BIOLOGA CELULAR Y GENTICA

Gua de trabajos
prcticos

ndice:
PGINAS

Introduccin a la microscopia
El microscopio compuesto
Sistema mecnico
Sistema ptico
Sistema lumnico

03
03
05
05
06

Uso del microscopio

Iluminacin de Khler
Cuidados, limpieza y mantencin del microscopio
Conceptos bsicos en microscopia

07
08
09
10

Paso prctico I

13

Paso prctico II

15

Observacin bsica de tejidos

Extraccin de tejidos
Fijacin de tejidos
Procesamiento de tejidos
Inclusin de tejidos
Seccin o corte
Montaje y tincin
Observacin de tejido intestinal
Observacin de tejido heptico

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Introduccin a la microscopa
Los microscopios son instrumentos pticos especializados, diseados para producir la magnificacin visual o
fotogrfica (incluidos los digitales) de objetos demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. Este grupo de
instrumentos no incluye slo a los microscopios compuestos (varios lentes) diseados con objetivos y
condensadores, sino que tambin a instrumentos muy simples de un solo lente, como una lupa o lente de
aumento.
El microscopio ptico, a menudo referido como el "microscopio de luz", es un tipo de microscopio que utiliza la
luz visible y un sistema de lentes para ampliar las imgenes de muestras pequeas. Los microscopios pticos
son el diseo ms antiguo de microscopio. Los microscopios pticos bsicos pueden ser muy simples, aunque
hay muchos diseos complejos que tienen como objetivo mejorar la resolucin y el contraste de la muestra.
Hay dos configuraciones bsicas del microscopio ptico convencional: el microscopio simple y el microscopio
compuesto. La gran mayora de los microscopios de investigacin modernos son microscopios compuestos,
mientras que algunos microscopios digitales comerciales ms baratos son simples microscopios de lente nica.

Microscopio compuesto
Este tipo de microscopia es la ms utilizada en el diagnstico de laboratorio, abarcando reas tan diversas como
la Microbiologa, Parasitologa, Hematologa, Bioqumica Clnica y Citologa.
Un microscopio compuesto es un microscopio que utiliza una lente cerca del objeto que se est viendo para
recoger la luz (llamada la lente del objetivo), generando una imagen real del objeto, en el interior del
microscopio. Esa imagen es luego amplificada por una segunda lente o grupo de lentes (llamado el ocular) que
da al espectador una imagen: virtual, ampliada e invertida del objeto. El uso de una combinacin compuesta
objetivo/ocular permite un mucho mayor aumento, menor aberracin cromtica y lentes de objetivo
intercambiables para ajustar el aumento. Un microscopio compuesto tambin permite configuraciones de
iluminacin ms avanzadas, como contraste de fase.
Plano del
ojo

Aumento con
varios lentes
(Microscopio
compuesto)

Ocular

Plano intermedio de
la imagen
25 cm
Objetivo
Espcimen
Condensador

Fuente de
luz
Imagen
virtual

El microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los
instrumentos a observar.
El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos, dispuestos de tal manera que producen
las ranuras de luz.
El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se
pretenden observar mediante lentes.
Sistema mecnico:

Sistema de iluminacin:

-Brazo
-Can
-Pie
-Platina
-Macro y micromtrico.
-Cabezal
-Desplazador de la platina.
-Sostenedor de espcimen (pinza)
-Revolver.
-Ajuste interpupilar.

Sistema ptico:

-Oculares
-Objetivos

-Fuente de luz (variados tipos)

-Condensador (para diferentes funciones)
-Diafragma
-Lente de campo
-On/Off
-Dimer o Potencimetro.
-Lente Colector.

Sistema mecnico
Brazo: Es la columna vertebral del microscopio, encargado de dar sostn tanto a la parte ptica como al
suministro de luz.
Pie o base: Es la parte encargada de mantener el microscopio en posicin vertical.
Can o tubo: si bien es parte del sistema mecnico su funcin es suministrar la distancia focal que separa al
ocular del objetivo.
Cabezal: Sostiene los caones y en algunos modelos de microscopio permite la rotacin en sentido horizontal
de los oculares.
Platina: Pieza metlica en donde se deposita la muestra o espcimen, permite adems efectuar el
desplazamiento de esta de derecha a izquierda y de adelante hacia atrs, es decir en los ejes X e Y.
Pinza: Ubicada sobre la platina, es la encargada de mantener la muestra fija.
Tornillo macromtrico: Es el responsable de mover la platina de arriba hacia abajo rpidamente permitiendo
enfocar la muestra de forma brusca, este debe ser utilizado solo para enfocar con el objetivo de menor
aumento.
Tornillo micromtrico: Permite al igual que el macromtrico subir y bajar la platina, con movimientos muy
suaves, lo que facilita el enfoque con los objetivos de mayor amplificacin.
Desplazador de la platina: Esta pieza compuesta por dos tornillos los que se encargar del movimiento de la
platina.
Revolver: Pieza circular en la cual van montados los diferentes objetivos, esta permite ser girada para ir
cambiando la amplificacin del microscopio.
Ajuste interpupilar: Esta es una especie de bisagra que permite separar los dos objetivos en un microscopio
binocular para ajustar la distancia entre las dos pupilas, distancia que va a depender de la fisonoma de cada
individuo, de esta manera podemos ver solo un campo.

Sistema ptico
Oculares: Estos lentes trabajan en combinacin con los objetivos para ampliar la imagen intermedia y de esta
forma poder observar de mejor manera los detalles de esta. Este tipo de lente puede ser de distinto aumento

lo que depender de la utilidad que se le est dando al microscopio, en clnica el aumento ms habitual es el de
10X. Si bien cuando se habla de ocular se hace relacin a un solo lente, en realidad este est compuesto por
varios lentes distintos, adems posee una rueda que permite ajustar las dioptras.

Objetivos: Son tal vez los componentes ms importantes de un microscopio ptico, ya que son los principales
responsables de la formacin de imgenes y desempean un papel central en la determinacin de la calidad de
las imgenes que el microscopio es capaz de producir. Los objetivos juegan tambin un papel decisivo en la
determinacin de la magnificacin de un espcimen en particular y la resolucin bajo la cual el espcimen
muestra la mayor cantidad de detalles.
El objetivo es el componente ms difcil de disear y ensamblar en un microscopio ptico y son el primer
elemento que la luz encuentra despus de atravesar el plano del espcimen. Los objetivos derivan su nombre
dado a la proximidad que tienen con el objeto a estudiar (objetivo).
Siempre encontraremos ms de un objetivo en el microscopio ptico, estos habitualmente son cuatro
diferentes, esta diferencia radica en la magnitud de su amplificacin 4X, 10X, 40X y 100X, este ltimo
objetivo requiere de la adicin de una sustancia conocida como aceite de inmersin para un funcionamiento
adecuado.

Sistema de iluminacin
Fuente de luz: Existen de variados tipos y para diferentes propsitos, bsicamente se trata de una lmpara
capaz de generar un haz lumnico el que puede ser luz visible, luz ultravioleta e incluso un rayo lser.
Condensador: Se trata de una serie de lentes cuyo objetivo es concentrar y/o dirigir el haz de luz
proveniente de la lmpara, existen de diferentes tipos con distintas funciones y caractersticas.

Diafragma: Pieza mecnica que asemeja al iris del ojo su funcin es reducir el campo lumnico y de esa manera
concentrar an ms el haz de luz sobre un punto en particular de la muestra , esto es especialmente til
cuando se utilizan objetivos con aumentos mayores a 10X.
Potencimetro: Tambin conocido como dimer es el encargado de hace llegar ms o menos energa a la
lmpara, haciendo que esta brille con mayor o menor intensidad segn sea la necesidad.
Interruptor: On/Off, es el encargado de encender o apagar la fuente lumnica del microscopio.
Lente colector y lente de campo: la funcin del lente colector es atrapar la mayor cantidad de haz lumnico
proveniente de la fuente de luz, para posteriormente enviarlo al lente de campo este ltimo se encarga de
mantener el haz de luz lo ms uniforme posible, para que de esta forma llegue la mayor cantidad de luz al
condensador.

Uso del microscopio

Primero que todo es importante recordar que en el laboratorio de diagnstico el microscopio es una ms de las
herramientas de trabajo y por lo tanto para que esta entregue los mejores resultados es que deben estar en
perfectas condiciones al igual que cualquiera de los otros equipos con los que trabajemos.
Existen una serie de normas bsicas que se pueden aplicar al uso de cualquier microscopio, con el fin de
mantener en las mejores condiciones posibles el microscopio:
1. Recuerde siempre asegurarse que antes de enchufar el microscopio debe estar apagado y con el
intensificador (dimer) en mnimo.
2. La platina debe estar en la posicin ms baja, para facilitar la colocacin de la muestra.
3. El revlver debe encontrase en el aumento menor (4X), tambin conocido como lupa.
4. Una vez colocada la muestra encender utilizando el interruptor ON/OFF.
5. Utilizar el macromtrico para acercar la muestra al objetivo con movimientos suaves, siempre mirando para
alcanzar el foco. Para obtener una mayor calidad de la imagen es necesario ajustar la apertura del diafragma de
acuerdo a lo estipulado por el fabricante.

6. A continuacin mover el revlver al siguiente aumento en esta ocasin hacemos foco con el micromtrico.
7. Repetimos para el resto de los objetivos.
8. Al terminar de trabajar, llevamos el intensificador (dimer) al mnimo.
9. Ponemos el revlver en el aumento menor y llevamos la platina hasta la parte ms baja.
10. Apagamos el equipo y lo desenchufamos
Siguiendo estas sencillas reglas nos aseguramos en primera instancia de no quemar la ampolleta y en segunda
instancia a no rallar los objetivos.

Iluminacin de Khler
La iluminacin de la muestra es la variable ms importante para lograr imgenes de alta calidad en la
microscopa. La iluminacin Khler fue introducida por primera vez en 1893 por August Khler de la
corporacin Carl Zeiss como un mtodo para proporcionar la iluminacin ptima de la muestra.
Pasos de establecimiento de iluminacin de Khler:
1. Encienda la fuente de luz y mantener una pequea hoja de papel directamente sobre el la fuente de luz. El
propsito de este ejercicio es comprobar si la fuente de luz est funcionando y se proyectar en el microscopio

2. A continuacin, mover la hoja de papel colocndola sobre la platina y abrir completamente el diafragma. A
medida que se abre lentamente el diafragma, la intensidad de la luz proyectada sobre la hoja de papel se
incrementar, logrando su brillo mximo en la configuracin totalmente abierto.

3. Colocar un objeto pequeo sobre la fuente luminosa, este objeto es reflejado en la hoja de papel. Ajustar la
altura del condensador hasta que el reflejo del objeto en la hoja de papel se vea ntido. La altura del
condensador se puede ajustar usando la perilla de accionamiento que permite el movimiento de este de arriba
hacia abajo a lo largo del eje ptico del microscopio. Fijar en la posicin adecuada y no mover.

4. Observar a travs de los oculares del microscopio, si la luz es demasiado brillante (a menudo lo suficiente
brillante para causar malestar) reducir la intensidad moviendo el dimer, hasta encontrar un nivel que sea como
para el trabajo.
5. A continuacin establezca la distancia entre las pupilas a travs del puente plegable de los tubos binoculares.
La distancia correcta se alcanza cuando un solo gran crculo de luz (en lugar de dos) puede ser fcil de visualizar
a travs de los oculares.
Con esta configuracin el microscopio est listo para ser usado.

Cuidados, limpieza y mantencin de microscopios

Otra de las cosas importantes son el almacenaje y la limpieza. En relacin con el almacenaje se recomienda
que cualquier microscopio mientras no se est utilizando quede guardado protegido del polvo. Como se ve en
la siguiente imagen.

El polvo es uno de los principales responsables de una observacin de mala calidad, debido a la refringencia que
este produce.
Tambin deben estar protegidos de la humedad excesiva ya que al poseer componentes elctricos se pude
producir corto circuitos.
En relacin a la limpieza de los componentes, en esta gua solo se entregara instruccin para un
mantenimiento bsico ya que para una limpieza ms profunda se necesitan una serie de elementos de los
cuales se carece en el laboratorio, adems de la capacitacin adecuada.
En relacin al cuidado del ocular, este lente posee una capa de antirreflejo, por lo que no se aconseja limpiarlo
con ningn tipo de solvente como alcohol o isopropanol ya que estos sacan esta capa de antirreflejo, lo que
produce que veamos las imgenes borrosa, esto no tiene solucin ms que comprar otro ocular, entonces se
recomienda limpiar solo con una tolla de papel tis.
Respecto de los objetivos, habitualmente es necesario el uso de aceite de inmersin, este aceite debe ser
quitado inmediatamente despus de su uso (esto se realiza con isopropanol), ya que de lo contrario se
endrese y se pega firmemente al lente lo que dificulta mucho su limpieza, por otra parte al ser un cido graso
con el tiempo va desgastando el vidrio. Es importante revisar adems los otros objetivos (adems del de
inmersin) ya que generalmente los pasamos a ensuciar con este medio, lo que a futuro causa un serio
problema.
El condensador y la platina se pueden limpiar con alcohol o algn lquido multiuso.

Conceptos bsicos en microscopia

Para poder desarrollar un mejor entendimiento de cmo llevar a cabo una buena observacin a travs del
microscopio no basta solo con conocer las partes de este, sino que adems se deben manejar ciertos conceptos
universales para entender el lenguaje en microscopia.
Resolucin: la resolucin de un microscopio ptico se define como la distancia ms pequea entre dos puntos
en una muestra que puede todava distinguirse como dos entidades separadas.
Cuando la luz de los diversos puntos de un espcimen pasa a travs del objetivo y se reconstituye como una
imagen, varios puntos del espcimen aparecen en la imagen como patrones pequeos (no puntos) conocidos
como patrones airoso. Este fenmeno es causado por la difraccin o dispersin de la luz a medida que pasa a
travs de las diminutas partes y espacios en la muestra y la posterior apertura circular del objetivo. El lmite
hasta el cual dos objetos pequeos todava son vistos como entidades separadas se utiliza como una medida de
la potencia de resolucin de un microscopio. La distancia a la que se alcanza este lmite es conocida como la
resolucin efectiva del microscopio y se denota como D0.
Esto quiere decir que mientras ms pequea es la distancia entre dos objetos pequeos que todava son vistos
como entidades separadas, mayor es el poder de resolucin del microscopio.

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a) Mala resolucin.
b) Excelente resolucin.
c) Buena resolucin.

Definicin: Es la capacidad para definir los contornos de la imagen (nitidez).

Buena definicin

Mala definicin

Aumento: Relacin entre el dimetro aparente de la imagen y el dimetro o longitud del espcimen. En un
microscopio de campo claro el aumento total se obtiene multiplicando el valor del ocular por el valor del
objetivo.
Aumento total = Aumento objetivo x Aumento ocular
Campo microscpico: Se define como la porcin del plano visible que depende de la magnitud del aumento.

100X

400X

Finalmente mencionar que este tipo de microscopia es utilizada ampliamente tanto en el diagnstico de
laboratorio como en investigacin cientfica. Sin embargo cabe destacar que su uso ms adecuado es para la
observacin de muestras fijadas y teidas, como son:

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 Cortes histolgicos teidos con Hematoxilina/Eosina.

Frotis sanguneos teidos con Giemsa.
Frotis de otros orgenes, como lquidos pleural, peritoneal etc.
Tincin de Gram en microbiologa.
Es importante dejar claro que si bien este tipo de microscopia puede ser utilizada para hacer observaciones al
fresco, tales como muestras de orina, anlisis del lquido seminal (espermiograma) etc. No se obtienen los
resultados ms ptimos dado la naturaleza de estas muestras (muy translucidas). Aqu cobran importancia las
variaciones en este tipo de microscopia.

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Paso prctico I
Introduccin al uso y mantencin del microscopio
En esta actividad, tendrn la oportunidad de familiarizarse con un microscopio de campo claro. Este tipo de
microscopia es la ms utilizada.
Se les enseara a mantener las distintas partes del microscopio en condiciones ptimas para poder desarrollar
un trabajo ms confiable y de esta manera alargar la vida til del instrumento.
Adems se mostrara la ergonoma con la cual debemos trabajar para no sufrir problemas de salud,
relacionados a prolongadas sesiones de microscopia.
Para esta actividad utilizaran los siguientes materiales:
Microscopio compuesto de campo claro.
Porta objetos.
Cubre objetos.
Toallas de papel tis para la limpieza de los lentes.
Alcohol isopropilico (isopropanol).
Muestras de letras en porta objetos cubiertas con cubreobjetos.
Actividad N1: Identificando las distintas partes del instrumento.
En esta actividad debern identificar todas las partes del microscopio y entregar una pequea explicacin de su
funcin.
No deben tener miedo de estropear el instrumento ya que la nica forma de hacerle algn dao es que este se
caiga del mesn, que se queme la ampolleta a raz de algn problema elctrico o que el proceso de limpieza no
sea el adecuado.
Todos los pasos prcticos se les entregara un ficha tcnica o pre informe el cual debe ser completado
durante la actividad practica y entregado al final de esta. Esta ficha debe ser respondida con bolgrafo (lpiz de
pasta), letra clara, legible y en perfecto orden recuerden que todas las fichas tcnicas son evaluadas.

Para tener en cuenta: Es de suma importancia que todos los alumnos trabajen de forma individual, de lo contrario no
adquirirn las competencias necesarias para aprobar la asignatura.
Deben prestar mucha atencin a las instrucciones que dan los acadmicos, adems de tomar apuntes, ya que esta
informacin ser til para completar la ficha tcnica grupal que se debe entregar al final del practico.

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Actividad N2: Observacin de letras bajo el microscopio.

Conocern el manejo del revlver y de cmo se debe trabajar con los distintos objetivos para ir aumentando
la amplificacin visual del espcimen.
Deben colocar la muestra que posee las letras en la platina, afirmarla con la pinza, todo de tal manera que
puedan leer las letras sin problemas.
Colocar estas letras en el orificio por donde pasa la luz que viene del condensador.
Recuerden que siempre partimos observando con la lupa del microscopio (Objetivo 4X)
Una vez puesta la muestra encender el microscopio, poner los ojos en los oculares y con movimientos suaves
del macromtrico subir la platina hasta que podamos observar las letras de forma clara.
Anotar como se ve la preparacin a travs del microscopio en relacin a como se ve si usamos la vista
desnuda.
En este punto sigan las instrucciones de la ficha tcnica y vayan completndola.
Incrementando la capacidad de aumento.
Una vez que enfocamos la muestra utilizando el objetivo de menor aumento, procedemos sin bajar la platina
a cambiar al objetivo siguiente 10X.
Ahora para enfocar bien solo movemos el tornillo micromtrico lentamente en sentido de las manecillas del
reloj.
Una vez enfocado con este aumento, nuevamente sin bajar la platina, cambiamos al objetivo de 40X y para
lograr un enfoque ptimo movemos suavemente el micromtrico en sentido de las manecillas del reloj.
En esta oportunidad solo haremos observaciones con el objetivo de 40X.
Frente a cualquier duda o inseguridad no duden en consultar a los profesores.
Para tener en cuenta : Si van a utilizar el objetivo de 100X es necesario la aplicacin de aceite de inmersin entre la
muestra y el objetivo. Para ello se coloca el revolver entre el objetivo de 40X y 100X, eso deja el espacio necesario para
colocar sobre la muestra una gota de aceite y posteriormente terminar de girar el revolver para que el objetivo de 100X
quede sobre la muestra.
SI USTED UTILIZA EL OBJETIVO DE 100X SIN ACEITE DE INMERSION PUEDE RAYAR EL LENTE.

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Paso prctico II
Observacin bsica de tejidos animales
Para poder realizar la observacin de tejidos a nivel microscpico deben ser tratados de forma especial para
mantener sus caractersticas morfolgicas y permitir su visualizacin. A este tipo de espcimen se le conoce
como corte histolgico.
La histologa, es el estudio anatmico microscpico de clulas y tejidos de plantas y animales. Comnmente se
observan clulas y tejidos, seccionados y teidos, a travs de un microscopio ptico o electrnico. Sin embargo
los estudios histolgicos tambin pueden ser realizados usando cultivo de tejidos, donde las clulas vivas
pueden ser aisladas y mantenidas en un ambiente adecuado. La capacidad de visualizar o identificar
diferencialmente estructuras microscpicas se mejora a travs del uso de tinciones histolgicas. La histologa
es una herramienta esencial de la biologa y la medicina.
Histopatologa, el estudio microscpico de tejido enfermo, es una herramienta importante en la patologa
anatmica, desde el diagnstico preciso del cncer y otras enfermedades que por lo general requieren la
examinacin histopatolgico de muestras. Mdicos capacitados, con frecuencia certificados como patlogos,
son el personal que realizan el examen histopatolgico y proporcionan informacin de diagnstico sobre la base
de sus observaciones.
El proceso histolgico posee las siguientes etapas:
1. Extraccin.
2. Fijacin.
3. Procesamiento - deshidratacin, aclaramiento, y la infiltracin.
4. Inclusin.
5. Seccin o corte.
6. Montaje y tincin.
Extraccin.
Se pueden obtener tejidos de diferentes especies para trabajar. Para ello se lleva a cabo una ciruga, mediante
la cual se extrae la estructura deseada de la manera ms limpia y delicada para no alterar su morfologa. En
investigacin cientfica se utiliza principalmente tejido proveniente de rata o ratn, debido a la facilidad de
manipulacin.

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Extraccin del hgado de Mus

musculus (ratn)

Fijacin
Fijadores qumicos se utilizan para conservar el tejido de la degradacin y para mantener la estructura de la
clula y de los componentes subcelulares tales como organelos celulares (por ejemplo: ncleo, retculo
endoplsmico, mitocondrias). El fijador ms comn para microscopa de luz es 10% de formalina tamponada
neutra (4 % de formaldehdo en tampn fosfato salino). Para la microscopa electrnica, el fijador ms
comnmente utilizado es el glutaraldehdo, por lo general como una solucin 2,5 % en tampn fosfato salino.
Estos fijadores preservan los tejidos o clulas principalmente por entrecruzamiento irreversiblemente de
protenas. La accin principal de estos fijadores de aldehdo es entrecruzar los grupos amino de las protenas a
travs de la formacin de puentes de metileno (-CH2-), en el caso de formaldehdo, o por un enlace C5H10 en
el caso de glutaraldehdo. Este proceso, al preservar al mismo tiempo la integridad estructural de las clulas y
el tejido puede daar la funcionalidad biolgica de las protenas, en particular enzimas. Esto puede ser
perjudicial para ciertas tcnicas histolgicas. El protocolo es muy sencillo, solo hay que sumergir el tejido en
esta solucin por un periodo de tiempo, el cual va a depender del tamao (volumen) de la muestra.
Fijacin por congelamiento. La congelacin es una forma rpida para fijar y montar cortes histolgicos. Se
utiliza en la extirpacin quirrgica de tumores y permite un rpida determinacin de que el tumor se ha
eliminado completamente. El tejido congelado se corta utilizando un micrtomo, y las rodajas congeladas se
van montando sobre un portaobjetos de vidrio, posteriormente se tie de la misma manera que los otros
mtodos. Es una forma necesaria para fijar el tejido para ciertas tinciones tales como la tincin de
inmunofluorescencia con anticuerpos. Tambin se puede utilizar para determinar si un tumor es maligno
cuando se encuentra incidentalmente durante la ciruga en un paciente.
Procesamiento - deshidratacin, aclaramiento, y la infiltracin
El objetivo del procesamiento de tejidos es eliminar el agua de los tejidos y reemplazar con un medio que se
solidifica para permitir cortar secciones delgadas. El tejido biolgico debe ser apoyado en una matriz dura para
permitir cortar secciones lo suficientemente delgadas, por lo general 5 m (micrmetros; 1.000 micrmetros
= 1 mm) de espesor para sean observados en microscopa de luz y de 80 a 100 nm (nanmetros; 1.000.000

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nanmetros = 1 mm) de espesor para microscopa electrnica. Para la microscopa de luz, la matriz de soporte
ms usada es la cera de parafina, puesto que es inmiscible con agua, el principal constituyente de tejido
biolgico. Por lo tanto el agua debe ser lo primero en retirar en el proceso de deshidratacin. Para ello las
muestras se transfieren a travs de baos de etanol cada vez ms concentrado para eliminar el agua. Esto es
seguido por el tratamiento con un agente de eliminacin hidrfobo, tal como xileno (proceso de aclaramiento),
para eliminar el alcohol, y, finalmente, la cera de parafina fundida, el agente de infiltracin, que sustituye el
xileno. La cera de parafina no proporciona una matriz suficientemente dura para cortar secciones muy
delgadas para microscopa electrnica. En lugar de ello, se utilizan resinas, entre ellas resinas acrlicas.
Inclusin
Despus de que los tejidos han sido deshidratados, aclarados e infiltrados con el material de incrustacin, estn
listos para la inclusin externa. Durante este proceso las muestras de tejido se colocan en moldes junto con
material de incrustacin lquido (tal como agar, gelatina o cera) que posteriormente es endurecido. Esto se
consigue por enfriamiento en el caso de la cera de parafina. Los bloques endurecidos (TACOS) que contienen
las muestras de tejido estn entonces listas para ser seccionados.
Debido a que los tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina (FFPE) pueden guardarse
indefinidamente a temperatura ambiente, y los cidos nucleicos (ADN y ARN ) pueden ser recuperados de
ellos dcadas despus de la fijacin, los tejidos FFPE son un recurso importante para los estudios histricos en
medicina.
La inclusin externa tambin se puede lograr usando tejido congelado, no fijado, usando un medio a base de
agua. Tejidos pre-congelados se colocan en moldes con el material lquido de inclusin, por lo general un glicol
a base de agua, OCT, TBS, Cryogel, o resina, que se congela a continuacin para formar bloques endurecidos .
Seccin o corte.
El tejido ahora incluido se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso
de la luz. El corte se puede realizar de manera limitada. Cortes verticales, perpendiculares a la superficie del
tejido es el mtodo ms habitual. Para realizar estos cortes se utiliza un equipo denominado micrtomo. El
micrtomo en palabras sencillas es como un cortador de embutidos de alta tecnologa, donde el embutido en
este caso es el taco con la muestra de tejido.
En el micrtomo se monta la cuchilla con la cual se va a realizar el corte. Para la microscopa de luz, se utiliza
un cuchillo de acero (gillet) para cortar secciones de tejido de 4 micrmetros de espesor que se montan en un
portaobjetos de vidrio. Para la microscopa electrnica de transmisin, se utiliza un cuchillo de diamante para
cortar secciones de tejido con 50 nanmetros de espesor que se montan sobre una rejilla de cobre de 3
milmetros de dimetro. A continuacin, las secciones montadas se tratan con la tincin apropiada.
El tejido congelado (no fijado) incrustado en un medio de congelacin se corta en un micrtomo con
refrigeracin, llamado criostato. Se debe utilizar slo micrtomo para asegurar el espesor de 1-10 micrmetros.

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Montaje y tincin.
Una vez que se obtienen los cortes es necesario ponerlos en un soporte firme (portaobjeto) que facilite su
manipulacin, adems dada su naturaleza translucida estos deben ser teidos de lo contrario la luz del
microscopio los atraviesa lo que no permite visualizar sus estructuras.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos previamente tratados con una pequea cantidad de Albmina, la cual
acta como adhesivo. En la actualidad existen pegamentos de origen sinttico capaces de generar mucha ms
adhesin que la albmina.
La parafina se elimina del corte haciendo uso de solventes orgnicos como el Xilol, a continuacin la muestra
debe ser rehidrata hacindola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etlico hasta llegar a
una solucin 100% de agua.
Ya rehidratado el tejido y montado sobre el portaobjeto se debe teir. Los colorantes ms utilizados son la
HEMATOXILINA y la EOSINA. Una vez teido, se deshidrata nuevamente, para fijar de modo permanente la
tincin. Finalmente se usa un CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el montaje (por ejemplo una
gota de Blsamo de Canad o similar).
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:
Colorantes que diferencian los componentes cidos y bsicos de la clula (ejemplo hematoxilina y la eosina).
Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular.
Sales metlicas que se precipitan en los tejidos y forman depsitos de metales con ellos.
Observacin de tejidos animales.
Se realizara la observacin de cortes histolgicos de hgado de ratn e intestino de ratn.
Se determinara el tamao aproximado de alguna de las estructuras que constituyen tanto el hgado como el
intestino (estas sern seleccionadas por el profesor el mismo da del paso prctico).
Los estudiantes debern hacer un dibujo esquemtico de las estructuras medidas.
Para esta actividad utilizaran los siguientes materiales:

Microscopio compuesto de campo claro.

Corte histolgico de hgado de ratn.
Corte histolgico de intestino de ratn.
Alcohol Isopropilico (isopropanol).
Papel tis para la limpieza de los microscopios.

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Actividad N1: Observacin del corte histolgico de intestino.

Coloque la preparacin de intestino en la platina y comience a observar desde el objetivo de menor aumento
(Lupa).
Identifique pliegue del intestino, vellosidades intestinales y microvellosidades.
Haga un dibujo esquemtico de las estructuras que los profesores le indiquen y con el aumento total
solicitado.
Todo dibujo debe ser realizado con lpices de colores.

Corte transversal de intestino de Ratn

Vellosidad
intestinal

Lumen

Vellosidad intestinal aumentada 400X

Borde en cepillo
(Microvellosidades)
V.I
Enterocito

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Vellosidad intestinal aumentada 1000X

Microvellosidades

Enterocito

Actividad N2: Observacin del corte histolgico de hgado.

Coloque la preparacin de hgado en la platina y comience a observar desde el objetivo de menor aumento
(Lupa).
Identifique lobulillo heptico, la vena central y la triada portal o triada Heptica.
Haga un dibujo esquemtico de las estructuras que los profesores le indiquen y con el aumento total
solicitado.
Todo dibujo debe ser realizado con lpices de colores.

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Vena Central
Lobulillo Heptico

Triada
Heptica

Canalculo biliar

Vena
Arteria

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