo mostrou que este praticamente
no sofre variao, indicando estabilidade, i.e., ausncia de agregao neste
meio. Neste caso o composto deve encontrar-se com o substituinte perifrico na
forma de carboxilato (espcie 3, Esquema III) de forma que a carga (negativa)
deve minimizar a agregao de maneira similar ao citado com o DiesterB em pH
abaixo de 3 onde as cargas positivas (no nitrognio) dificultam a agregao.
Mudando para pH 4,1, o carboxilato convertido para carboxlico com
perda da carga (espcie 4, Esquema III). Assim prope-se que o pKa de valor
superior deve corresponder ao grupo carboxlico. Inicialmente o espectro de
absoro idntico ao da espcie 3 porque esses grupamentos (carboxilato e
carboxlico) no fazem parte da unidade cromofrica da molcula, isto , no
existe conjugao ressonante entre esses e o restante da estrutura (Cunderlkov

30
e col, 2001; Cunderlkov e col, 2004). Porm nessas condies o B3B apresenta
comportamento similar ao exibido pela espcie 1 do DiesterB, ou seja, em
condies iniciais o composto apresenta-se na forma monomrica e, com o tempo,
observa-se a formao lenta de agregados. De maneira similar ao DiesterB, alm
da diminuio gradativa dos picos referentes ao monmero, verificou-se que o
processo de agregao do B3B leva em alguns casos excepcionais a formao de
um pico adicional de agregados, dependente das condies experimentais do
meio.
J em meio cido (pH=2,6) o B3B, por similaridade ao proposto para o
DiesterB, deve estar duplamente protonado (espcie 5, Esquema III). A
protonao simultnea dos nitrognios pirrlicos, causa mudana espectral
imediata, com deslocamento do pico de 688 nm para 672 nm de maneira idntica
ao que ocorre com o DiesterB. No observou-se variaes espectrais com o
tempo. Na forma estrutural proposta, como citado anteriormente, a presena de
cargas deve manter o composto no estado monomrico (Cunderlkov e col, 1999;
Cunderlkov e col, 2001; Cunderlkov e col, 2004). importante ressaltar que as
espcies 2 e 5 (do DiesterB e do B3B, respectivamente) so muito similares,
sendo ambas protonadas nos grupos amino, com diferenas apenas no grupo
perifrico (grupo metil-ester para a espcie 2 e carboxlico para a espcie 5).

31
4.1- Determinao de pKa

pKa do DiesterB
O pKa do composto DiesterB foi determinado em 40 e 60 % de gua/etanol,
avaliando-se o perfil de absorbncia no tempo inicial de mistura em funo do pH
(tempo de 2 minutos aps a adio do substrato, Figura 5). Como pode ser visto a
intensidade da absorbncia em 672 nm elevada em regies de baixo pH,
entretanto diminui gradativamente com o aumento do mesmo, sendo este perfil
inverso ao observado em 688 nm.

0,16

Absorbncia

0,12

0,08

0,04

0,00
1,5

3,0

4,5

6,0

pH

Figura 5: Perfil de absorbncia do DiesterB vs pH. c= 4,5x10-6 mol L-1 em

40 % de gua/etanol, absorbncias coletadas 2 minutos aps a adio do
substrato. T= 30,0 C. 672 nm () e 688 nm ().

Atravs dos dados da Figura 5 e das funes da primeira e segunda

derivada obtiveram-se os valores de pKa1 do grupo amino do DiesterB (Figura 6).

32
Neste caso a primeira derivada apresenta ponto de mnimo ao redor de 3,3 e a
segunda derivada passa da regio negativa para a positiva ao redor do mesmo
valor de pH. Entretanto como visualizado a determinao prejudicada pelo
nmero pequeno de pontos experimentais na regio prxima a inflexo da curva
da Figura 5 (Previdello e col, 2005).

0,06

Derivada

0,03

0,00

-0,03
2

pH

Figura 6: Avaliao de pKa do DiesterB com dados em 672 nm em 40 % de

gua/etanol: primeira derivada (linha tracejada) e segunda derivada (linha slida).
c= 4,5x10-6 mol L-1. T= 30,0 C.

Diante

da

insegurana

causada

pelo

clculo

anterior

mesma

determinao foi realizada a partir do grfico de pH versus - log ([cida]/[bsica]),

Figura 7. Como pode ser visualizada, a determinao do pKa1 por este mtodo foi
muito mais satisfatria que pelo mtodo da derivada. Quando nas regies
prximas aos limites cido e bsico a quantidade de pontos experimentais

33
significativa, normalmente este tratamento analtico resulta em valores mais
confiveis. Diferentemente, quando a quantidade de pontos maior na regio de
inflexo (Figura 5), o tratamento via derivadas melhor (Previdello e col, 2005).
Esta determinao, realizada com dados de absorbncia obtidos em 430, 672 e
688 nm, resultou em valores idnticos de pKa.

pH
4

1
-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

-log ([cida]/[bsica])

Figura 7: Variaes de pH em funo do logaritmo da relao de

concentraes entre as formas cidas e bsicas para o DiesterB obtidas a partir
dos dados em 688 nm. c= 4,5x10-6 mol L-1. T= 30,0 C.

Os valores calculados pelos dois mtodos (derivada e grfico) a partir dos

dados nos trs comprimentos de onda se mostraram muito prximos entre si. Os
valores de pKa1 determinados para 40 e 60 % de gua/etanol foram
respectivamente, 3,3 e 3,2 indicando que no intervalo estudado o teor de gua em
etanol no exerce influncia no pKa. Note-se que o valor de pKa1 do DiesterB

34
(grupo amino) um resultado bastante confivel, haja visto que ocorre mudana
imediata no espectro causada pela protonao ou desprotonao do nitrognio.

pKa do B3B
Os pKas do composto B3B foram determinados em diversas composies
de gua/etanol, avaliando-se o perfil de absorbncia no tempo infinito em funo
do pH (Figura 8). Como pode ser visto a intensidade da absorbncia em 430 nm
elevada em regies de alto e baixo pH, entretanto reduzida na regio
intermediria, como discutido anteriormente. Para efetuar os clculos de pKa, com
os dados exemplificados para 60 % de gua apresentados na Figura 8, utilizaramse os mtodos da derivada, grfico (pH vs -log ([cida]/[bsica]) e computacional.

0,60

Absorbncia

0,45

0,30

0,15

0,00
1

pH

Figura 8: Perfil da absorbncia em 430 nm do B3B vs pH. c= 4,4x10-6 mol L1

em 60 % gua/etanol; absorbncias coletadas aps o sistema atingir o equilbrio

qumico. T= 30,0 oC.

35
Atravs das funes da primeira e segunda derivada obtiveram-se os
valores de pKa1 e pKa2 do grupo amino e carboxlico, respectivamente (Figura 9).

derivada

-2

pH

Figura 9: Avaliao de pKa do B3B em 60 % de gua/etanol com dados em

430 nm: primeira derivada (linha tracejada) e segunda derivada (linha slida). c=
4,4x10-6 mol L-1. T= 30,0 C.

Os resultados do mtodo grfico, o mesmo utilizado no clculo de pKa para

o DiesterB (no ilustrado), foram iguais aos obtidos pelo mtodo da derivada.
Adicionalmente calculou-se os valores de pKa do B3B atravs do mtodo
computacional (programa SpecpK) uma vez que a proximidade entre o pKa1 e o
pKa2 poderia ocasionar erros. Esse tratamento pode ser aplicado, quando a
molcula apresenta dois grupos ionizantes que possuem valores de pKa muito
prximos. Os resultados encontrados por este mtodo confirmaram os valores
obtidos pelos demais demonstrando que no existem sobreposies nos clculos

36
de pKas. Na tabela 1 mostra-se os dados de pKa calculados para o B3B nas
propores de solvente estudadas.

Tabela 1: Valores de pKa para o B3B em diversas composies de

gua/etanol. T= 30,0 C, c= 4,4x10-6 mol L-1, [NaCl]= 0,1 mol L-1 e [tampo]= 0,016
mol L-1.
% de gua
40
60
65
70

pKa1
3,4
3,3
2,4
1,9

pKa2
5,7
6,0
6,3

A partir dos valores de pKa1 e pKa2 obtidos para o B3B, recalculou-se a

concentrao normalizada das espcies 3, 4 e 5 para cada pH em cada
porcentagem de gua/etanol (exemplificado a 60 % de gua/etanol na Figura 10),
utilizando-se a Equao 8 (Albert e Serjeant, 1971). Esse procedimento permite
visualizar mais facilmente a questo de sobreposio que afetaria os clculos dos
pKas.

c3= K1K2/D

c4= K1[H+]/D

c5= [H+]2/D, onde D= [H+]2 + K1[H+] + K1K2 (8)

37

1,00

0,75

[B3B] 0,50

0,25

0,00
1

pH

Figura 10: Concentrao normalizada do B3B em 60 % de gua/etanol para

a espcie 3 (), 4 () e 5 (). Estimada para pKa1 = 3,3 e pKa2 = 5,7.

Como ilustrado na Figura 10, nos pHs correspondentes ao pKa1 e ao pKa2

as concentraes respectivas das espcies 3 e 5 so nulas, ou seja, no h
interferncia nas determinaes confirmando-se que clculos independentes de
pKa podem ser realizados.
Um ponto importante a ser lembrado que o pKa1 (grupo amino) obtido
diretamente pela mudana espectral que ocorre imediatamente aps adio do
composto no meio, enquanto que o pKa2 (grupo carboxlico) foi determinado aps
as amostras atingirem o equilbrio (medida indireta). A favor da confiabilidade dos
resultados obtidos para o pKa2 tem-se que medidas realizadas no tempo infinito ou
5 minutos aps a adio do substrato (60 % de gua) resultaram em valores de
pKa2 muito prximos entre si. Este resultado mostra que, neste caso, a presena
de agregados no afeta as determinaes. Outro ponto favorvel que as

38
anlises efetuadas em 672 e 688 nm resultaram em valores de pKas idnticos aos
obtidos em 430 nm.
Os resultados ilustrados na tabela 1 revelaram uma igualdade nos valores
de pKa1 determinados para o composto B3B com aqueles do DiesterB, em 40 e 60
% de gua. Este resultado confirma que no caso do B3B o pKa1 corresponde a
protonao dos nitrognios pirrlicos (grupos amino) enquanto que, por excluso,
o pKa2 relativo ao grupo carboxlico. Este dado, ao menos neste composto,
elimina possveis controvrsias existentes na literatura quanto a atribuio dos
pKas (Cunderlkov e col, 1999). Adicionalmente nota-se que a troca dos grupos
perifricos, carboxlico/carboxilato (B3B) ou metil-ester (DiesterB), no influencia o
pKa dos nitrognios.
Analisando os valores de pKa do B3B em porcentagens superiores a 60 %
de gua (Tabela 1) observa-se efeitos contrrios para o pKa1 e pKa2, isto , um
aumento no contedo de gua na mistura, leva a aumento da acidez do grupo
amino e, ao mesmo tempo, decrscimo da acidez do grupo carboxlico. Abaixo
so representadas as equaes de dissociao cida do B3B de forma
esquematizada para os grupos de interesse:
pKa1

pKa2

Como j citado, os pKa de cidos orgnicos devem ser associados a

parmetros experimentais (meio, temperatura, etc.) e estruturais da molcula

39
afetando a entalpia e a entropia do sistema. Lembra-se que a acidez geralmente
leva a formao de ons no meio e, no caso com o alto teor de gua no solvente,
tem-se uma maior estabilizao destes ons por solvatao e pela alta constante
dieltrica influenciando, principalmente, na entalpia; desse modo, ao aumentar-se
o teor de gua, a acidez do composto ficaria maior (pKa menor) (Hendrickson e
col,1970). Em oposio, na solvatao de um on, molculas de gua so
fortemente induzidas a polarizao, ficando a gua com forte ordenamento; neste
caso tem-se reduo da entropia do solvente, aumentando positivamente a funo
energia livre de Gibbs correspondente ao processo de dissociao cida (ou seja,
o cido torna-se mais fraco em gua) (March, 1985). Assim provavelmente os dois
fatores agem em sentidos opostos, sendo que para cidos orgnicos que
possuem estabilizao estrutural intrnseca, o termo TS normalmente prevalece
ao de entalpia (Sykes, 1987).
No caso do B3B, as molculas de solvente, por ligaes de hidrognio,
estaro mais ordenadas ao redor do grupo carboxilato do que do carboxlico
(Equao 10). Conseqentemente acontecer perda de liberdade por parte do
solvente no primeiro, com diminuio da entropia, fator desfavorvel acidez, ou
seja, considera-se uma contribuio mais marcante do efeito de entropia
comparado entalpia. Apesar de no acreditarmos que este efeito seja o nico
responsvel pelo aumento do pKa2, este deve prevalecer. Quanto ao pKa1
(referente a acidez do grupo amino), observa-se que ao aumentar-se o teor de
gua aumenta-se a acidez, como normal em cidos onde prevalece o efeito de
entalpia. Por outro lado, avaliando-se o equilbrio em termos de entropia, ter-se-ia

40
que a molcula protonada, duplamente carregada, seria mais solvatada pela gua.
Assim a entropia do sistema, medida que aumenta-se o teor de gua, seria
desfavorvel a essa espcie e, conseqentemente, a acidez seria maior.

4.2- Planejamento Fatorial 23

A princpio para estudar isoladamente cada estrutura e analisar a

magnitude dos efeitos experimentais em cada espcie de B3B de maneira
otimizada, o planejamento fatorial 23 foi empregado separadamente em cada pH
atravs da determinao em dois nveis (+ e -). Neste estudo os contedos de
gua em etanol foram restritos a 40 % (-) e 60 % (+) de gua, as concentraes de
composto de 4,4x10-6 mol L-1 (-) e 26,5x10-6 mol L-1 (+) e o tempo de anlise de 5
min (-) e 360 min (+). Dentro dos pHs escolhidos (pH= 7,0, 4,1 e 2,6) as
concentraes das espcies 3, 4 e 5 foram calculadas a 60 % de gua a partir dos
dados de pKa (Tabela 2).

Tabela 2: Concentrao estimada de B3B em 40 e 60 % de gua/etanol em

valores selecionados de pH.
pH

espcie 3 (%)

espcie 4 (%)

espcie 5 (%)

7,0

95,2

4,8

4,1

2,1

84,6

13,3

2,6

16,6

83,4

Os valores calculados de concentrao das espcies de B3B a 60 %,

conforme tabela acima, podem ser considerados iguais aos de 40 % uma vez que

41
os valores de pKa1 so muito similares e no se espera grandes diferenas no
pKa2 com estes teores de gua (Tabela 1).
Tomando-se as espcies 3 e 4 como as principais formas ativas para o
B3B, ambas no estado monomrico, o coeficiente de absortividade molar aparente
(688= absorbncia/[B3B]total) foi utilizado como resposta para avaliar o impacto de
um fator experimental sobre a estabilidade do monmero quando elevamos um
dado nvel do fator de (-) para (+).
A estratgia mostrada na Tabela 3 em cada pH para o planejamento fatorial
23 foi combinao de todos os nveis de acordo com a matriz de planejamento.
Nesta tabela esto includas tambm as respostas obtidas (mdia dos resultados
de 688 aparente). A partir destes dados calculou-se a intensidade dos fatores para
cada parmetro investigado, incluindo as interaes de segunda e terceira ordem
(Tabela 4).

Tabela 3: Matriz de planejamento e resultados experimentais para o

planejamento fatorial 23 do B3B em diferentes pHs. Fatores: tempo (t),
concentrao do B3B (c) e porcentagem de gua (%).

Nmero
Exp.

Varivel
c

pH= 7,0
688
(Lmol-1cm-1)

pH= 4,1
688
(Lmol-1cm-1)

pH= 2,6
688
(Lmol-1cm-1)

1
2
3
4
5
6
7
8

+
+
+
+

+
+
+
+

+
+
+
+

36600
36600
32800
35000
34200
34300
29500
33900

33800
33000
31400
33900
27300
7800
11400
3600

14800
14200
15400
15900
9700
9200
10100
8500

42
Tabela 4: Intensidade dos efeitos e grupos de interaes no B3B.

(mdio)
t
c
%
txc
tx%
cx%
txcx%

pH= 7,0
34100 185
1675
370
-2625 370
-2275 370
1625 370
575
370
75
370
525
370

pH= 4,1
22800 215
-6400 430
-5400 430
-20500 430
3750 430
-7250 430
-4650 430
2100 430

pH= 2,6
12200 85
-550
170
500
170
-5700 170
0
170
-500
170
-650
170
-550
170

Em pH 7,0, onde a espcie 3 prepondera (Tabela 2), a varivel tempo

apresenta um pequeno efeito positivo, indicando que a agregao desta espcie
no ocorre facilmente; pode-se observar que a interao de segunda ordem (txc)
apresenta a mesma magnitude (aumento mdio aproximado de 1650370 L mol-1
cm-1). Todas as outras interaes de segunda e terceira ordem foram
insignificantes. Os principais impactos estimados nesse pH so a concentrao de
B3B e a porcentagem de gua no solvente. De 4,4x10-6 mol L-1 para 26,5x10-6 mol
L-1 o efeito mdio do diminui 2625370 L mol-1 cm-1, enquanto que de 40 para 60
% de gua a diminuio mdia 2275370 L mol-1 cm-1. Ambos os efeitos so
negativos, indicando que ao passar do nvel (-) para (+) h uma diminuio da
absortividade aparente sugerindo que um aumento na concentrao do B3B e na
porcentagem de gua leva a espcie 3 a uma pequena agregao mesmo com a
carga no grupo carboxilato. Entretanto deve-se apontar que neste pH existe
aproximadamente 5 % da espcie 4 (tabela 2) tendo esta molcula tendncia
agregao. De qualquer forma, nessas condies de pH o mdio aparente do

43
monmero 34100185 L mol-1 cm-1, mostrando (apesar da pequena agregao)
que o frmaco est majoritariamente estabilizado na forma monomrica.
Os resultados obtidos (Tabela 4) para o planejamento fatorial em pH= 4,1
mostram que os trs fatores (t, c e %) so altamente significantes e, variando do
nvel (-) para o nvel (+) a diminuio no coeficiente de absortividade molar
aparente acentuada. Nesta condio de pH apenas o grupo carboxilato est
protonado, assumindo a forma carboxlica, estrutura indicada como espcie 4
apresentada no Esquema III (forma neutra dominante, tabela 2). Relembrando que
a diminuio no 688 est associada com a agregao do B3B, as condies
estabelecidas no nvel (+) esto induzindo a agregao do composto. As
influncias dos trs fatores no processo podem ser interpretadas como o discutido
anteriormente, ou seja, neste caso com a anulao da carga, a molcula no
estado monomrico torna-se instvel em gua e agrega mais com o tempo e
concentraes maiores de B3B. O principal efeito encontrado neste pH foi a
varivel porcentagem de gua (-20500430 L mol-1 cm-1, Tabela 4). Alm disso, as
interaes secundrias obtidas com a % de gua, sugerem efeitos cooperativos e
apontam para as mesmas explicaes.
Em pH 2,6, onde a estrutura majoritria a espcie 5 (Tabela 2),
novamente a varivel mais significativa foi porcentagem de gua (diminuio
mdia no valor da absortividade molar aparente de 5700170 L mol-1 cm-1), como
apontado em pH 7,0 e 4,1. Para todos os outros fatores, incluindo suas interaes
de segunda e terceira ordem, a intensidade dos efeitos calculados no foi
significativa

(apesar

dos

valores

serem

maiores

que

erro

padro).

44
Provavelmente a molcula carregada com duas cargas positivas nos nitrognios
internos estabiliza a unidade monomrica do B3B, prevenindo a agregao,
mesmo estando presente em soluo 17 % da espcie 4 misturada com a espcie
5 (tabela 2).
Adicionalmente, a porcentagem de variao foi calculada para os fatores e
efeitos cooperativos para dar uma idia geral da magnitude relativa de cada
parmetro individual. Os efeitos mdios do nos nveis (-) e (+) foram calculados
pela (-/4) e (+/4) para cada parmetro no pH correspondente. A porcentagem
de variao foi obtida comparando esses valores calculados com os valores
mdios dos (apresentado na Tabela 4, primeira linha), esses resultados esto
ilustrados na Figura 11.

Porcentagem de variao

50

25

-25

-50
t

txc

tx%

cx%

txcx%

Efeitos

Figura 11: Variaes vs efeitos na estabilidade do B3B: em pH= 7,0 ( ),

pH= 4,1 ( ), e pH= 2,6 ( ). Linhas tracejadas e slidas correspondem
respectivamente aos nveis experimentais inferior e superior.

45
Percebe-se que as condies experimentais afetam a estabilidade da
espcie 4, a qual muito mais acentuada do que para as espcies 3 (pH= 7,0) e 5
(pH= 2,6). Porm o marcante efeito causado pela porcentagem de gua no
aparece somente na espcie 4 (pH= 4,1), mas tambm nos experimentos
realizados em pH= 2,6, onde se tem a predominncia da espcie 5; este resultado
somente pode ser visualizado atravs da metodologia aplicada na Figura 11.
Uma vez que os resultados do planejamento fatorial 23 apontaram que o
efeito principal que rege a estabilizao do B3B o contedo de gua em etanol,
expandiu-se o intervalo de propores das misturas de gua/etanol.
A variao do coeficiente de absortividade molar aparente do B3B, em cada
pH, em funo da porcentagem de gua na mistura mostrada na Figura 12. Para
a realizao deste estudo optou-se por utilizar as variveis tempo e [B3B] nos
seus nveis superiores, isto , [B3B]= 26,5x10-6 mol L-1 e t= 360 min.
Em meio alcalino/neutro o coeficiente de absortividade molar aparente do
B3B foi de 34000 L mol-1 cm-1 em baixa porcentagem de gua (30 %), com
pequena queda para 32000 L mol-1 cm-1 em 65 % de gua em etanol. Pode-se
afirmar que nesta regio de pH, onde a espcie 3 predominante, o aumento no
contedo de gua na mistura quase no afeta a estabilidade dos monmeros de
B3B.
Em pH intermedirio o aparente do B3B fortemente influenciado pelo
contedo de gua na mistura (Figura 12), passando de 34000 L mol-1 cm-1 em 30
% de gua a 1900 L mol-1 cm-1 em 65 % de gua. Nessa regio de pH verificou-se
que o composto est praticamente todo na forma agregada. A ocorrncia deste

46
fato atribuda a espcie 4 (neutra), a qual grandemente desestabilizada pela
presena de gua no meio.
36000

-1

-1

688 (L mol cm )

24000

12000

0
20

30

40

50

60

70

% de gua

Figura 12: Variao do coeficiente de absortividade molar aparente do B3B

em funo da porcentagem de gua em: pH= 7,0 (), pH= 4,1 () e pH= 2,6 () .
Tempo de anlise= 360 min. c= 26,5x10-6 mol L-1.

Em meio cido e baixas porcentagens de gua o coeficiente de

absortividade molar aparente do B3B 16100 L mol-1 cm-1 e diminui para 3000 L
mol-1 cm-1 em altas porcentagens de gua. Nota-se que, mesmo com a presena
de cargas (espcie 5), a estabilidade da forma monomrica do B3B afetada pelo
aumento no contedo de gua pois observa-se gradativa queda de aparente
(mesmo em 60 % onde os pKas pouco mudam). Acima de 60 % tem-se, como
efeito adicional, a diminuio de pKa1 (e o aumento do pKa2) Tabela 1,
aumentando no pH= 2,6 a quantidade da espcie neutra 4 o que fatalmente levaria
a maior agregao.

47
4.3- Estudo Cintico

No caso do B3B em 40 % de gua em etanol o frmaco mostrou-se

extremamente estvel, no se observando variao espectral com o tempo,
independentemente do pH (chegou-se a monitorar por 40 dias). Entretanto com o
B3B em misturas a 60, 65 e 70 % de gua/etanol e pHs em regies determinadas
observou-se a agregao gradativa com o tempo. Uma viso geral do
comportamento em funo do pH, nas misturas estudadas, pode ser observada na
Tabela 5.

48
Tabela 5: Comportamento agregacional do B3B em funo do pH. M referese aos picos de monmero (430 e 688 nm) e A ao pico de agregado (720-740 nm).
As setas indicam as variaes de intensidade dos mesmos com o tempo. c=
4,4x10-6 mol L-1, [NaCl]= 0,1 mol L-1, [tampo]= 0,016 mol L-1, T= 30,0o C.
% de gua

Regio de pH

60

1,8 3,4

3,4 5,7

5,7 6,8

1,8 2,3

2,3 3,6

3,6 5,1

MeA

5,1 5,9

5,9 6,9

1,8 2,3

2,3 2,8

2,8 5,8

MeA

5,8 6,0

6,0 6,8

65

70

Reflexo

Os dados ilustrados na Tabela 5 indicam que de maneira geral, o

comportamento agregacional do B3B similar nas trs porcentagens de gua
estudadas. Nos casos em 60 % de gua/etanol, em que se observa variao
espectral com o tempo, tem-se apenas a diminuio dos picos de monmeros sem
a presena de pico adicional (ao menos na concentrao de B3B empregada
neste experimento). Neste caso forma-se um tipo de agregado no cromforo na
regio de anlise como citado previamente. Em situaes similares, em 65 e 70 %

49
de gua/etanol, alm da queda dos picos de monmero com o tempo, observa-se,
simultaneamente, o surgimento do novo pico na regio de 720-740 nm atribudo
aos agregados diferenciados (Delmarre e col, 2001; Hioka e col, 2002; Simplcio e
col, 2004A; Simplcio e col, 2004B).
A Figura 13 mostra como exemplo a variao espectral do B3B com o
tempo na mistura a 70 % de gua em pH= 3,0.

0,5
0,16

Soret
Absorbncia

0,12

Absorbncia

0,4

0,3

0,08

0,04

660

680

700

720

740

Comprimento de onda (nm)

0,2

0,1

0,0
400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 13: Variao espectral do B3B em 70 % de gua/etanol. c= 4,4x10-6

mol L-1 em pH= 3,0. T= 30,0 C. As setas mostram a tendncia dos picos de
monmero e agregado. A insero a ampliao tomando-se os espectros em
intervalos de 36 seg.

Uma avaliao detalhada, observada na insero da figura acima, mostrou

a ausncia de ponto isosbstico, o que significa um mecanismo complexo,
implicando na existncia de um equilbrio de mltiplas etapas (Simplcio e col,
2004A; Espenson, 1981; Dixon e Steullet, 1998). Para efetivar-se a escolha do

50
comprimento de onda para anlise cintica avaliou-se a absorbncia em funo do
tempo (Figura 14) junto aos picos de monmeros (430 e 672 nm) e agregados
(720-740 nm).

0,5

a - Agregado
b - Soret
c - Pico em 672 nm

Absorbncia

0,4

0,3

0,2

b
a

0,1

0,0
0

10

20

30

tempo (min)

Figura 14: Absorbncia em funo do tempo em 70 % de gua/etanol, c=

4,4x10-6 mol L-1, pH= 3,0. T= 30,0 C.

Como ilustrado na figura, a variao da absorbncia em qualquer um dos

comprimentos de onda mostra uma fase com uma etapa lenta de reao inicial,
seguida de uma outra rpida.

Esse perfil cintico idntico ao exibido pelo

DiesterB em regies intermedirias de pH e foi anteriormente estudado em

diversas misturas aquosas de solvente orgnico pelo grupo (Simplcio e col,
2004A; Simplcio e col, 2004B). O formato sigmoidal das curvas tpico de
reaes auto-catalticas, sendo a fase lenta de reao normalmente chamada de
lag e a rpida de log. A partir da Teoria do Caos e do procedimento adotado
por Pasternack (Pasternack e col, 1998) nosso grupo de pesquisa tem proposto a

51
seguinte seqncia de eventos para a formao do agregado final (Simplcio e col,
2004A; Simplcio e col, 2004B): inicialmente ter-se-ia um passo lento de formao
de pequenos ncleos, ou germes de agregao, que serviriam de base de
sustentao para a formao rpida (catalisada) de agregados maiores. Para
obter-se os parmetros cinticos usou-se a Equao 7 e a tcnica de ajuste de
curvas. No se fixaram os valores de absorbncia inicial e final na rotina de
clculo.
A partir de dados similares aos da Figura 14 calculou-se os parmetros k0,
kc, m e n obtidos nos comprimentos de onda correspondentes a monmeros (430
e 688 nm) e agregados (720-740 nm) em diversas regies de pH. Os valores de
constantes de velocidade mostraram-se prximos entre si, principalmente os
valores de kc (ou seja, so razoavelmente independentes do comprimento de onda
monitorado), porm os parmetros n e m foram inconstantes. A no confiabilidade
do parmetro cintico n claramente exibida por Pasternack (Pasternack e col,
1998) e em nosso trabalho no foi levado em considerao. Quanto ao parmetro
m apresentado por Pasternack como sendo apenas relacionado ao tamanho do
ncleo, nosso grupo sugere que este termo, alm do tamanho, reflete a
quantidade de ncleos formados (Simplcio e col, 2004A; Simplcio e col, 2004B).
Os resultados calculados nas trs porcentagens em diversos pHs esto
apresentados na Figura 15.

52

0,030

15

(a)

0,020

10

0,015

Constantes de velocidade (min

-1

0,025

0,010
5
0,005

0,000
0
3

pH

(b)

0,24

0,18
3
0,12

0,06

0,00
1
2

pH

Constantes de velocidade (min

-1

0,30

53

10

-1

Constantes de velocidade (min )

(c)

2
2
0

pH

Figura 15: Parmetros cinticos em gua/etanol a vrios pHs. (a) 60 % de

gua; (b) 65 % e (c) 70 %. k0 (), kC () e m (). c= 4,4x10-6 mol L-1, [NaCl]= 0,1
mol L-1, [tampo]= 0,016 mol L-1, T= 30,0 C.

Atravs da Figura 15, nota-se que, em todas as misturas estudadas, o perfil

das curvas o mesmo, ou seja, em regies intermedirias de pH os valores de k0
e kc so elevados, enquanto que nas regies extremas de pH os valores so
baixos. Nos dados ilustrados na tabela 2, onde se recalculou as concentraes do
B3B a partir dos valores de pKa, nota-se que em regies altas e baixas de pH temse pouca quantidade da espcie 4 (forma agregante). Entretanto nas regies
intermediarias encontra-se a maior quantidade desta, aproximadamente 85 %. A
predominncia da espcie 4 favorece a formao de agregados e, no prequilbrio, favorecer-se-ia uma maior quantidade de ncleos de agregao; assim
a maior quantidade de catalisador iria, conseqentemente, causar um aumento

54
das constantes de velocidade em conformidade ao que foi obtido. Nota-se tambm
que o aumento do contedo de gua em etanol (comparao interna das figuras
15a, 15b e 15c) causa uma elevao nos valores de constantes de velocidade.
Este fato pode ser atribudo a maior instabilidade do monmero do B3B em
elevadas porcentagens de gua como j amplamente discutido. O termo m,
reflexo do tamanho (e segunda nossa proposta da quantidade) de ncleos,
apresenta certas irregularidades de forma que no se pode inferir claramente a
seu respeito.

55
5- CONCLUSES

Atravs dos valores de pKa dos nitrognios pirrlicos determinados para o

DiesterB e B3B em 40 e 60 % de gua pode-se constatar que a presena de
grupos

perifricos

ao

anel

porfirnico

pouco

afeta

esta

propriedade.

Adicionalmente, atravs da comparao entre o DiesterB e o B3B, pode-se

comprovar que o pKa1 corresponde ao equilbrio cido-base dos nitrognios
pirrlicos enquanto que o pKa2 corresponde ao do grupo carboxlico. Os valores de
pKa determinados para o composto B3B mostraram que o aumento na
porcentagem de gua favorece a acidez do grupo nitrognio do anel pirrlico e,
simultaneamente, reduz a acidez do grupo carboxlico.
Para as trs regies de pH estudadas o contedo de gua em etanol
apresentou o efeito mais acentuado na instabilidade do monmero de B3B,
especialmente em pH 4,1, onde tem-se o composto com carga neutralizada. Os
resultados apontam que mesmo em meio neutro e cido (extremos usados neste
trabalho), onde as estruturas predominantes da molcula apresentam cargas, h a
possibilidade de agregao nas condies experimentais em que todas as
variveis testadas esto em nveis mais elevados. A forma terapeuticamente fotoativa de base livre pode ser obtida controlando-se o pH, sendo ressaltado ainda
que esta varivel modula a carga do composto, o que deve ser usado para
contornar o processo de agregao.
Os resultados cinticos demonstram que em regies intermedirias de pH,
onde a molcula de B3B encontra-se na forma neutra, a agregao ocorre de

56
forma mais rpida e acentuada reforando as indicaes obtidas no tratamento
estatstico.
Em termos de aplicao mdica, um resultado bastante significativo foi
detectar o aumento do pKa do grupo carboxlico do B3B em altos teores de gua,
solvente este usualmente empregado na teraputica devido a compatibilidade com
os fludos biolgicos. Neste caso tem-se uma aproximao deste pKa ao pH
fisiolgico causando aumento na concentrao do B3B na forma carboxlico
(espcie neutra) que a forma mais passvel de sofrer agregao, diminuindo
assim a eficincia em TFD. Vale lembrar que como apontado na introduo, o pH
de tecidos tumorais apresenta-se mais baixo que o de tecidos sadios, tornando
este problema ainda mais preocupante.

57
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