Materiales y mtodos:

Muestras de saliva humana:

Los protocolos de estudio recibieron la aprobacin y el consentimiento
informado del Human Research Ethics Committes ( HREC) of Mater Health
Services y The University of Queensland (UQ).
Tambin se dio el consentimiento del estudio de la regulacin de microflora
oral por la interaccin de los metabolitos salivales junto a la leche materna, en
el caso de adultos tambin se recibi el consentimiento informado de los
donadores.
El permiso para la recoleccin de saliva de infantes fue recibido por la misma
entidad y el consentimiento informado para la recoleccin de saliva de estos
fue recibido por las madres de ellos.
La recoleccin de saliva en ambos casos (adultos e infantes) es considerado
con el mnimo riesgo de herir, incluso se hall que ninguno de los infantes
mostro alguna reaccin de angustia durante la recoleccin en la cual se us
hisopos de algodn durante 30 segundos.
Para calcular el lmite de deteccin de los metabolitos de nucletidos salivales
se us HPLC - espectrometra de masas (LC -MS / MS)
Como parte de los requerimientos ticos, el poder estadstico aceptable
requiere de 53 participantes en el caso de estudios salivales, este valor fue
aumentado; en el caso de neonatos en un valor de 60 y de adultos en 77. De
los 60 neonatos los padres de 20 aceptaron que sus infantes participaran en un
largo estudio de 6 semanas( n=20), seis meses ( n=19) y 12 meses (n = 14)
despus de la recoleccin inicial.
Otras muestras de saliva en mamferos:
Se seleccion mamferos domesticados y de granja. La seleccin se bas
esencialmente en una
lgica relativa a la dieta (la cual es reflejada por la microbiota oral) y el tracto
digestivo.
Gato: carnvoro obligatoria ; perro : omnvoro ; caballo, vaca, oveja , cabra y
camello : herbvoros ; vacas, ovejas y cabras son rumiantes ; caballos tienen
saculacin pre - rumiante ; camellos son pseudo-rumiantes.
En la recoleccin de la saliva(al babear) se dio usando hisopos de algodn por
lo que no causo ningn dao, malestar o alarma en ellos. Tambin hay que
tener en cuenta que la recoleccin de saliva en animales no es sujeto de
aplicacin tica segn The Animal Care and Protection Act 2001 perteneciente
a la agricultura.
Los animales domsticos se muestrean de forma no intrusiva por un
veterinario registrado

La saliva de perros y gatos fue recolectada antes de que sean alimentados, se

prepar sus alimentos y se coloc en tazones para estimular la salivacin la
cual fue recogida al babear.
En el caso de mamferos herbvoros fue problemtico al inicio debido a la
contaminacin de la vegetacin.
En consecuencia, se recogi la saliva de las vacas mientras esperaban para la
rutina de ordeo, tiempo durante el cual no regurgitan el bolo alimenticio.
Saliva de ovejas , caballos y camellos se recolectaron utilizando hisopos
orales de algodn suave durante sus exmenes dentales regulares
En todos los casos, se requiere menos de 20 segundos para el muestreo, y en
ningn caso era un animal restringido nicamente con el propsito de
muestreo. La toma de saliva se llev a cabo en un entorno normal del da a da
del animal.
La saliva se recogi de 8 vacas ( 5 de las 8 muestras usando hisopos de
algodn , 3 recogidas de la
baba oral) , 5 ovejas ( hisopos de algodn ) , 7 perros ( hisopos de algodn), 5
gatos ( hisopos de algodn), 5 caballos ( muestras recopilada usando pipetas
de plstico de poliestireno ) , 4 cabras ( hisopos de algodn), y un solo camello
(bastoncillo de algodn).
Los estudios en animales son destinados exclusivamente para comparar los
patrones de metabolitos salivales de sus nucletidos con los del ser humano.
Leche materna
El permiso tico para la donacin de leche materna fue cubierto por MHS HREC,
con el consentimiento informado por escrito que suministran las madres
donantes . Las muestras de leche materna fueron recolectados de 24 madres ,
de 1 a 5 das despus del parto . Las muestras de leche se colocaron en hielo
sin demora y luego transferidos al laboratorio en el que se subdividieron en
porciones para el ensayo inmediato de H2O2 endgeno, o para el
almacenamiento a -80 C para su posterior anlisis , tales como ensayos de
XO
Ensayo de la peroxidasa de hidrogeno
Todo los ensayos de H2O2 y ensayos parecidos se incubaron en placas de
microtitulacin de fondo plano (Becton Dickinson, Australia) a 37 C con
agitacin, en un fluormetro FLUOstar Omega a temperatura controlada (BMG
Labtech , EE.UU.), hasta que la reaccin se detuvo.
El ensayo de produccion de H2O2 por una mezcla de saliva neonatal con leche
materna, para simular la succin , se logr mediante la mezcla de 33 l de leche
materna diluida, 33 l de saliva neonatal y 34 l reactivo de peroxidasa. Las
concentraciones de hipoxantina y xantina en la muestra de saliva neonatal
fueron de 70 mM y 30 mM , respectivamente.
El clculo de la generacin de H2O2 se basa, en el supuesto de que la saliva
de la leche materna y la neonatal se mezclan en la boca del recin nacido en

un aproximado 1 : 1 que es la relacin durante el amamantamiento , y que 1

mol de xantina produce 1 mol de H2O2 , mientras que 1 mol de hipoxantina
genera 2 moles H2O2.

Actividades de la Xantina oxidasa y la enzima peroxidasa

Para el ensayo de la actividad de XO de leche, la leche materna (almacenada a
-80 C) se diluy
en proporcin 1:30 con el tampn Tris inmediatamente antes del ensayo.
Inmediatamente, 50 l de leche diluida se mezcl con 50 l de 'Reactivo de
peroxidasa'. Los parmetros cinticos se estimaron para XO en muestras de
leche materna utilizando 6 concentraciones de hipoxantina de 0, 8, 12.5, 25,
50, 100, 200, 300, 400 M.
La produccin de H2O2 se control durante 60 min en el fluormetro, durante la
oxidacin de hipoxantina a cido rico. Para confirmar que el H2O2 fuera
producido por la actividad de XO solamente, se aadi el inhibidor de
oxipurinol-XO especfico (Sigma-Aldrich Pty Ltd, Australia) a la mezcla de
ensayo anterior con agrupado de la leche materna en un rango de
concentraciones finales de hasta 25 mM.
El lmite inferior para la deteccin de la actividad en las condiciones de ensayo
fue de 0,1 / L, una unidad (U) se define como la produccin de 1 mol de
H2O2 por min. La actividad de XO tambin se evalu en el secado de la leche
para lactantes frmula 'Aptamil Gold Plus ', la leche materna pasteurizada y
leche bovina pasteurizada.
La actividad de la peroxidasa en la leche se atribuye generalmente a LPO,
mientras que la actividad de la 'peroxidasa salivar' (SPO) se considera que es
una mezcla de mieloperoxidasa y LPO . Para el ensayo de la actividad de la
peroxidasa en la leche materna o en la saliva, 50 l de leche materna o saliva
se diluy en 1:15 de calcio / magnesio libre de fosfato- tamponada-solucin
salina (PBS), se mezclaron con 50 micro l 100 microM de Ampliflu Red y 200
microM H2O2 en PBS. La
reaccin se control en el fluormetro como para la actividad de XO.

El ensayo de tiocianato salival

El ensayo de tiocianato se bas en un mtodo espectrofotomtrico
desarrollado para la saliva humana utilizando el mtodo de nitrato frrico ,
adaptada para placas de microtitulacin .

Inhibicin del crecimiento bacteriano por el perxido de hidrgeno

La Escherichia coli (ATCC 2592), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), especies
de Salmonella (ATCC 1311) y Lactobacillus plantarum (UQM 297) se obtuvieron
a partir del cultivo microbiano de la coleccin de la Universidad de Tecnologa
de Queensland . Para probar la inhibicin directa de H2O2, se diluyeron las

poblaciones bacterianas en 'caldo nutritivo de Oxoid '(Oxoid Pty Ltd, Australia)

a una concentracin final de 200 unidades formadoras de colonias (CFU) / ml, a
continuacin se aadieron alcuotas de 50 microL a los pocillos de placas de
microtitulacin con diluciones en serie de H2O2 en caldo nutritivo hasta
concentraciones finales de 400, 200, 100, 50, 25, 12, 6, 3, 1,5, 0,75, 0 M, por
triplicado. Un control negativo contena H2O2 y slo caldo nutriente. Las
placas de microtitulacin selladas se incubaron a 37 C durante 24 h o 48 h
con agitacin. Se determin el crecimiento de bacterias usando un lector de
placa de microtitulacin (XMark, Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Australia) como
absorbancia a 600 nm. El caldo nutritivo Oxoid , en comn con la mayora de
los medios de comunicacin estndar, contiene concentraciones significativas
de purinas y pirimidinas: encontramos hipoxantina (121 mM), xantina (36 mM),
adenosina (19 mM), inosina (148 mM), guanosina (65 M) y uridina (87 mM) ms
otros niveles de trazas de metabolitos de nucletidos.
Preparacin de saliva simulada Neonatal
Ya que estaba disponible, slo en pequeos volmenes, la saliva neonatal,
'simulado de saliva neonatal' se prepar poniendo en comn las muestras
salivales de 50 adultos, recogidos por babeo pasivo. Este a 56 C en un bao
de agua durante 35 minutos con mezcla, para eliminar la actividad de
anticuerpos presentes en la saliva de adultos pero que es insignificante en la
saliva neonatal . A continuacin, la saliva se esteriliz por vaco de filtracin a
travs de un filtro de 0,45 micras (Grace Discovery Science, Australia) para
eliminar las bacterias presentes en la saliva de adultos, as como la materia en
partculas, pero no las mucinas y otras protenas. Esta resultante de 'saliva
neonatal simulado' fue suplementado con hipoxantina y xantina, y /o inosina,
adenosina, guanosina, uridina y uracilo (27, 20, 11, 12, 7, 5,3, 12 mM,
respectivamente)con / sin oxipurinol 100 M, para producir cuatro controles
diferentes. Estos nuclesidos / concentraciones de base correspondieron a los
valores de la mediana de los metabolitos en la saliva neonatal. Los 27 microM
de hipoxantina ms 20 microM de xantina pueden producir tericamente 74
microM H2O2 (suponiendo que el
XO convierte cada mol de hipoxantina y xantina a H2O2 2 y 1 mol,
respectivamente).
Inhibicin o estimulacin del crecimiento bacteriano por leche
materna Mezcla de salivas
Las especies bacterianas en stock, anteriormente se diluyeron en PBS estril y
no en caldo nutritivo. La leche materna fue diluida en relacin de 1: 6 a un
tampn de Tris estril. Cada pocillo de microtitulacin contena 50 l de cuatro
diferentes formulaciones simuladas de saliva neonatal, 25 micro l del diluido de
leche materna, 25 micro l de bacterias para dar una concentracin final
de 200 bacterias CFU / ml en un volumen total de 100 l (por triplicado). El
sellado
placas de 96 pocillos se incubaron 24 h a 37 . Las alcuotas fueron entonces
inoculadas en
placas de agar, se incubaron y CFU . Diluciones seriadas de la xantina e
hipoxantina tambin se prepararon usando este mtodo de ensayo . Las
concentraciones finales de ambos xantina y

hipoxantina eran 0 , 6 , 25 y 50 micras, lo que tericamente puede producir 0 ,

18 , 75 y 150 microM de H2O2
Analisis estadisticos
Los datos de metabolitos de nucletidos que no se distribuyen normalmente
por lo que los valores medios se compararon entre los dos grupos diferentes
utilizando la prueba y entre ms de dos grupos utilizando el test de Kruskal Wallis de Mann-Whitney. Se estimaron los parmetros del modelo cintico de
Michaelis- Menten, Vmax y Km, para XO leche materna mediante anlisis de
regresin no lineal. Todos los datos para XO y estudios de inhibidores
bacterianos se reunieron la suposicin de normalidad; Por lo tanto, los valores
medios se compararon entre los dos diferentes grupos utilizando la prueba t y
entre ms de dos grupos usando ANOVA de una va. Un valor de p de 0.05 se
utiliz como punto de corte para la significacin estadstica .