1.

FUNDAMENTOS BIOLGICOS DE
INMUNOHISTOQUMICA

Es una tcnica que permite localizar molculas en los tejidos mediante el

empleo de anticuerpos (protenas del tipo inmunoglobulina G). La tcnica, por
la gran especicidad \ alta anidad que tienen los anticuerpos para reconocer
molculas \ unirse a ellas, permite detectar cantidades nmas de molculas
presentes en el tejido. La inmensa mayora de tcnicas de inmunohistoqumica
pueden aplicarse a tejido jado e incluido en parana con buenos resultados,
siempre que la jaciyn tisular, su procesado e inclusiyn se realicen adecuadamente
ya que la utilizacin de mtodos o reactivos inapropiados en el tratamiento tisular
previo puede producir prdidas de antigenicidad que limitarn o impedirn la
obtencin de resultados ables.
A continuacin se expondrn los conceptos bsicos que permitirn la
compresin de la tcnica.
Antgenos: Son aquellas sustancias capaces de producir una reaccin

inmune. Sus propiedades inmunolgicas son: inmunogenicidad

(capacidad de producir una respuesta especca bien humoral yo
celular), antigenicidad (capacidad de combinarse con anticuerpos yo
con receptores de clulas), alergenicidad (capacidad de producir reaccin
alrgica). La inmunogenicidad viene dada por una serie de factores, es
decir, depender o bien de la molcula atacada (por ejemplo las protenas
son las ms inmunognicas) o bien del sistema en conjunto (el hombre en
este caso; problemas de respuesta inmune).
Eptopos: Son cada uno de los sitios discretos de una macromolcula

reconocidos individualmente por un anticuerpo especco o por un 7&5

(receptor de linfocitos 7) especco. Son regiones inmunolgicamente
activas.

17

Fundamentos biolgicos de inmunohistoqumica

Anticuerpos: La capacidad de reconocimiento especco de cualquier

tipo de molcula o partcula extraa por parte del sistema inmune, es

posible gracias a que cuenta con las inmunoglobulinas (Ig) y con los
receptores de los linfocitos 7 (7&5), los cuales poseen las cualidades de
diversidad, heterogenicidad y procedencia a partir de reordenaciones de
genes.

Los tipos de Ig que encontramos el suero son las cinco siguientes ordenadas
de mayor a menor concentracin en sangre:
1. La IgG atraviesa la va placentaria. El feto adquiere las primeras
inmunoglobulinas de la madre. No forma anticuerpos a menos que se
produzca una infeccin, por lo que sintetizara IgM. La IgG activa la cascada
del complemento por la va clsica.
2. La IgA se encuentra en la mayor parte de las secreciones corporales, y
produce la activacin de la cascada del complemento por la va alternativa.
3. La IgM se encuentra circulante y se encarga de la activacin de la cascada
del complemento por la va clsica.
4. La IgD se encuentra como molcula de membrana en los linfocitos B.
5. La IgE aparece en alergias e infecciones por parsitos, siendo indetectable
en situaciones normales.

Las inmunoglobulinas se pueden encontrar solubles en sangre o como parte

especca del complejo de las clulas B. Estn constituidas en su estructura
comn por dos tipos de cadenas proteicas: pesadas y ligeras, diferencindose
por sus caractersticas sicoqumicas, siolgicas e inmunolgicas.
Las Ig que se encuentran en las membranas de las clulas B van reconocer al
antgeno, es decir anticuerpos secretados por las clulas plasmticas procedentes
de activacin, proliferacin y diferenciacin de clulas B. Estos anticuerpos se
encuentran en el suero, en los lquidos tisulares (intersticiales) y recubriendo
ciertos epitelios internos. Estas Ig circulantes son los efectores de la rama
humoral del sistema inmune especco, ya que la sola unin antgenoanticuerpo
no es suciente en todos los casos para terminar con l.
En el caso de los receptores de clulas 7 aparecen slo como molculas
de membrana de los linfocitos 7. 5econocen al antgeno restringido por el
complejo mayor de histocompatibilidad o CMH de la clula diana o de la clula
presentadora. El CMH son un conjunto de genes presentes en el cromosoma 6
implicados en la presentacin de antgenos a las clulas 7. Suministran la base de
la inmunidad celular especca (en el caso de los linfocitos 7C) y del mecanismo
de los linfocitos 7 colaboradores (7H).

18

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

x &oPpOeMo antgenoanticuerpo AgAc: Dene la unin especca entre

ambos con el n de inhibir o ralentizar la toxicidad del primero. Se realiza gracias
a algunas fuerzas dbiles como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van Der Waals,
interacciones electrostticas e hidrofbicas. La reaccin se caracteriza por su
especicidad, rapidez, espontaneidad y reversibilidad.
x Antisuero: 7ambin llamado suero inPunoOygico, es el suero sanguneo
que contiene anticuerpos policlonales derivados de diferentes lneas de clulas B.
3ara producir un anticuerpo es necesario puricar el antgeno (provocando esta
reaccin). Lo ideal sera separar una clula que fabricase un tipo determinado
de anticuerpo y obtener clones o progenies en medios de cultivo. Esto no es
posible debido a la incapacidad de supervivencia de la clula productora de
anticuerpos en medio de cultivo. Cada linfocito genera una poblacin celular
o clon, genticamente idnticas (mismo anticuerpo). Sin embargo, en un
suero sanguneo no encontramos un solo tipo de anticuerpos, sino una mezcla
heterognea denominada antisuero o anticuerpos policlonales. Esto es debido a
tres razones principalmente:

1. La continua exposicin a antgenos hacen que haya siempre un nivel

basal de respuesta inmunolgica.
2. Los antgenos suelen ir acompaados de impurezas que tambin
producen respuesta inmunolgica dando lugar a otros anticuerpos.
3. El sistema inmune reconoce al mismo tiempo todos los eptopos que
posee un antgeno, dando lugar a distintos anticuerpos para un mismo
antgeno.

Antgeno atacado por anticuerpos policlonales

19

Fundamentos biolgicos de inmunohistoqumica

El problema que se presenta con los Ac policlonales son los inconvenientes

que existen en su uso:
9
La falta de reproductibilidad de resultados, ya que la respuesta inmune
vara de unos individuos a otros dentro de una misma especie, e incluso en
un mismo individuo en funcin del momento en que se haga la extraccin
del suero.
9Obtencin de cantidades limitadas, que dependen de los lotes de
animales inmunizados.
9
3uricacin laboriosa, cuyo objetivo es eliminar los Ac que reaccionan
de forma cruzada no especca.
9Incapacidad para discriminar determinantes antignicos diferentes
dentro de una misma molcula o clula, ya que no pueden diferenciar
entre Ag en la membrana de una misma clula.
Para la tcnica de inmunohistoqumica, sern necesarios los anticuerpos
monoclonales (puros) que slo podrn obtenerse a travs de tcnicas in vitro de
una clula hbrida llamada KibridoPa. El hibridoma es la fusin de linfocitos B
productores de anticuerpos y una lnea celular de mieloma (clulas B cancergenas)
que no producen inmunoglobulinas propias y tienen una expectativa de vida
innita. La primera fase en la produccin de anticuerpos monoclonales (o
mononucleados) consiste en la seleccin del antgeno (mediante fusin celular),
stos son puricados parcialmente, vgr por disgregacin subcelular, lavado
con un disolvente apropiado (elucin) de bandas protenicas a partir de geles
de acrilamida o enriquecimiento cromotogrco. Posteriormente, se inyecta
al animal experimental con los antgenos seleccionados, esperando que cada
linfocito produzca un anticuerpo especco. Los linfocitos se extraern del bazo
o del torrente sanguneo, y tendrn un carcter Portal que, al fusionarlo con un
mieloma asumen un carcter inPortal. La clula resultante con una nueva carga
genmica, guarda su especicidad en la produccin de anticuerpos homogneos
(y nicos, de all su denominacin de anticuerpos monoclonales) al originar un
clon de nuevas clulas, con la rapidez del mieloma.
Los Ac monoclonales poseen las siguientes ventajas frente a los policlonales:
9
Homogeneidad en el proceso de obtencin, consiguindose siempre Ac
idnticos.
9
No requiere usar Ag puricados.
9
Los cultivos pueden proporcionar el Ac de forma ilimitada.

20

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

21

UNIDAD FORMATIVA 2:
ASPECTOS TCNICOS DE LA
INMUNOHISTOQUMICA
2. 1. Marcaje inmunohistoqumico
2. 2. Procesamiento en inmunohistoqumica
2. 3. Aplicaciones de la histoqumica

23

2. ASPECTOS TCNICOS
INMUNOHISTOQUMICA

DE

LA

La inmunohistoqumica permite el estudio de tejidos procedentes de biopsias,

autopsias y material citolgico.
Existen diversos tipos de tcnicas cuya indicacin va a depender de:
Anticuerpo a utilizar: Mono o policlonal.
Material disponible: )resco, congelado o jado en formalina.
Antgenos a estudiar: De supercie o membrana citoplasmticos o
nucleares.

La cuestin ms importante va dirigida a la preservacin del tejido y de los

antgenos.
En general, el proceso histolgico siguiendo una serie de pautas para dicha
preservacin: La jacin se suele hacer en formaldehdo 4 tamponado a pH
.4 (no ms de 244 horas) y la inclusin en parana (se recomiendan paranas
de bajo punto de fusin, ya que a altas temperaturas se pierde inmunoreaccin).
La temperatura no debe superar la del ambiente y si se descalcica la muestra se
realizar con ED7A.
Ser conveniente aplicar alguna forma de jacin para proteger el tejido an
cuando se manejen secciones en congelacin.
Para ello se habr de tener en cuenta que:

x Los jadores que actan por precipitacin de protenas dan mejores

resultados que los jadores por reticulacin o los que contienen oxidantes.
x 8n exceso de jador reduce la inmunoreactividad del tejido.

25

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

x El efecto de cada jador sobre un antgeno puede ser diferente en funcin

de la localizacin histolgica y anatmica de dicho antgeno.
x En muestras de gran volumen la jacin por inmersin no convence ya que
proporciona resultados variables en cuanto a positividad inmunohistoqumica
dndose una mayor tincin en las zonas mejor jadas.
x Hay ciertos antgenos de supercie o receptores nucleares que no deben
jarse ya que puede alterar la muestra. Por ello se debe recurrir a la congelacin
o jacin breve en acetona, cloroformo o una mezcla de ellos.
x La jacin debe ser rpida para evitar la autolisis, si esto no fuera posible
se puede frenarse el proceso a exponiendo el tejido temperaturas de 4 C o en
soluciones conservantes.
x Para acortar el tiempo de jacin puede utilizarse la jacin por microondas.
La capacidad inmunoreactiva se conserva bien tras la aplicacin de algunos
procedimientos rutinarios de decalcicacin (eliminacin de las sales de calcio tras
la jacin).
Los criterios ms importantes para la decalcicaciyn son:

1) Eliminacin completa de las sales de calcio.

2) Ausencia de defectos deletreos de clulas, tejido conectivo y sustancia
fundamental.
3) 4ue no se inhiban procesos como los de jacin y tincin (Walington
1976).
Se suelen utilizar cidos fuertes como el cido ntrico pero aplicado a la
inmunohistoqumica, acabara con la inmunoreaccin en pocas horas. Por eso se
recomienda la utilizacin de ED7A a una concentracin de ,5 M, cido actico
acuoso a una concentracin al 1 o cido frmico al 5.
Respecto al corte, si el procedimiento de inmunotincin se realiza sobre tejido
congelado se harn con el criostato (cortes de 4 - 6 micrmetros), que se secan al aire
a temperatura ambiente durante 2 horas.
A continuacin se jan en acetona absoluta a 4 C durante 5 minutos y se vuelven
a secar al aire durante 30 minutos.
Si la tcnica se va a retrasar en el tiempo, hay que guardar las secciones envueltas
en papel de aluminio y con un desecante a 20 C. Despus se temperan las secciones
a temperatura ambiente sin desechar el envoltorio de papel de aluminio. Cuando esto
se consigue se vuelve a repetir el proceso durante aproximadamente 60 minutos
y a continuacin se realiza una renacin con cloroformo durante 20-30 minutos

26

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

pasndolo por un bao de solucin tamponada por ltimo. Los cortes de parana
se obtienen de un grosor de 3 - 5 micrmetros y se dejan secar toda la noche en la
estufa a 37 C.
El siguiente paso es desparanar cuidadosamente en xileno, para llevar la muestra
hasta alcohol absoluto e hidratarla.
Debido a los numerosos lavados que es preciso efectuar, es frecuente que se
desprendan algunos cortes. Por ello se recomienda emplear un adhesivo que je las
secciones al portaobjetos, con adhesivos como albmina de huevo, gelatina o poli
L-lisina. La precaucin con el adhesivo debe estar presente ya que un exceso de
adhesivo puede ser causa del aumento de tincin inespecca de fondo.
En la actualidad existen en el mercado portaobjetos que presentan una o varias
supercies ligeramente deprimidas donde pueden adherirse los tejidos para realizar
la incubacin sin que ocurran fenmenos de difusin de los reactivos.

2.1 MARCAJE INMUNOHISTOQUMICO

Para visualizar el lugar donde se produce la unin antgeno-anticuerpo es necesario
emplear un trazador o marcador. El marcaje inmunohistoqumico se puede realizar
con uorocromos (tcnicas de inmunouorescencia), tcnicas inmunoenzimticas,
iones metlicos en forma coloidal (tcnica de inmuno-oro) o istopos radioactivos.
La uorescencia es una forma de luminiscencia entendindose sta ltima como
la emisin de la luz que se produce a partir de una fuente de energa no trmica y bajo
el efecto de una excitacin.
La uorescencia priParia o autouorescencia es la propiedad que presentan
determinadas sustancias de forma espontnea sin necesidad de ser modicadas
(la lmina elstica de las arterias muestra autouorescencia en determinadas
condiciones).
En los tejidos que no poseen esta propiedad se puede inducir la uorescencia,
llamndola uorescencia secundaria, esto se puede hacer mediante tincin
histoqumica con sustancias uorescentes llamadas uorocroPos o uniendo
uorocromos a antgenos dirigidos a anticuerpos tisulares.
Los uorocromos son molculas qumicas que absorben la luz a una determinada
longitud de onda emitiendo otra diferente. Se caracterizan por sus espectros de
excitacin y emisin que varan segn el tipo de uorocromo. Su capacidad de
absorber fotones de alta energa procedente de la radiacin ultravioleta o del espectro
visible provoca una redistribucin de los electrones de las molculas uorescentes,
puesta de maniesto por la emisin de una radiacin luminosa de longitud de onda
distinta aunque dentro del espectro visible.

27

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

Si al iluminar una sustancia con luz visible ocurre un fenmeno similar al descrito
y la liberacin de energa se produce de forma gradual, prolongndose la emisin de
luz despus de cesar la iluminacin del objeto, estaremos ante un fenmeno llamado
fosforescencia. Hay uorocromos que producen el llamado fenyPeno de 4uengcKin
(se produce por la colisin entre molculas, ambas con capacidad de uorescencia,
disminuyndose as la intensidad de la uorescencia emitida).
Los uorocromos ms utilizados en las tcnicas de inPunouorescencia son:
x Fluorescena: Absorbe luz azul y emite uorescencia verde manzana.
x 5odaPina: Absorbe luz verde y emite uorescencia roja anaranjada.

La nueva generacin de uorocromos como el alexa or o los dylight or

son generalmente ms fotoestables, brillantes y menos sensibles al pH que otros
de excitacin y emisin comparable.
Estas sustancias pueden unirse de forma covalente a los anticuerpos sin alterar
la unin de stos a sus correspondientes antgenos, por ello esta capacidad es
muy til para visualizar los lugares donde reproduce la reaccin Ag-Ac.

La tcnica inPunoenziPtica se describe como una tcnica de inmunoensayo

en el que un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a
una enzima capaz de generar un producto detectable. 7ambin se le conoce como
tcnica E/I6A.

28

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

El antgeno o anticuerpo estar marcado con una enzima e insolubilizado sobre

un soporte (inmunoabsorbente). As la reaccin Ag-Ac quedar inmovilizada
y ms fcilmente detectada, aadiendo al nal un sustrato ms una sustancia
denominada cromgeno, de tal manera que el producto de la reaccin acta sobre
el cromgeno dando lugar a un precipitado insoluble, coloreado y cuanticable
mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro.
Dentro de estas tcnicas diferenciamos varios reactivos participantes: Ac
primario, que es el que se une especcamente al Ag problema del tejido, y Ac
secundario o Ac puente, que es el que acta uniendo el Ac primario con la enzima
que actuar como marcador. Estos Ac puente se unen a otros Ac debido a los
determinantes antignicos que presenta actuando a modo de Ag frente a otros Ac,
pudiendo de este modo formarse cadenas casi ilimitadas de Ag y Ac.
Hay diferentes tipos de E/I6A:
Anticuerpos Parcados:
E/I6A directo.
9

9
E/I6A indirecto: Es el ms utilizado en la deteccin de anticuerpos. .
9
E/I6A sandZicK:

Heterlogo (HADAS)

Doble (DAS)

Antgeno Parcado
9
E/I6A coPpetitivo: Se parte de un anticuerpo poli o monoclonal, frente
a un antgeno conocido, que previamente ha sido jado en la placa. Se le
denomina de competicin porque el suero problema es incubado previamente
con el antgeno, antes de incubarlo con el antisuero jado en la placa, y por
tanto compite con l. Los pasos siguientes sern los de adicin e incubacin
del conjugado, lavado y nalizacin con el sustrato y lectura.
7odos los tipos de ELISAs citados se pueden resumir en dos grandes grupos:
9 E/I6As para detectar antgenos: E/I6As sndZicK.
Las fases se describen en este orden: un anticuerpo poli o monoclonal
antiantgeno suele estar ya jado a la placa. A continuacin se incuba con
la muestra problema, se aade el conjugado y por ltimo el sustrato. 7odos
los pasos van precedidos de incubaciones y lavados.
E/I6As para detectar anticuerpos: E/I6As indirectos. Las fases se
9
describen en este orden: El antgeno se pega a la placa (inmovilizacin del

29

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

antgeno) y se procede a la adicin del suero problema, incubacin y lavado,

adicin del conjugado, incubacin y lavado, nalizando con la adicin del
sustrato, el frenado de la reaccin y la lectura.

3asos generales de un E/I6A

1. 7apizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo.
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos.
3. 8nin del antgeno o anticuerpo especco al anticuerpo o antgeno
tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no
unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del substrato
9. Unin del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
Encontramos diferencias entre ambas tcnicas ELISAs directas e indirecta
estimables de mencin, en cuanto a:
Facilidad de realizaciyn de la tcnica: La indirecta es ms fcil ya que
en la tcnica directa es necesario el uso de un Ac primario especco para
reaccionar con el Ag especco.
Rapidez: La directa es ms rpida porque se utiliza slo un Ac primario;
en la indirecta al entrar en juego el Ac secundario con una etapa adicional de
incubacin, se alarga el procedimiento de ensayo.

30

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

6ensibilidad: La directa es menos sensible porque el Ac primario se

etiqueta y esta intervencin reduce la inmunoreactividad, algo que no ocurre
en la indirecta.

7ambin en el mtodo indirecto al utilizar Ac secundarios, el nmero de

eptopos para unirse el Ag es mayor y as se amplica la seal y se mejora la
sensibilidad.

Esto ltimo puede ser una desventaja en los casos en los que se produce
una reaccin cruzada del antgeno y el anticuerpo, llevando a error a los
resultados. En el mtodo directo este fenmeno no tiene lugar de producirse
ya que el uso de un solo Ac no da la opcin de reaccin cruzada.
La enzima ms utilizada es la peroxidasa (se obtiene del rbano), as como la
segunda ms frecuente es la fosfatasa alcalina.
La perioxidasa se puede emplear tanto unida al Ac primario, lo que sera la
tcnica directa, como en unos inmunocomplejos llamados PAP (peridoxidasa
+ Ac anti-peroxidasa) que se unirn a un Ac puente (secundario), en tcnica
indirecta.

Amiloide del tipo AA marcado con anticuerpo monoclonal anti-AA. Se trata de una reaccin
positiva de la peroxidasa (colorante unido al anticuerpo anti-AA).

Estos complejos PAP van a actuar como trazadores de la reaccin Ag-Ac. Para
obtener los Ac especcos frente a la peridoxidasa, se le inocula previamente
al animal, y luego se extraen del suero para someterlos a tcnicas in vitro con
la peroxidasa. As se formarn, a travs de una reaccin de precipitacin, los
complejos Ac-Ag peroxidasa-antiperoxidasa o complejos PAP.
A continuacin se procede al revelado del marcador aadiendo el agua
oxigenada (perxido de hidrgeno), siendo en este caso el sustrato, junto al
cromgeno adecuado para esta enzima. La reaccin que tiene lugar es al unirse la

31

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

enzima al sustrato, este libera oxgeno provocando la oxidacin del cromgeno y

originando un producto insoluble y de color pardo.
En caso de que los tejidos sean muy ricos en peroxidasa endgena se utiliza
como trazador la fosfatasa alcalina, para cuyo revelado se utilizan otras sustancias.
Recientemente se han introducido otros mtodos de mayor sensibilidad basados
en la anidad que tienen la biotina y la actina, capaces de generar un enlace no
inmune, y que se practican sobre tejidos previamente incluidos en parana. En
estos mtodos los Ag a demostrar tienen que haber sido desnaturalizados en gran
medida durante el procesamiento histolgico.
La avidina es una glicoprotena de alto peso molecular contenida en la clara
del huevo y en la bacteria Streptomyces Avidinii. La molcula posee cuatro
regiones hidrofbicas de unin con la biotina.
Por otro lado la biotina, es una vitamina de bajo peso molecular que se encuentra
en la yema del huevo y se conjuga fcilmente con Ac y enzimas marcadoras por
ligarse de forma covalente a cadenas laterales amino o carbonilo. Pueden unirse
hasta 150 molculas de biotina por una sola molcula de Ac.
Aunque ambas molculas pueden unirse fcilmente a Ac y enzimas, la biotina
es la que se conjuga antes debido a su pequeo tamao. Con biotina se puede
realizar el marcaje del Ac primario (tcnica directa) o del Ac secundario (tcnica
indirecta).

Bazo. Representa una inmunorreaccin para vPRRS (virus del sndrome respiratorio y
reproductivo en cerdos) en los macrfagos de la pulpa esplnica. Complejo ABC, contrateido
con hematoxilina. 200X.

32

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

La fase no inmunolgica implica aplicar un complejo de avidina formado por

la avidina y un trazador enzimtico con lugares de unin a ella. De este modo se
puede producir la jacin sobre el Ac secundario biotinilado. 7odo este conjunto
de sustancias se conoce como Ptodo del coPplejo avidinabiotinaA%&. En
resumen, podemos armar que un gran nmero de molculas de biotina pueden
unirse a un Ac dando lugar a una relacin trazadorAc muy alta, lo que hace que
la sensibilidad de este mtodo sea muy elevada.
Puesto que el producto de la inmunotincin con el ABC y PAP es similar y de
similar sensibilidad, algunos autores recomiendan en procedimientos con dobles
tinciones o intensicaciones utilizar el PAP y el ABC de eleccin.
En relacin a la tcnica inPunooro (in metlico en forma coloidal), podemos
decir como tcnica de marcaje, que hace esta funcin gracias a la propiedad de
las partculas de oro para formar, en soluciones salinas, complejos estables con
molculas proteicas. Para conseguir partculas de oro de diferentes tamaos (5
a 20 nm), se manipula el pH de la solucin que lo contiene, aunque ya en el
mercado existen tamaos predeterminados de partculas de oro coloidal si se
mantiene a una temperatura de 4C.
En cuanto a la metodologa del oro coloidal, hay que tener en cuenta su baja
capacidad de penetracin en los tejidos y por tanto pueden enmascarar anticuerpos
al unirse a jadores como glutaraldehdo o tetrxido de osmio. Su aplicacin
ideal es en tejidos poco jados y cortados con crioultramicrotomos. 7ambin da
buen resultado en tejidos frescos o jados y cortados con vibratomo empleando
7ritn x-100 o 7Zin 20 en las soluciones de lavado. Actualmente los problemas
que sufre la muestra por jadores, detergentes y sometimiento a temperaturas
ms altas, se estn disminuyendo con el uso de resinas sintticas hidroflicas que
adems de polimerizar a bajas temperaturas, no requieren oxidantes ni uso de
osmio (provocando menor prdida de antgenos).
En el caso de bajas concentraciones de antgenos, se puede utilizar la plata
que, mediante tcnicas de precipitacin permiten visualizar las partculas de oro.
7ambin otra tcnica ampliamente utilizada, es la asociacin de protenas a las
partculas de oro coloidal. Algunas de estas protenas son: protena A, protena
G, IgG o streptavidinaavidina.
El Parcaje con isytopos radiactivos RIA est basado en una competencia
establecida entre la sustancia a cuanticar y las cantidades conocidas de la misma
sustancia marcada con un istopo, para unirse a anticuerpos especcos. Al
establecerse esta pugna resulta que a mayor cantidad de sustancia a cuanticar,
menor ser la cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo y viceversa.

33

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

Los resultados se obtienen al medir la radiactividad de la hormona marcada

que va unida al anticuerpo y la de la hormona marcada libre. Esto se hace mediante
un contador de centelleo. Al centrifugar, la hormona libre queda en solucin y la
hormona unida al anticuerpo forma agregados que precipitan fcilmente. Una vez
medida la radiactividad se representa una curva con las cantidades de hormona
sin marcar y marcada.
En el RIA directo, a la fase slida se aade una cantidad conocida de
anticuerpo. Diferentes concentraciones conocidas de Ag marcado se incuban
con una concentracin constante de la muestra de la que se desea conocer la
concentracin del antgeno en cuestin. El RIA de inhibicin tambin sera una
tcnica competitiva de anlisis, pero se diferencia en que lo que se une a la fase
slida es una cantidad ja de antgeno (no de anticuerpo). Para este proceso
(inhibicin), se incuba una concentracin ja de anticuerpo marcado frente a una
serie de diluciones de la muestra que contiene el antgeno.
Existe una tcnica no competitiva denominada sandZicK, en la cual se une un
Ac en cantidades constantes a la fase slida. 7ras realizar el bloqueo, se aade el
antgeno en concentraciones variables. Despus se aadir un segundo anticuerpo
contra el antgeno, pero esta vez marcado.
En la actualidad, cada vez es ms frecuente el empleo de inmunoglobulinas
marcadas con istopos radiactivos con la nalidad de aplicarlo en campos
como trazador en determinaciones in vitro de antgenos especcos, tcnicas
inmunoradiohistolgicas y tcnicas de anlisis no competitivo. Estas se tomarn
como alternativa al RIA en aquellos casos en los que algunas molculas no pueden
ser marcadas directamente con radioyodo, en la deteccin de tumores primarios
o metastsicos (inPunoescintografa) e incluso la posibilidad de irradiacin local
de clulas neoplsicas (inPunorradioterapia).
En estos casos citados, se entiende que el anticuerpo podr ser marcado sin
que merme su capacidad inmunoreactiva. El marcaje de protenas o pptidos con
yodo radiactivo (I125 I132) puede realizarse por diferentes mtodos.
2.2 PROCESAMIENTO EN INMUNOHISTOQUMICA
En el siguiente esquema se puede ver un resumen de todo el proceso, que a
continuacin se desarrollar:
7odas las muestras vendrn acompaadas de una hoja identicativa
y explicatoria del contenido de partida, historia y necesidades as como
observaciones si las hubiera. 7ambin debern incluirse controles positivos para
el anticuerpo solicitado.

34

MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

*rica resumen de la tcnica

3reparaciyn de la Puestra: En apartados anteriores est tratado este

punto ya que se habl de cmo preparar la muestra para alterar lo menos
posible la inmunoreactividad. Es por ello que se citarn los pasos dentro
del proceso sin mucho detalle:

Fijaciyn: Cada antgeno, dependiendo de su localizacin histolgica y

anatmica, podr jar un producto de forma distinta.
Descalcicaciyn: Se deca que, habitualmente se utilizaban productos
fuertes con cido ntrico, que hacen poco resistentes a los antgenos.
Por tanto, un procedimiento de eleccin para conservar mejor la

35

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

inmunorreactividad tisular es la utilizacin de ED7A. El ED7A, tambin

llamado cido etilendiaminotetraactico, es una sustancia utilizada como
agente quelante o antagonista de metales pesados, que signica que puede
crear complejos con un metal que tenga una estructura de coordinacin
octadrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro
posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando
hexadentado, y en el ms importante de los ligandos quelatos pues cuanto
ms ligandos posea, ms estable es.
Inclusiyn: El cambio del etanol por acetona y del tolueno o del xileno por
cloroformo o benzoato de metilo mejora notablemente la inmunotincin,
ya que aumenta la tincin especca y disminuye la de fondo.
Cortes y adhesivos: Sobre tejido congelado se obtendrn cortes de 4 a 6
micras que se secan al aire a temperatura ambiente durante 2 horas, se jan
en acetona absoluta a 4C durante 5 minutos, y se vuelven a secar al aire
otros 30 minutos; mientras que para cortes en parana las secciones sern
menos gruesas, entre 2 y 4 micras, y se introducirn en una estufa durante
un mnimo de 20 minutos para que el corte de adhiera al portaobjetos.
Se hablaba de la facilidad de algunos tejidos que se desprenden por los
mltiples lavados que hay que hacer. Cuando se ha realizado digestin
con proteasas o mediante calor an esto se acenta ms, por lo que es
aconsejable utilizar adhesivos que jen las lminas seccionadas (ya
existen portaobjetos especiales que incluyen la pelcula de adhesivo). Con
el n de evitar la difusin de los anticuerpos, se puede utilizar un lpiz con
diamante o rotulador especial para cercar la seccin de tejido.
3revio a la inPunotinciyn.

InPunotexidores autoPticos: Gracias a las nuevas tecnologas, se

dispone de mquinas que llevan a cabo la inmunotincin de manera
automtica. Esta modalidad, permite introducir los portaobjetos con las
secciones de tejido, previamente etiquetados y con cdigos de barras para
su identicacin a travs de un lector, que permitir aplicar sobre cada
muestra el reactivo correcto. El proceso de la tincin automtica es muy
laboriosa por la exactitud del trabajo sobre cada una de las muestras y el
complejo mecanismo electrnico controlado por ordenador que incluye
una fuente trmica propia para el desenmascaramiento antignico y que
supone un gran avance por la reduccin de errores durante la realizacin de
la tcnica (no se acortan ni se exceden tiempos, temperaturas, cantidades
de reactivos, etc.). El siguiente paso tras la nalizacin de la tincin
automtica es la deshidratacin de las muestras y proceder al montaje de
los portaobjetos.
.its universales de inPunohistoTuPica: Se denomina al conjunto de
reactivos utilizados en el proceso de inmunotincin. Hay kits para revelar

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MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

Ac mono o policlonales y se utilizan de forma distinta en funcin al

procedimiento que vaya a utilizarse. Hay muchos laboratorios que estn
utilizando el multilink (kit universal) cuya aplicacin es indistinta a los Ac
empleados.
El 5 de los kits empleados son los de estreptavidina-biotina-peroxidasa
o fosfatasa alcalina. Los kits PAP se estn usando menos por la baja
intensidad de la tincin y se estn sustituyendo por los FAAFA (fosfatasaantifosfatasa-alcalina) que no cuenta con este hndicap, siendo adems
muy til para la tincin de Ag de lbil expresin.
La gama de cromgenos para el revelado en inmunotincin es muy amplia.
3enetraciyn de los reactivos. Detergentes: Los detergentes se utilizan
para aumentar la permeabilidad de las membranas y que as los Ac
puedan penetrar y as alcancen a los Ag a detectar. Estas sustancias son
particularmente rentables cuando se trabaja con clulas intactas de frotis,
improntas y monocapas de cultivos celulares o con cortes gruesos en
congelacin o incluidos en parana. Se habr de tener muy en cuenta de qu
forma pueden incidir estos productos en el tejido a nivel inmunoreactivo.
%loTueo de la tinciyn de fondo: La tincin de fondo se trata de uno
de los principales problemas de la tcnica inmunohistoqumica. Se dene
como toda tincin que aparece all donde no debera haberla. Existen dos
tipos de tincin de fondo:
 Especcas: Se pueden deber: 1) A la presencia del Ag bajo estudio,
en lugares distintos a donde se quiere detectar; 2) por la existencia
en el antisuero primario de Ac frente a Ag distintos al que se quiere
determinar (problema prcticamente inexistente cuando se utilizan Ac
policlonales de buena calidad o Ac monoclonales). 3) 7ambin por
atrapamiento pasivo del Ag o difusin del mismo hacia lugares donde
habitualmente no se encuentra. Estos errores ocurren normalmente
por problemas con la jacin (se retrasa o es inadecuada), o cuando
existen reas extensas de necrosis e inltrado inamatorio.
 Inespeccas: La forma de tincin de fondo inespecca ms comn
es la uniyn no inPunolygica del Ac con ciertos componentes de los
tejidos debido a fuerzas hidrofbicas y electroestticas. Habitualmente
es el Ac primario el que proporciona los niveles ms altos de tincin
de fondo inespecca.
El bloqueo de tincin de fondo se realiza incubando los cortes con un
anticuerpo que no interera con el Ac primario o usando el Ac primario a
altas diluciones lo ms altas posibles y aadiendo bloqueantes proteicos
de la tincin a utilizar. 7odo ello con el objetivo de inhibir la unin no
inmune a molculas que poseen los Ac.

37

Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

%loTueo de la actividad enziPtica endygena: Se trata de un mtodo por

el que se consigue inhibir la actividad enzimtica de la enzima que se va a
utilizar como marcador con el n de que no reaccione con el sustrato por
anidad (muchas de ellas se encuentran de forma endgena en los tejidos).
Si no se bloquea esta actividad, se inducira a error por la obtencin de
falsos positivos.
El mtodo ms usado para este bloqueo es la incubacin de las secciones
antes del proceso inmunolgico, aplicando algn agente bloqueante
especco en cada caso.
DesenPascaraPiento antignico o recuperaciyn antignica: Los
tejidos llegan casi todos al laboratorio jados en formalina e incluidos
en parana. Las estructuras tridimensionales de las protenas tisulares
se alteran en grado variable durante este proceso. Algunos antgenos
tisulares (eptopes) son resistentes a la jacin con formol e inclusin en
parana y son reconocidos por anticuerpos especcos. Otros eptopes
pierden su reactividad antignica despus de estos procesos de rutina.
La continua prctica con anticuerpos nuevos ha mejorado el proceso
inmunohistoqumico y el uso de pretratamientos proteolticos (que suelen
dejar un fondo de tincin mayor y favorecen el desprendimiento del tejido)
consiguiendo una mejor conservacin de la capacidad inmunoreactiva.
An as, el xito mayor de resultados se ha obtenido con mtodos de
pretratamiento con calentamiento de los cortes histolgicos (incubacin
en torno a los 100C) que desenmascaran los eptopes, mejorando
ostensiblemente los resultados del proceso. Como se ha mencionado,
la jacin en soluciones que contengan formaldehdo pueden causar
reacciones cruzadas en las protenas y la inclusin en parana alterar
la forma de las protenas. Es por ello que en el proceso de recuperacin
antignica se revierten algunos de estos problemas, rompiendo las uniones
cruzadas, restaurando la conformacin de eptopeantgeno y removiendo
los iones clsicos con citrato.
Los buffer (o tampones) para la recuperacin antignica, por su composicin
y pH son utilizados en los mtodos de recuperacin antignica junto con
mtodos de calor siendo cruciales para obtener buenos resultados (buffer
citrato 0.01 molL con pH 6.0 y buffer trisED7A, pH 9.0).
A continuacin se describirn los Ptodos de recuperaciyn antignica:
- Digestiyn enziPtica: El pretratamiento de los cortes histolgicos
jados en formalina e incluidos en parana con distintas enzimas
proteolticas refuerza o mejora la reactividad inmunohistoqumica de
ciertos antgenos. Los procesos varan de acuerdo a los laboratorios, la

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MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

jacin de los tejidos, el tipo de anticuerpo y los antgenos estudiados.

Algunos de los pretratamientos enzimticos ms utilizados son el
de tripsina, pronasa, y pepsina. En estos procedimientos las lminas
tendrn que estar pretratadas con adhesivos y los cortes desparanados y
rehidratados.

Mtodo de pretratamiento con tripsina

Cubrir los cortes con solucin de trabajo de tripsina.
Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados
C por 20-40 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la
jacin en formol y el antgeno en estudio. Recomendamos tripsina al
0.1 durante 30-40 minutos a temperatura ambiente.
Detener la reaccin lavando con agua destilada.
Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada
Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

Mtodo de pretratamiento con pronasa

Cubrir los cortes con solucin de trabajo de pronasa.
Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados
C por 5-10 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la
jacin en formol y el antgeno en estudio.
Recomendamos pronasa, 0.01  durante 5-10 minutos a temperatura
ambiente.
Detener la reaccin lavando con agua destilada.
Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada
Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.
- +orno de Picroondas: Se utiliza un horno de microondas domstico de
750-00 Zatios con plato giratorio. Hay que utilizar coplins o gradillas
de cristal o plstico para microondas as como lminas pre-tratadas con
adhesivo. Antes de comenzar hay que desparanar y rehidratar los cortes.

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Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

Mtodo de pretratamiento con pepsina

Cubrir los cortes con solucin de trabajo de pepsina precalentada
a 37C
Incubar en cmara hmeda a temperatura ambiente o a 37 Grados
C por 10-30 minutos. La incubacin ptima depende del tiempo de la
jacin en formol y el antgeno en estudio.
Detener la reaccin lavando con agua destilada.
Bloquear peroxidasa endgena y colocar los cortes en agua destilada
Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

Mtodo de horno de microondas

Coloque las lminas en la gradilla y rellene los espacios vacos con
lminas en blanco.
Llene el recipiente contenedor con 200 mL de buffer de recuperacin
antignica e introduzca la gradilla con las lminas. Cubra el contenedor
para minimizar la evaporacin.
Coloque el contenedor en el centro del horno. Caliente los cortes
a 2x7 minutos. Rellene el contenedor con 50 mL de agua destilada
entre los dos tratamientos. Los cortes no se pueden secar durante el
proceder.
Despus del segundo tratamiento retire el contenedor del horno y
mantenga los cortes en el buffer a temperatura ambiente durante 1520 minutos para su enfriamiento.
Lavar en agua destilada.
Bloquee la peroxidasa endgena y coloque las lminas en agua
destilada.
Enjuagar en 7BS o PBS.
Contine con la tcnica de inmunohistoqumica.

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MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

Mtodo de calentamiento con vapor

Llene el depsito de la base con agua destilada a temperatura
ambiente.
Coloque la rejilla de la base
Coloque la cmara vaporizadora sobre la rejilla
Llene el contenedor de incubacin con 200 mL del buffer de
recuperacin antignica
Coloque la tapa de la cmara de vaporizar.
Ponga el timer por 75 minutos. El equilibrio entre el bao y la
cmara de incubacin a 95C toma unos 45 minutos
Remueva la tapa de la cmara y coloque las lminas en el buffer ya
precalentado. Vuelva a cubrir la cmara
Incube durante 20-40 minutos
Retire de la cmara vaporizadora el contenedor del buffer y las
laminas
Enfriar las laminas por 20 minutos a temperatura ambiente
Enjuague en agua destilada
Bloquear peroxidasa endgena y colocar las laminas en agua
destilada
Enjuagar en 7BS o PBS
Continuar con la tcnica de inmunohistoqumica.

- 2lla a presiyn: Se requiere un vaporizador (steamer) domstico y las

lminas han de estar pre-tratadas con silano u otro adhesivo.
/a inPunotinciyn propiaPente dicha

Diluciones de los anticuerpos lavados e incubaciones: Cuando se

diluye por primera vez un Ac o, aunque sea conocido, si se usa por primera
vez sobre un tejido problema, hay que hacer pruebas de ensayo para evitar
errores posteriores como falsos negativos o tincin de fondo.
Por eso hay que elegir la dilucin correcta a n de obtener una tincin
ptima. El objetivo ir encaminado a evitar que el diluyente no se evapore
durante el proceso de incubacin y que el anticuerpo no unido al antgeno
se elimine por completo antes de la incubacin siguiente. Respecto a la

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Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

evaporacin de diluyente, se evita incubando el tejido en un ambiente

hmedo (cmaras de incubacin). La aplicacin de calor tambin va
a inuir en la unin Ac-Ag, as que si la incubacin es corta se hace a
temperatura ambiente y si es larga se hace a temperaturas constantes de
unos 4C.
Para eliminar el antisuero no unido, se utilizan soluciones tamponadas
(usualmente el 7BS). Primero se lavan las secciones de tejido para extraer
el exceso de antisuero y despus se cubre con el tampn elegido para
enjuagarlas.
Coloraciones de contraste: A n de reconocer mejor los tejidos se
emplean coloraciones (cromgenos) para diferir las reas tisulares
inmunoteidas de las que no lo han sido. En el apartado de tinciones
generales estn descritas.
Controles: Los controles se realizan para asegurarse que no hayan

falsos negativos o positivos.

Una tincin inmunohistoqumica especca se dene con los siguientes

parPetros:
1. No hay tincin si se excluye el Ac primario.
2. Se inhibe la tincin si se absorbe el anticuerpo primario con el
antgeno frente al cual se ha obtenido, pero no con otros.
Es por todo esto que para la obtencin de un buen desarrollo de la tcnica hay
que realizar controles distintos que se explican a continuacin:
- Los negativos incluyen una omisin del Ac primario o la sustitucin
del mismo por suero no inmune o solucin isotpica. Estas sustancias
alternativas (no inmunes) no van a reconocer al Ag a estudiar, pero s
sern reconocidas por el Ac secundario o puente. Se utiliza el mismo
tejido que para el control positivo y si el resultado es positivo ser debido
a una jacin inespecca.
- Los controles positivos, se llevan a cabo utilizando una seccin de tejido
que incluya el Ag a demostrar de forma que si el resultado es negativo la
causa es un defecto de jacin o un error en el procedimiento. Es el de uso
ms extendido y se utiliza en todas las preparaciones.
- El control de absorciyn consiste en demostrar que desaparece la
inmunorreactividad una vez el Ac primario con el Ag se hallan unido. Se
utiliza para valorar nuevos Ac. No es una tcnica de control que se haga
muy rutinariamente.

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MDULO 7: TCNICAS DE INMUNOHISTOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

Por ltimo la tcnica de bloTueo consiste en inhibir la unin de los distintos

elementos utilizados segn si la tcnica es directa (Ac primario con Ac conjugado)
o indirecta (Ac puente con el complejo PAP por ejemplo). El bloqueo se consigue
realizando una incubacin extra con Ac del mismo tipo de los marcados.
Volviendo al objetivo principal de los controles para detectar falsos negativos
o positivos, las causas de los falsos negativos pueden ser:
- Enmascaramiento de los antgenos.
- Desnaturalizacin de los antgenos por el calor, haciendo que sean
irreconocibles por los Ac.
- Errores en el procedimiento tcnico.
Y las de los de falsos positivos:
- Presencia de peroxidasa endgena, por una mala inhibicin de la misma
(incorrecto desbloqueo enzimtico).
- Reacciones cruzadas inespeccas entre Ag y Ac, de forma que algunos
Ac pueden reaccionar con Ag parecidos a los que se estudian y, sobre
todo, la posibilidad de una jacin qumica no inmune entre los Ac y la
colgena del tejido conectivo.
2.3 APLICACIONES DE LA HISTOQUMICA
No cabe duda que la posibilidad que ofrece esta tcnica de localizar componentes
tisulares in situ, contribuye a un importante avance en el conocimiento
siopatolgico siendo especialmente til en el campo de la oncologa (para la
clasicacin de algunas neoplasias con alto grado de anaplasia o de metstasis
de origen incierto). 7ambin se utiliza para el estudio del rechazo de trasplantes
de rganos, enfermedades autoinmunes y alrgicas.
El espectro de anticuerpos utilizados hoy da (comercializados), van en
crecimiento. Aqu podemos ver algunos:

Anticuerpo
CD1a
CD4
CD8
CD30
CD45

Ejemplos de marcadoresinm nohistoqumicos

Clulas/antgenos detectados
Clula de Langerhans
Linfocito 7 de auxilio
Linfocito 7 citotxico
Clula de Reed-Sternberg
Leucocitos

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Aspectos tcnicos de la inmunohistoqumica

CD68
S100
HMB-45
AE1
AE3
DESMINA
GFAP
CEA
AFP
REN
VIM

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Macrfagos
Clulas de SchZann
Melanocitos
Citoqueratinas de bajo peso molecular
Citoqueratinas de alto peso molecular
Clulas musculares
Gla
Antgeno carcino-embrionario
Alfa-fetoprotena
Receptores nucleares de estrgenos
Sarcomas