.

Artculo de investigacin
Anticuerpo realce tardo dependiente del paso bajo el dengue
virus 4 aislamientos
Nitwara Wikan 1, Sirikwan Libsittikul 1, Sutee Yoksan 1 2, Prasert
Auewarakul 2 3 yDuncan R. Smith 1 2 *
*Autor para la correspondencia: Duncan R
Smithduncan.smi@mahidol.ac.th; duncan_r_smith@hotmail.com
Afiliaciones de los autores
1Instituto de Biociencias Moleculares de la Universidad de Mahidol,
Salaya Campus, 25/25 Phuttamonthol Sai 4, Salaya 73170, Nakorn
Pathom, Tailandia
2Centro para Enfermedades Emergentes y Infecciosas Desatendidas,
de la Universidad de Mahidol, Salaya Campus, 25/25 Phuttamonthol
Sai 4, Salaya 73170, Nakorn Pathom, Tailandia
3Departamento de Microbiologa de la Facultad de Medicina, Hospital
Siriraj, Universidad de Mahidol, 2 Wanglang Road, Bangkoknoi,
Bangkok 10700, Tailandia
Para todos los correos electrnicos de autor, por favor inicie sesin.
BMC Notas de Investigacin 2015, 8: 399 doi: 10.1186 / s13104-0151381-8
La versin electrnica de este artculo es el que completa y se puede
encontrar en lnea en:http://www.biomedcentral.com/1756-0500/8/399
Recibido:
27 de enero 2015
Aceptado:
24 de agosto 2015
Fecha de publicacin:
02 de septiembre 2015
2015 Wikan et al.
Artculo AccessThis abierto se distribuye bajo los trminos de la licencia
Creative Commons Attribution 4.0 License
Internacional (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite
el uso ilimitado, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre
que usted da apropiada crdito al autor (s) original y la fuente,
proporciona un enlace a la licencia Creative Commons, e indicar si se
han realizado cambios. La renuncia Dedicacin Creative Commons Public
Domain (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a
los datos facilitados en este artculo, a menos que se indique lo
contrario.

Abstracto
Fondo
El concepto de mejora dependiente de anticuerpos (ADE) de la infeccin
por el virus del dengue (DENV) es una piedra angular de nuestra
comprensin actual de la patogenia del dengue, a pesar de algunas
dudas sobre el mecanismo siguen siendo, sobre todo en lo que respecta
al comportamiento de los virus de baja y alta paso asla. Este estudio
utiliz dos bajo DENV paso 4 aislamientos y un laboratorio adaptado
DENV 4 aislado para investigar el potencial de paso bajo asla a
someterse ADE.
Resultados
Se observ poca o ninguna ADE de la infeccin en 2 das despus de la
infeccin con aislamientos paso bajo, mientras que la alta mejora de la
infeccin se observ con el laboratorio adaptado virus. Sin embargo,
tanto de los aislamientos de paso de bajos mostraron altos niveles de
infeccin (60-100%) por da 5 despus de la infeccin.
Conclusiones
Estos resultados muestran que bajo DENV paso 4 se someten a la
infeccin por virus mediada ADE, pero que el proceso se retras
significativamente temporalmente en comparacin con laboratorio
adaptado DENV 4.
Palabras clave:
Anticuerpo mejora dependiente; Dengue; La infeccin; Clulas U937
Fondo
El virus del dengue es el mosquito ms importante transmitida
enfermedad viral humana en todo el mundo. Cada ao se cree que son
unos 400 millones de casos de infeccin, de los cuales unos 100 millones
mostrar algunos sntomas[1]. Infecciones sintomticas resultan en un
amplio espectro de enfermedades, que van desde fiebre indiferenciada
leve, a la fiebre del dengue a presentaciones ms graves de la
enfermedad hemorrgica del dengue y el sndrome de choque por
dengue[2]. Las muertes pueden resultar de la infeccin con el virus del
dengue, aunque stas son relativamente poco frecuentes, donde las
instalaciones de hospitalizacin adecuadas y los conocimientos tcnicos
apropiados estn disponibles [3].
La especie de virus del dengue (familia Flaviviridae, gnero Flavivirus)
se compone de cuatro virus diferentes de virus del dengue denominado
(DENV) 1-4. La infeccin primaria en unos ingenuos resultados
individuales en la generacin de amplia y robusta inmunidad adquirida,
ofreciendo a largo plazo, y la inmunidad posiblemente toda la vida a la
DENV infectar, sin embargo, slo la inmunidad transitoria se genera
contra las infecciones con DENVs heterotpicos[3]. Es importante
destacar que algunos anticuerpos generados contra el DENV inicial
pueden reconocer, pero no neutralizar un virus heterotpica y estos
DENV: anticuerpo no neutralizantes pueden internalizarse en las clulas

del receptor Fc teniendo como monocitos y macrfagos [2] las clulas

que son normalmente o bien no susceptible o slo escasamente
susceptibles a la infeccin directa con DENV. Este proceso, llamado
anticuerpo mejora dependiente (ADE) de la infeccin fue descubierta en
gran parte por el trabajo de Halstead y colegas que observaron que los
niveles sub-neutralizacin de anticuerpos podran desencadenar este
proceso[2] -[5]. En particular, se cree que ADE se expande la masa
disponible de las clulas diana, as como que conduce directamente a la
infeccin de los principales reguladores del sistema inmune que resulta
en una presentacin ms grave, y varios estudios han puesto de
manifiesto la relacin entre la segunda infecciones con un virus
heterotpicos y la enfermedad severidad[6] -[8]. El concepto de ADE
sustenta gran parte de nuestra comprensin de la patognesis de las
infecciones DENV, y juega un papel importante en la conformacin de
desarrollo de la vacuna donde los esfuerzos se centran en la generacin
de un uniforme y la respuesta inmune igual a los cuatro DENVs para
evitar posibles problemas de menores de individuos vacunados con
severa la enfermedad como consecuencia de una infeccin natural
adquirida [9].
Recientemente, el concepto de ADE de la infeccin fue parcialmente
desafiado por Chaichana y colegas que mostraron que los virus aislados
directamente de los pacientes DENV mostraron poca o ninguna ADE de
la infeccin in vitro, mientras que los virus de laboratorio adaptado
sometieron a ADE significativo de infeccin usando suero o plasma de la
misma pacientes [10]. Los autores concluyeron que la fuente del virus
era un factor importante en ADE, y por otra parte que la ADE de la
infeccin con virus de laboratorio visto adaptado in vitro fue una
consecuencia de paso repetido del virus[10]. Hemos observado
recientemente un fenmeno similar con el paso bajo (en comparacin
con los virus de unpassaged Chaichana y sus colegas) aislados de DENV
4. Usando un protocolo optimizado con un anticuerpo monoclonal, se
encontr que las condiciones que dieron lugar a alta ADE de la infeccin
de clulas U937 con una virus adaptado laboratorio result en poco o
nada de la infeccin con el virus de baja de paso[11]. La publicacin del
documento Chaichana[10] que no mirar a DENV 4 en su estudio hizo que
el estudio actual en la que se realiz un anlisis ms completo de
nuestro estudio preliminar[11] para tratar de encontrar la razn por
bajas 4s DENV pasaje aparentemente no pudieron someterse a ADE de
la infeccin.Sorprendentemente, se muestra que bajo DENV paso 4
aislamientos de hecho se someten a ADE de la infeccin, pero que este
es significativamente retrasado temporalmente en comparacin con los
virus de laboratorio adaptado.
Resultados y discusin
Clulas U937 no diferenciadas son altamente susceptibles a la infeccin
por DENV mediada ADE, pero son poco susceptibles a la infeccin
directa DENV [12],[13]. Estudios previos han sugerido que DENVs baja

de paso o DENVs aislados directamente de los pacientes no sean objeto

de ADE, o someterse a ADE slo escasamente en comparacin con los
virus de laboratorio adaptado[10],[11]. Para investigar ms a fondo, se
seleccionaron tres DENV 4 aislados, uno de los cuales era un laboratorio
de alto pasaje (LAB) virus (DENV 4 LAB), uno un DENV 4 aislado de
fiebre dengue (DF) paciente adaptado y se pasaron tres veces en C6 / 36
(DENV 4 DF) y uno un DENV 4 aislado de fiebre hemorrgica del dengue
(FHD) pacientes y se pasaron tres veces en C6 / 36 (DENV 4 FHD).Bajo
condiciones estndar, estos tres virus se incubaron con ningn
anticuerpo o diluciones crecientes de un anticuerpo producido por el
hibridoma HB 114, que hemos demostrado previamente para ser capaz
de mediar ADE con DENV 4 LAB[12]. Las clulas se incubaron en
condiciones estndar y se recogen en los das 1, 2, 3 y 5 despus de la
infeccin antes del anlisis por citometra de flujo para determinar el
grado de la infeccin. Resultados (Fig. 1) muestran altos niveles de
mejora de la infeccin con DENV 4 LAB desde el da 2 despus de la
infeccin, con la mejora mxima observada con diluciones de
anticuerpos entre 1: 200 y 1: 2000, en consonancia con nuestras
observaciones anteriores[12]. De manera significativa, tanto DENV 4 DF
y DENV 4 DH mostr poco o nada de ADE en el da 2 despus de la
infeccin, pero por el da 3 (DENV 4 DF) o el da 5 (DENV 4 FHD) despus
de la infeccin, las clulas infectadas con el paso bajo los aislados
mostr un alto grado de la infeccin, con la mejora mxima que se
observa con diluciones de anticuerpo de 1: 200. Cabe destacar que las
clulas infectadas con DENV 4 DF mostraron casi el 100% de infeccin
por el da 5 despus de la infeccin, mientras que las clulas infectadas
con DENV 4 DH mostraron aproximadamente un 60% la infeccin.

Fig. 1. ADE de la infeccin de las clulas U937 con DENVs

altas y bajas de paso. Complejos anticuerpo-virus se generaron
con un LAB DENV 4, bDENV 4 DF y c DENV 4 DHF y diferentes diluciones
de HB 114 anticuerpos antes de la incubacin con las clulas U937 y el
posterior cultivo durante 1-5 das despus de la infeccin. El grado de
infeccin se determin mediante citometra de flujo. El experimento se

llev a cabo de forma independiente por triplicado y error bares mostrar

SEM
Estos resultados sugieren que cualquiera de los aislamientos de paso
bajo estn entrando en las clulas durante el perodo de la infeccin,
pero estn experimentando retrasado significativamente la replicacin, o
que el proceso de infeccin en s se retrasa en comparacin con los virus
de laboratorio adaptado. El concepto de la replicacin del retraso ha sido
establecida previamente con el virus del Nilo Occidental[14], y se cree
que los virus virulentos replican ms lentamente para evitar la deteccin
inmune innata, mientras que los virus atenuados se someten a la
replicacin rpida desencadenar una respuesta inmune ms fuerte
innata.
Para abordar esta cuestin, una condicin optimizada de ADE de la
multiplicidad de infeccin (moi) 1 y 1: 200 se seleccion dilucin de
anticuerpo y despus de la 2 h de incubacin de las clulas con el
complejo anticuerpo-virus, las clulas se lavaron para eliminar ONU
internalizado complejos de virus y posteriormente se incubaron en un
medio estndar. Se observ una marcada reduccin en el nivel de DENV
4 infeccin LAB, pero slo los niveles mnimos (<20%) de la infeccin
fueron vistos con los dos bajo el paso asla (Fig. 2 a), ni siquiera por da 5
despus de la infeccin.Cuando se omiti la etapa de lavado, los altos
niveles de infeccin se observaron de nuevo con DENV 4 DF por da 3 y
DENV 4 DHF por da 5 (Fig. 2 b). Los experimentos de control utilizando
un anticuerpo anti-alfavirus emparejado isotipados no mostraron
evidencia de infeccin por encima de los niveles observados con ningn
anticuerpo (Fig. 2 b). Estos experimentos muestran que no es la
replicacin del virus que se retrasa en el pasaje bajo asla, pero el
proceso de infeccin en s. En paralelo con estos experimentos, las
clulas se incubaron con virus pero sin anticuerpo.Estos son
efectivamente una evaluacin de la capacidad de los virus para entrar
directamente en las clulas U937 en ausencia de la formacin del
complejo anticuerpo-virus. Algunos (<20%) la infeccin directa se
observ con se observ DENV 4 LAB, pero no hay ninguna entrada
directa fue visto con el paso bajo asla.

Fig. 2. Anlisis de la infeccin ADE de clulas U937 con

DENVs altas y bajas de paso. DENV 4 LAB, DENV 4 DF o DENV 4 FHD se
incubaron con una dilucin 1: 200 de HB114 anticuerpo monoclonal (+
HB 114) o con un isotipo de anticuerpo anti-alfavirus emparejado (+
alfa) de control segn el caso, o con un volumen equivalente de medio
antes de la incubacin con las clulas U937 para 2 h despus de lo cual

las clulas fueron un lavaron con PBS y se incubaron con medio de

crecimiento normal (RPMI suplementado con 10% FBS) con la adicin
diaria de medio normal a las clulas, o b se incubaron con medio de
crecimiento normal con Adems diaria de medio normal a las clulas
o D incub con medio de crecimiento normal con adicin diaria de medio
de crecimiento normal que contiene una dilucin 1: 1.000 de 114 HB
anticuerpos. Infeccin Porcentaje fue determinada por citometra de flujo
y se llevaron a cabo todos los experimentos de forma independiente por
triplicado.Las barras de error muestran SEM M infeccin simulada, DH
(DENV 4 FHD) DF (DENV 4 DF), DL (DENV 4 LAB). C Placa de ensayo de
los sobrenadantes de (b) ensaya en da "0" (inmediatamente despus
de la infeccin) 1, 2, 3 y 5 despus de la infeccin. Tambin se muestra
el ttulo del virus de entrada (-2 h). Se llevaron a cabo ensayos de placa
de forma independiente por triplicado con el ensayo duplicado de ttulo
Para proporcionar una confirmacin adicional de la infeccin retardada
de clulas U937 con paso bajo asla, los sobrenadantes de las
infecciones con la etapa de lavado se omite, pero anticuerpo incluye
(como se muestra en la Fig. 2 b) se ensayaron para la concentracin de
virus infecciosos en los das 0 a 5 das despus de la infeccin por el
ensayo de placa estndar. Resultados (Fig. 2c) demostraron que el ttulo
del virus para DENV 4 LAB haba terminado ttulo de entrada (como se
ensay en "da 0") por el da 2 despus de la infeccin, los ttulos de
virus para DENV 4 DF y DENV 4 FHD haban terminado virus de entrada
en los das 3 y 5 respectivamente (Fig. 2 c). Estos resultados son
consistentes con los datos de porcentaje de infeccin como se determin
por citometra de flujo (Fig. 2 b).
En una serie final de experimentos, la infeccin se repiti de nuevo sin
lavado despus de la incubacin del complejo de virus o virus-anticuerpo
con las clulas, y esta vez un 1: 1000 se aadi la dilucin del
anticuerpo diariamente a todos los infecciones. Esto incluy las clulas
que fueron infectadas con virus que no tenan la etapa de formacin del
complejo anticuerpo inicial (es decir, la infeccin directa), pero
anticuerpo se aaden a diario al medio de cultivo. Resultados (Fig. 2 d)
mostr altos niveles de infeccin en todas las muestras. Los niveles de
infeccin de DENV 4 LAB y DENV 4 DF aparentemente cayeron despus
de alcanzar un pico, pero esto se debi a un mayor nmero de clulas
muertas en los medios de cultivo (aunque esto no se evalu
formalmente). Es importante destacar que tambin se observaron altos
niveles de infeccin en los experimentos en los que se haba aadido
ningn anticuerpo durante el perodo de la infeccin original, pero slo
complementan post infeccin (Fig. 2 d).

Combinados, estos resultados muestran claramente que bajo DENV paso

4 aislamientos se someten a ADE de la infeccin en presencia de un
anticuerpo adecuado, pero que el proceso es algo temporalmente
retardada con paso bajo en comparacin con los aislados de virus de
laboratorio adaptado. Adicin de anticuerpo al da despus de la
infeccin inicial mejorado notablemente el nivel de infeccin, y sugiere
que el protocolo de infeccin estndar de permitir complejo de
anticuerpo-virus para formar antes de la infeccin no es
necesario. Aunque nuestro estudio utiliza DENV bajo pasaje 4
aislamientos y cepas no unpasssaged usadas por Chaichana y sus
colegas[10], nuestros resultados con DENV 4 dengue hemorrgico, en el
que no hay infeccin fue visto hasta el da 5 estara en consonancia con
sus observaciones que fueron tomadas slo despus de la infeccin 3
das. La infeccin poco antes visto con DENV 4 DF apoyara su
observacin de que la fuente del virus es importante. Estudios anteriores
han sugerido que ADE de la infeccin tiene tanto un extrnseca y un
componente intrnseco[15]. ADE extrnseca es el aumento de la
captacin de los complejos de virus / anticuerpo, mientras que ADE
intrnseca es la supresin de la respuesta inmune innata[16]. En este
caso, es posible que el bajo DENV paso 4 aislamientos no suprimen la
inmunidad innata, as como el aislante alto pasaje, que conduce a la
infeccin por el perfil comparativamente retardada.
Conclusiones
Aunque de alcance limitado, este estudio ha demostrado que existe una
variacin significativa en el perfil temporal de la infeccin ADE de
diferentes DENVs. El mecanismo requiere ms investigacin, pero el
estudio pone de relieve la necesidad de considerar los puntos de tiempo
ms largos cuando se utilizan los virus de baja de paso.
Mtodos
tica
Los dos bajo DENV pasaje aislamientos describe en este estudio fueron
recogidos originalmente en 2006 tras individual por escrito el
consentimiento informado en un estudio aprobado por el Comit de tica
para la Investigacin en Seres Humanos, Ministerio de Salud Pblica,
Tailandia [17], [18].
Las clulas y los virus
Vero (ATCC No. CCL-Cat 81), LLC-MK2 (ATCC CCL-Cat No. 7), U937 (ATCC
CRL-Cat No. 1593.2) y C6 / 36 [19] Las clulas se cultivaron tal y como
se ha descrito previamente[20]. Laboratorio adaptado DENV 4 (cepa
1036; GenBank adhesin KM519590) se propag exactamente como se
describe anteriormente[12]. El virus utilizado haba sido passaged 5
veces en clulas de mamferos y 4 veces en clulas C6 / 36 antes de su
uso en este estudio. Dos cepas de DENV 4 utilizadas fueron aisladas de
un paciente de dengue y fiebre hemorrgica del dengue DENV paciente
4DF (GenBank: KM519591) y DENV 4DHF (GenBank: KM519592)

respectivamente. Estos virus se pasaron tres veces en clulas C6 / 36

antes de su uso en este estudio. Ambos pacientes fueron identificados
serolgicamente como tener infecciones secundarias. Estos virus se
pasaron tres veces en C6 / 36 antes de ser almacenada a -80 C hasta
su utilizacin. El ttulo del virus de todos los virus se determin por
ensayo de placa estndar en clulas LLC-MK2, esencialmente como se
describe en otra parte [21].
Protocolo de infeccin ADE y evaluacin de la infeccin
Stock DENV a una MOI de 1 se incub con cualquiera de RPMI o con
diluciones crecientes de un anticuerpo monoclonal purificado en casa de
hibridoma HB114 [22] durante 1 h con agitacin constante a 4 C para
generar complejos de anticuerpos de virus que luego se agregaron a 3
10 6 U937 clulas en medio RPMI seguido de incubacin a 37 C
durante otras 2 h con agitacin constante. Las clulas se resuspendieron
luego a una dilucin de 3 10 5 clulas ml -1 en tampn RPMI
suplementado con 10% de suero bovino fetal (RPMI-10%) antes de la
incubacin a 37 C.En algunos casos las clulas se lavaron con PBS
antes de la resuspensin. Fresh RPMI-10% se aadi a diario, que en
algunos casos se complementa adicionalmente con anticuerpos
monoclonales producidos por hibridoma HB114[22] en una dilucin 1:
1000. Se llevaron a cabo experimentos de control; adicionalmente
utilizando un anticuerpo anti-isotipo alfavirus (Santa Cruz Biotechnology,
Inc. Santa Cruz, CA sc-58088).
La citometra de flujo para determinar la infeccin porcentaje se llev a
cabo esencialmente como se describe en otro lugar [12]. Brevemente,
aproximadamente 1 x 10 6 clulas se recogieron por centrifugacin a
1.000 g durante 5 min, se bloquearon con 10% de suero normal de
cabra (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) en solucin salina tampn fosfato
(PBS) y se dej en hielo durante 30 min, fija en 4% de paraformaldehdo
(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) en PBS durante 20 min y se
permeabilizaron con 0,2% Triton X-100 (Calbiochem, Merck KGaA,
Darmstadt, Alemania) en PBS durante 10 min. Despus de lavar una vez
con 1% de BSA en PBS, las clulas se tieron para la expresin
intracelular del antgeno de dengue utilizando una dilucin 1:20 de
anticuerpos monoclonales de hibridoma HB114[22] la noche a 4
C. Despus de lavar dos veces con 1% de BSA en PBS una dilucin 1:40
de una IgG anti-ratn de cabra policlonal conjugado con FITC (KPL,
Gaithersburg, MD) se utiliz como anticuerpo secundario y las clulas se
incubaron durante 1 h y despus se lav dos veces anteriormente. Las
clulas lavadas se resuspendieron en 100 l de PBS y se analizaron por
citometra de flujo (FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA)
utilizando software CELLQuest (BD). Se llevaron a cabo experimentos
de forma independiente en todas las triplicado. Las clulas infectadas
fueron cerrada como M1 (datos sin procesar se proporciona en el archivo
adicional 1).

Abreviaturas
ADE: mejora dependiente de anticuerpos
DENV: virus del dengue
DF: la fiebre del dengue
DH: el dengue hemorrgico
Archivo adicional
Archivo adicional 1 :. valores puerta Raw M1 para todos los
experimentos.
Formato: XLS Tamao: 31KB Descargar archivo
Este archivo se puede ver con: Microsoft Excel Viewer
Autores de las contribuciones
NW, PA y DRS dise el estudio. SY proporcionado virus bajas de
paso. NW y SL realizaron todo el trabajo experimental. NW y DRS
redact el manuscrito y todos los co-autores revisaron el manuscrito de
importante contenido intelectual. Todos los autores leyeron y aprobaron
el manuscrito final.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de la Oficina de la Comisin de
Educacin Superior y la Universidad de Mahidol en virtud de la Iniciativa
Nacional de Universidades de Investigacin, Universidad de Mahidol y el
Fondo de Investigacin de Tailandia (RTA5780009 y IRG5780009). NW es
apoyado por una beca de la Universidad de Mahidol Post-Doctoral. Los
financiadores no tena papel en el diseo del proyecto, la recopilacin de
datos, la interpretacin o la decisin de publicar.
El cumplimiento de las normas ticas
Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen intereses en
conflicto.