Inativao fotodinmica de Escherichia coli utilizando azul de metileno e verde

malaquita sob luz LED vermelha: um estudo comparativo

D1

A.M. Freitas1, G. K. F. Hasegawa1, J. L. Morais2, M. Soares1. (1) Grupo GPTEc, Departamento de Qumica e
Biologia, Universidade Tecnolgica Federal do Paran, Curitiba, Paran, Brasil, adrianefreitas@utfpr.edu.br.
(2) Departamento de Fsica, Universidade Tecnolgica Federal do Paran, Curitiba, Paran, Brasil.

Photodynamic inactivation (PDI) uses a

combination of a photosensitizer, light, and
demolecular
Fsica, UTFPR,
Sede
Curitiba,
oxygen
toCentro,
achieve
destruction of a
biological target. The main objective of this
study Brasil.
was to evaluate the PDI of Escherichia
Paran,
coli (ATCC 25922) in water, using two
photosensitizers (FS), methylene blue and
malachite
green,
and
a
multi-LED
monochromatic light ( = 660nm, 335.8 J cm-2).
Malachite
green
(250
mol
L-1)
photosensitization was able to achieve
reductions of over 89% in the viable counts of E.
coli, after 15 min of irradiation. Methylene blue
(1000 mol L-1), at the same conditions of
irradiation, showed a rate growth inhibition of
96%.
Introduo
A Inativao Fotodinmica (IFD) baseia-se na
ao combinada de um fotossensibilizador (FS), luz
e oxignio molecular para destruio de um alvo
biolgico [1]. Na presena de oxignio encontrado
nas clulas, o FS ativado pode reagir com
molculas na sua vizinhana por transferncia de
eltrons ou hidrognio, levando produo de
radicais livres, como OH, oxignio singlete e
outras espcies reativas de oxignio (EROs). Estas
reagem com quase todos os componentes
celulares, levando morte celular [2]. A IFD tem
sido extensivamente desenvolvida para fins
teraputicos, especialmente no tratamento de
tumores. Recentemente se tornou claro que este
campo tem um elevado potencial tambm para fins
ambientais, como a desinfeco de gua e
efluentes [1, 3].
O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a
inativao fotodinmica (IFD) de Escherichia coli
utilizando como fotossensibilizadores os corantes
azul de metileno e verde malaquita, irradiados com
lmpada LED (light emitting diode) vermelha.
Materiais e Mtodos
Neste trabalho, verde malaquita (Vetec) e azul de
metileno
(Vetec)
foram
utilizados
como
fotossensibilizadores (Fig. 1). Solues-estoque
foram preparadas em gua deionizada e estocadas
a 4C no escuro antes do seu uso. Como
microrganismo modelo de contaminao fecal foi
utilizado Escherichia coli (ATCC 25922). As
bactrias foram cultivadas aerobicamente em caldo
BHI e incubadas a 37C por 24h. Os inculos
bacterianos foram padronizados de acordo com a
escala de McFarland [4]. Uma lmpada multi-LED
(18 LEDs, 127V, 3W, =600 660 nm), foi utilizada
com fonte de irradiao. A distncia entre a
lmpada e superfcie irradiada da amostra foi de 3
cm. A intensidade luminosa na amostra foi medida
com auxlio de um luxmetro (EXTECH Instruments,

modelo 403125) e a densidade de energia em

funo do tempo de iluminao foi calculada (112,
224 e 336 J cm-2 para 5, 10 e 15 min,
respectivamente). A fim de definir a concentrao
mais adequada de FS para realizao dos testes
da IFD (toxicidade 20% na ausncia de
irradiao), diversas solues dos FSs (1050.000mol L-1 para AM e 100-1.000mol L-1 para
VM) foram testadas. Suspenses bacterianas (106
UFC mL-1) foram mantidas em contato com as
solues de FS por 10 min na ausncia de luz.
Aps o tempo de exposio foi feita a quantificao
bacteriana. Para avaliao da IFD, suspenses de
106 UFC mL-1 foram colocadas em bqueres
(volume final: 100mL) e distribudas nos seguintes
grupos: controle negativo (bactria + gua
deionizada), somente FS (B+FS), somente
radiao (B+L) e IFD (B+FS+L), onde o tempo da
irradiao variou em 5, 10 e 15 min. Para
quantificao
bacteriana,
alquotas
foram
inoculadas em placas de Petri com meio PCA e o
nmero de unidades formadoras de colnia (UFC
mL-1) foi determinado. Todos os procedimentos
foram realizados em triplicata. A porcentagem de
inibio de crescimento de E. coli foi calculada
considerando o grupo B+FS+L em relao ao
grupo controle B+FS.
Resultados e Discusso
Para a avaliao da IFD foram escolhidas as
concentraes de 1000 e 250 mol L-1 para o AM e
para o VM, respectivamente. Estas concentraes
foram as menores que causaram efeito inibitrio
20% na ausncia de irradiao (Tab. 1). Tanto o
VM quanto o AM causaram inativao fotodinmica
da suspenso de E. coli (Tab. 2). O efeito
fotodinmico foi nitidamente observado quando
comparado com o efeito isolado de cada FS ou da
irradiao. Tambm houve uma relao crescente
de eficincia de inibio do crescimento bacteriano
com o tempo de exposio irradiao, que est

diretamente relacionado densidade de energia

fornecida suspenso bacteriana (Fig. 2).

uma maior inibio fotodinmica foi obtida quando

o VM foi usado em concentraes maiores que
aquelas
empregadas
para
os
corantes
fenotiaznicos. Neste caso, a fonte de radiao
empregada foi o laser.

Figura 1. Estrutura do azul de metileno (A) e do verde

malaquita (B).

Logo, pode-se assumir que o ambos os FS foram

fotoativados pela luz vermelha emitida pela
lmpada LED (590-670nm) e que a interao com
o O2 molecular pode ter gerado espcies reativas
de oxignio, como 1O2, O2-, OH e H2O2 [5]. Mesmo
no levando a uma taxa de inibio prxima ao
100%, os resultados foram siginificativos uma vez
que o tempo mximo de exposio foi de 15min e
que lmpadas LED so de baixa potncia.
Trabalhos similares, que utilizaram AM como FS,
tiveram resultados superiores porm empregando
tempos de at 60min [6] e outras fontes de
radiao, como laser [7]. Cabe ainda ressaltar que
a colorao das suspenses bacterianas derivadas
dos fotossensibilizadores no foi alterada, ou seja,
se manteve aps o tempo mximo de radiao (15
min). Tempos maiores de radiao ou o uso de
concentraes mais baixas dos FSs poderiam
contribuir para uma perda gradativa da cor no
efluente final. Os testes da IFD confirmaram que o
VM se mostrou mais txico que o AM, pois uma
mesma taxa de inibio (aproximadamente 90%)
foi obtida com uma concentrao quatro vezes em
relao ao AM. Dentre os corantes, AM um dos
mais
estudados
como
molcula
fotossensibilizadora, enquanto que para o VM
poucos dados so citados na literatura. Estudos
recentes compararam a eficincia fotodinmica do
VM com outros FS fenotiaznicos (azul de metileno
e azul de toluidina) em biofilmes de Staphylococcus
aureus e E. coli [7]. Os resultados revelaram que

Figura 2. Efeito do tempo de irradiao na inativao

fotodinmica de Escherichia coli.

Fontes de luz de maior potncia, como o laser,

em geral traz resultados de inibio mais
satisfatrios, porm o alto custo energtico acaba
sendo um inconveniente. Vrias fontes alternativas
de luz tem sido pesquisadas e uma das que
despertam maior interesse luz LED (light-emitting
diode) devido ao seu baixo custo. Alm disto,
possvel encontrar estas lmpadas em diversas
cores, com radiaes cobrindo quase todo espectro
visvel, incluindo luz vermelha. Mesmo sendo de
baixa potncia em relao ao laser, estas
vantagens econmicas possibilitam o uso de novos
compostos na IFD [8].

Tabela 1. Efeito da concentrao de azul de metileno e verde malaquita no crescimento de Escherichia coli.
AM (1000mol L-1)

[AM]

Mdia

(mol L-1)

(UFC mL )

50.000
10.000

VM (250mol L-1)

CVa

%
inibio

[VM]

Mdia

(mol L-1)

(UFC mL )

14414

0,10

45,59

1000

147

0,4

92,2

1749

0,05

34,45

750

2911

0,33

83,4

1000

20311

0,06

23,37

500

514

0,30

70,9

100

24111

0,05

11,39

250

849

0,13

306

10

2356

0,06

8,87

100

1305

0,08

153

-1

-1

CVa

% inibio

CV=coeficiente de variao. AM=azul de metileno. VM=verde malaquita.

Tabela 2. Efeito da Inativao Fotodinmica (IFD) em Escherichia coli utilizando azul de metileno e verde
malaquita.
-1

-1

AM (1000mol L )
Tratamento

Mdia
-1

(UFC mL )

VM (250mol L )

CVa

%
inibio

Mdia
-1

(UFC mL )

CVa

% inibio

Controle negativo

1297

0,06

---

1427

0,05

---

B+L

12620

0,19

---

13311

0,08

---

B+FS

8016

0,20

---

974

0,04

---

B+FS+L (5 min)

5711

0,19

29,16

829

0,12

15,56

B+FS+L (10 min)

196

0,30

763

625

0,09

363

B+FS+L (15 min)

73

0,38

91,22

1574

0,25

84,52

CV=coeficiente de variao. AM=azul de metileno. VM=verde malaquita.

Concluses
A Inativao Fotodinmica tem sido extensamente desenvolvida para propostas teraputicas, como
tratamento de tumores, de derivados sanguneos e doenas periodontais e de pelo. Porm, sua aplicao
ambiental, na desinfeco de guas e efluentes contaminados ainda insipiente. Trabalhos recentes
sugerem que o uso de molculas fotossensibilizadoras combinadas como uma fonte de irradiao, que
pode ser a solar, pode vir a ser uma alternativa s tecnologias convencionais de purificao da gua. Neste
trabalho, tanto AM quanto VM mostraram atividade fotodinmica em relao a E. coli, aps
fotossensibilizao com lmpada LED vermelha.
Referncias
[1] N. A. Kuznetsova, D. A. Makarov, O. L. Kaliya, G. N. Vorozhtsov, J. Hazard. Mater., 146 (2007) 487.
[2] Carr, V.; Gaud, O.; Sylvain, I.; Bourdon, O.; Spiro, M.; Blais, J.; Granet, R.; Krausz, P.; Guilloton, M.; J. Photochem.
Photobiol., B 48 (1999) 57.
[3] J. R. Perussi, Qum. Nova, 30 (2007) 988.
[4] NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for
Bacteria That Grow Aerobically, NCCLS M7-A6, 2003.
[5] T.A. Konovalova, J. Lawrence, L.D. Kispert, J. Photochem. Photobiol. A, 162 (2004) 1.
[6] L. S. Peloi, R. R. S. Soares, C E G Biondo, V. R. Souza, N. Hioka, E. Kimura, Photodynamic effect of light-emitting diode
light on cell growth inhibition induced by methylene blue, J. Biosci. 33 (2008) 231.
[7] S. F. G. Vilela, J. C. Junqueira, J. O. Barbosa, M. Majewski, E. Munin, A. O. C. Jorge, Photodynamic inactivation of
Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilms by malachite green and phenothiazine dyes: An in vitro study, Archiv.
Oral Biol., 57 (2012) 704.
[8] T. S. Mang, Lasers and light sources for PDT: past, present and future, Photodiagnosis Photodynamic Therapy 1 (2004)
43.