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1. NDICE..
2. MARCO TERICO.
3. OBJETIVO E HIPTESIS....
4. MATERIALES Y MTODOS
5. RESULTADOS..
6. DISCUCIN
7. GLSARIO
8. BIBLIOGRAFA..
INTRODUCCIN
La leptospirosis es una enfermedad causada por la bacteria Leptospira
interrogans, la cual ha afectado a individuos de diferentes especies, entre ellas, a
los bovinos.
En este proyecto se presentar un anlisis minucioso sobre la respuesta inmune
que genera la vacuna polivalente, leptos 10, para bovino experimentando en
conejos. Mediante una evaluacin serolgica se mostrar la cantidad de
anticuerpos producida por la bacterina.
A travs de la ejecucin de diversos pasos, tales como la conservacin de los
conejos en condiciones adecuadas, la inoculacin, y finalmente el sangrado, se
permitir observar el progreso de la respuesta inmune ya mencionada.
De esta manera se obtendr informacin que le brinde a la poblacin herramientas
para reconocer y combatir la leptospirosis en el ganado bovino y as, poder evitar
prdidas econmicas.
Por otro lado, tambin se busca provocar cierto inters para iniciar nuevas
investigaciones con las que se pueda lograr un avance cientfico.
MARCO TEORICO
La leptospirosis procede del griego lepto (fino) y spira (espiral), se define como
una zoonosis ocasionada por una bacteria helicoidal aerobia Leptospira
interrogans, perteneciente al gnero Leptospira descubierta por A. Weil en 1886.
Son bacterias delgadas y mviles gracias a un mecanismo flagelar que presentan
contenido en una envoltura externa, su forma delgada hace que generalmente se
visualicen fcilmente al microscopio con iluminacin oscura y en preparaciones
lquidas, a diferencia de las otras bacterias. As tambin muestran una longitud de
10 a 20 micras y se manifiestan enganchadas por los extremos. Giran
constantemente en el eje de su axis por lo que sus extremos en gancho parecen
lazos, a excepcin de algunas formas virulentas que son completamente rectas.
Bajo ciertas condiciones nutricionales, las leptospiras pueden ser extremadamente
largas y pueden perder la caracterstica de dividirse, por lo que crean cadenas
largas con conexiones flexibles.
Se diferencian por su composicin diversa de cidos nuclecos y otros
componentes qumicos, as como los nutrientes que metabolizan y el hbitat
natural donde se desarrollan. Abordando de manera especfica su composicin
qumica, existen la idea de que todas las leptospiras son iguales excepto por sus
serovares antignicos especficos pero se contrapone al hecho de que presentan
diversas composiciones nuclecas y qumicas.
Todas son susceptibles a las influencias ambientales que se presenten as como a
los medios donde se desarrollan, por mencionar que la mayora no completa su
crecimiento y crece de manera lenta o pierden su movilidad y algunas tienen un
desarrollo nulo si se presentan superficialmente en colonias en un medio denso
slido. A su vez, en este medio es cuando se fijan confiables caractersticas
serolgicas y se aborda la superposicin de constitucin antgena, por eso es que
gracias a los anlisis de gentica molecular se sabe que las leptospiras pueden
adquirir informacin gentica por sistemas fagocticos en un tipo tipo de leptospira
con plsmido largo.
Los factores que determinan la supervivencia de la espiroqueta dependen de las
condiciones del agua y suelo; el factor que rige la persistencia del microorganismo
es la humedad, as como temperatura templada (25 C), un pH neutro (de 6 a 8) y
presencia de materia orgnica. Con estos elementos propicios, la bacteria tiene un
periodo de vida de 15 das en receptculos de agua.
disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza por un valor constante del nmero
de bacterias a medida que la tasa de crecimiento de las bacterias se iguala con la
tasa de muerte bacteriana.
D) Periodo de declinacin: las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.
En condiciones de laboratorio la leptospira comienza a crecer exponencialmente
en unas 6-8 horas, en condiciones in vivo con un hospedador se reporta la misma
tasa de crecimiento, siempre que se cuenten con los nutrientes necesarios, la
leptospira alcanza su periodo de meseta alrededor de 4-7 das en laboratorio,
dentro de un hospedador puede variar pero es mucho ms lento, debido al
sistema inmunolgico del hospedador en cuestin y diferentes variables de las
cuales no se puede tener control como en el laboratorio, dichas variables
perjudican al crecimiento de la leptospira haciendo que la tasa de meseta se
alcance hasta que la infeccin este muy avanzada dentro del husped y esto
puede tardar semanas, incluso meses.
Los brotes de leptospira suelen ser facilitados por desastres naturales tales como
inundaciones y huracanes, por lo que se puede entender que en los pases con
alta actividad agrcola y ganadera, abundancia de naturaleza y animales
reservorios, no existen medidas de control ambiental ya que la supervivencia de la
bacteria es a largo plazo y resulta en epidemias de alto ndice de mortalidad.
La poblacin de mantenimiento de la leptospira reside en una o varias especies de
fauna silvestre que actan como reservorio contino de un serovar, destacando a
los roedores, quienes actan como portadores; la bacteria persiste en sus tbulos
renales sin evidencia de enfermedad y es excretada por medio de la orina;
teniendo las condiciones adecuadas puede contaminar el ambiente.
La leptospira se clasifica segn el estado de serovar, un serotipo o serovar es una
forma de clasificar los tipos de antgenos que se encuentran presentes en la
membrana celular del microorganismo patgeno tomando en cuenta que
provienen de la misma especie, dando diferentes respuestas inmunolgicas
dependiendo del antgeno.
En el caso de la leptospira se han identificado ms de 200 serovares patgenos, el
modo frecuente de transmisin y de inters en bovinos es el caso de
serovariedades adaptados. La amplia gama que se tienen de serotipos y
serovariedades se debe principalmente a la capacidad que tienen los
microorganismos, como las bacterias, de mutar o de usar su plsmido para
codificar alguna protena especfica que les sirva para crear una resistencia
cuando se encuentran bajo un estrs qumico o fsico.
3 conejos estriles.
12 jeringas.
Algodn.
Alcohol.
Suspensin inyectable de bacterina comercial que incluye los siguientes
serovares: L. hardjo, L. botavie, L. cancula, L. icterohaemorrhagie, L.
tarassovi, L. wolffi, L. ballum, L. grippotyphosa, L. sejroe, L. ponoma.
6 tubos de ensaye.
Aserrn.
Alimento para conejo de la marca purina.
Agua.
Bata
Cubre bocas
Guantes
Xilol
Trapo
Bolsas para desechos biolgicos
(Titulacin)
microscopio ptico
asa bacteriolgica
porta objetos
diluyente PBS
micropipeta de 12 canales
campana de flujo laminal
vial
pluma
masking tape
tubo de ensaye
mechero
solucin PBS(Buffer)
Cajas multiporos rotuldas
(Centrifugacin)
Muestras a centrifugar
Centrfuga
Camisas
Jerigna con agua
MTODOS
Se debe conservar a los conejos en una zona aislada y en condiciones de
limpieza, alimentacin y observacin durante el periodo de 48 das, para as
evaluar correctamente la bacterina que ser aplicada durante el periodo ya
mencionado, con lo cual se busca valorar la respuesta inmune que presentan los
conejos al ser inoculados con dichas bacterina, finalizando con un sangrado total.
Jueves 15 de octubre de 2015
Primera inoculacin: se carga al conejo por la base del cuello tomando solo la piel
y con la otra mano sosteniendo su cadera, se traslada
al cuarto de
procedimientos para aplicarle la primera dosis de la bacterina, esta se debe aplicar
de la siguiente manera:
Se utiliza una turunda para esterilizar el rea a manipular, se introduce la
aguja a 45 con el bisel orientado hacia arriba, se espera que con esto el
contenido sea distribuido completamente, teniendo en cuenta que es una
inyeccin subdrmica. Se retira la aguja y se toman las medidas de
seguridad correspondientes.
Posteriormente se traslada al conejo a su jaula cuidadosamente. Y queda en
observacin durante 15 das.
Jueves 29 de octubre de 2015
Se toma la primera muestra de sangre con el objetivo de evaluar la respuesta
inmune, esta se debe realizar de la siguiente manera:
Se traslada a los conejos al cuarto de procedimientos uno por uno
posteriormente se sujetan con un trapo de tal manera que queden
inmovilizados haciendo un amarre en el cuello y cubriendolos con la parte
distal del trapo asemejando una envoltura, exhibiendo slo la cabeza para
as tomar la muestra de sangre de una de sus orejas, preferentemente la
oreja izquierda. En la oreja seleccionada se esteriliza el rea a manipular
con una torunda con alcohol y un vasodilatador llamado xilol.
Para obtener dicha muestra se extrae una pequea cantidad de sangre de
la vena central auricular, ya obtenida la muestra se retira la aguja con la que
se pinch y se deposita la sangre en un tubo de ensaye con un goteo
continuo sobre la pared del tubo y al finalizar el vaciado se sella con un
tapn de hule.
En la oreja manipulada del conejo se presiona con una torunda seca
esperando a que pare el sangrado, se aplica vaselina para evitar
resequedad en la oreja.
Para finalizar se regresan los conejos a sus respectivas jaulas. Este
procedimiento se realiza con los tres conejos.
Terminada la manipulacin se da un periodo de 15 das
recuperacin a los animales.
la placa, debe haber el mismo peso de cada lado del ecuador, para balancear la
lmina, ya que al girar a una velocidad tan alta de no estar completamente
balanceado el equipo puede daarse ,el proceso no dar resultados certeros ya
que la separacin no se llevar a cabo corretamente o pueden romperse los tubos
que contienen las muestras dentro de las camisas.
Para este proceso se debe tener las muestras previamente separada (proceso
descrito previamente)
El proceso de centrifugado se llevo en 3 partes principalemente como se describe
a continuacin:
1) Se colocan los tubos de ensaye, que continen el cogulo, dentro de las
camisas, estructuras cilndricas de metal, y se contraponen en una vscula
previamente calibrada. Con la jerigna llena de agua se taran las camisas
hasta lograr un equilibrio en la vscula.
2) Se colocan las camisas ya taradas, y con la muestra, dentro de los
fenestres de la placa interna del equipo, despus se cierra la tapa superior
y se programa para girar a 1800 revoluciones/min durante 15 a 20 minutos,
este tiempo es el recomendado para evitar la lsis de la membrana celular
de los componenetes en la sangre.
3) Se retiran las muestras centrifugadas y se colocan en una gradilla, se
observan diferentes capas, en el fondo un botn rojo que son todos los
eritrocitos, posteriormente una capa blanca que contiene las plaquetas y
lnea blanca, por ltimo una capa transparentosa-amarillenta que contiene
las proteinas, las cuales en este caso son de nuestro inters ya que
contienen el complejo antgeno-anticuerpo creado por la bacterina y los
anticuerpos del conejo. Se debe extraer con una pipeta este contenido,
para despus purificarlo y quedarnos con nuestras protenas de inters.
Se deja en refrigeracin durante el tiempo pertinente para poder realizar la primera
titulacin, en nuestro caso se dej en refrigeracin 17 das
Mircoles 18 de noviembre de 2015
Se toma la segunda muestra de sangre con el objetivo de comparar la evaluacin
de la respuesta inmune con la primer titulacin, esta se debe realizar de la misma
manera que el sangrado anterior.
Se lleva al laboratorio de leptospira y de igual manera se deja encubar por 30 min,
se mantiene en refrigeracin para posteriormente pasar a centrifugarlo.
Jueves 19 de noviembre de 2015
Pozo 2
50 ml
Pozo 3
50 ml
Pozo 4
50 l
Mircoles 25 de noviembre
Titulacin (segundo sangrado): se realiza el mismo procedimiento que el del titulo
anterior.
Objetivo
Conocer y analizar la respuesta inmune por la aplicacin de una bacterina
comercial.
Hiptesis
Mediante la aplicacin de dos dosis de una vacuna se aumentar gradualmente el
volumen de anticuerpos.
Si se consigue un aumento de anticuerpos especficos en el torrente sanguneo
entonces se comprobarn los principios de la respuesta inmunitaria, lo cual,
demostrar la efectividad de la vacuna.
Justificacin
La leptospirosis bovina es una enfermedad de distribucin mundial que repercute
en prdidas econmicas ganaderas, para prevenir esto se brinda importancia a la
vacunacin y el proceso fundamental de generar una memoria inmunitaria antes
de que la enfermedad se genere.